Изотопные эффекты в ферментативных реакциях

Максимальная скорость большинства ферментативных реакций включает константу скорости, отражающую изменения ковалентных связей, так что соответствующий изотопный эффект можно интерпретировать непосредственно-в терминах механизма реакции. Отсутствие изотопного эффекта в реакции переноса водорода может быть вызвано одной из причин, обусловливающих малые изотопные эффекты, как это было описано выше для химических реакций, или может быть связано с тем, что скорость определяющей стадией реакции [c.217]

Дейтериевый (или тритиевый) изотопный эффект, возникающий из-за различия нулевых уровней энергии ва [ентных колебаний связей с водородом и дейтерием, наиболее часто используют как свидетельство существования или отсутствия процесса переноса протона в скорость определяющей стадии. Совершенно очевидно, что исследование дейтериевого изотопного эффекта чрезвычайно полезно в диагностике механизма реакции, но детальная интерпретация таких эффектов сложнее, чем обычно полагают, и должна проводиться с осторожностью. Изотопные эффекты с более тяжелыми атомами, чем водород, менее изучены, так как вследствие малого различия в массах эти эффекты невелики, однако и они открывают большие возможности для исследования механизмов как химических, так и ферментативных реакций, хотя и не поддаются такой детальной количественной интерпретации. Так, начальный изотопный состав двуокиси углерода, которая выделяется в катализируемой ионами магния реакции декарбоксилирования оксалоацетата, соответствует изотопному эффекту С/ С = 1,06, но в реакции декарбоксилирования этого соединения, катализируемого ферментом, заметного изотопного эффекта не наблюдается. Это ясно указывает на то, что скорость онреде-лящая стадия неферментативной реакции, как и следовало ожидать, включает декарбоксилирование [схема (2), стадия 1], а в ферментативной реакции в процессе скорость определяющей стадии расщепления связи углерод — углерод не происходит, так что лимитирующей должна быть некоторая другая стадия, например кетонизация енольного продукта в пируват (схема (2), стадия 2 [c.197]

Е. ИЗОТОПНЫЕ ЭФФЕКТЫ В ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЯХ [c.217]

Большинство изотопных эффектов, которые были изучены до настоящего времени в ферментативных реакциях, является ненормальными и трудно интерпретируемыми. Необычно нормальный и прямой результат был получен при изучении цитохром редуктазы — флавинового фермента, который катализирует восстановление цитохрома и других акцепторов электрона под действием НАДНа [73]. Реакция [схемы (28) и (29)] включает промежуточное восстановление фермента, при котором существует изотопный эффект [c.218]

Применяя метод изотопного обмена в ферментативной кинетике, делают два важных допущения. Эти допущения, как правило, выполняются, и часто их выполнимость просто подразумевается, однако во избежание недоразумений целесообразно еще раз четко сформулировать их. Первое допущение состоит в том, что реакция, протекающая с участием радиоактивных субстратов, имеет тот же механизм, что и нормальная реакция, и характеризуется теми же константами скорости. Иными словами, предполагается, что изотопные эффекты пренебрежимо малы. Это допущение в большинстве случаев выполняется, если радиоактивным атомом не является тритий. Однако если атом трития не участвует непосредственно в реакции и в связывании субстрата ферментом, то и в этом случае изотопными эффектами можно, по-видимому, пренебречь. Второе допущение состоит в том, что концентрации всех радиоактивных форм пренебрежимо малы по сравнению с концентрациями немеченых форм. Это допущение очень важно, поскольку оно позволяет существенно упростить анализ данных, обеспечить же его выполнимость не составляет труда. [c.134]

Для анализа изотопных эффектов проще всего сопоставить ферментативную реакцию с простой модельной системой, химические свойства которой изучены другими методами. В этом разделе нас интересуют в первую очередь эмпирические результаты модельных экспериментов, однако рассмотрение теоретических основ этих эффектов (даже в упрощенном виде) весьма полезно для понимания их природы. На рис. 2.8 представлена характерная зависимость энергии связи между атомами углерода и водорода от расстояния между этими атомами. Точно такая же зависимость имеет место и для атомов углерода и дейтерия, поскольку форма кривой определяется орбитальными электронами. Согласно квантовой теории, самый низкий энергетический [c.95]

Вторичные изотопные эффекты наблюдаются при расщеплении связи между атомами, соседними с замещенным на другой изотоп атомом. Эти эффекты обусловлены изменением гибридизации изотопа, а не расщеплением связи. По-видимому, наиболее известным примером вторичного изотопного эффекта в ферментативных реакциях является замещение водорода на дейтерий или тритий при С-1-атоме субстратов лизоцима (гл. 12, разд. Д). В ходе этой реакции образуется карбоний-ион, а гибридизация атома С-1 меняется от зр к зр . Для модельных реакций кн ко= 1,14, что близко к величине 1,11 для ферментативной реакции [62, 63] [c.98]

Изолированное наблюдение различия скорости ферментативно катализируемой реакции в воде и в окиси дейтерия не дает ничего существенного для понимания механизма реакции. Элементарные требования, необходимые для интерпретации изотопных эффектов в ферментативных реакциях, заключаются в следующем 1) необходимо разделение влияний изотопного замещения на максимальную скорость и на Кж с дальнейшим разделением влияний на элементарные константы скоростей и равновесий реакции 2) пеобходидю разграничение изотопных эффектов для водородных атомов, необмениваю-щихся и быстро обменивающихся с растворителем 3) для экспериментов, проводимых в растворах окиси дейтерия, необходимо определение влияния этого растворителя на зависимость максимальной скорости и константы Михаэлиса от кислотности. Изотопные эффекты в реакциях переноса необлш-нивающихся атомов водорода, которые обычно связаны с углеродом, интерпретировать относительно легко, поскольку их можно изучать в растворителе постоянного состава, в то время как протоны, связанные с кислородом, азотом или серой, всегда обмениваются с растворителем с диффузионно контролируемой скоростью, которая много выше, чем у изучаемой реакции дейтериевый изотопный эффект в таких реакциях необходимо изучать при использовании окиси дейтерия в качестве растворителя, что влечет за собой определенные трудности в интерпретации результатов, связанных с влиянием растворителя. [c.217]

Различие в массе изотопов, особенно при переходе от Н к и далее к Н, часто сильно влияет на скорости реакций проводимое на этой основе изучение кинетических изотопных эффектов позволило лучше понять механизм,многих ферментативных реакций и все детали их стереохимии. Ярким примером тому служит синтез и дальнейшее использование хирального ацетата (гл. 7, разд. К. 2.ж). За эти исследования Дж. В. Корнфорт в 1975 г. был удостоен Нобелевской пре-мии . Специфические свойства изотопов лежат в основе ЯМР-спектроскопии (разд. И). [c.169]

В ходе этой реакции возможен дейтериевый обмен с растворителем, однако он идет с довольно низкой скоростью. При использовании в качестве субстрата о-манделата и проведении реакции в среде тритированного растворителя меченые о- и ь-продукты образуются в эквимолярных количествах, что указывает на существование симметричного промежуточного соединения. Эти данные свидетельствуют об образовании промежуточного а-карбаниона, причем в роли акцептора протона выступает ферментативное основание. Лнмнтируюи1,ей стадией является перенос протона, поскольку первичный дейтериевый изотопный эффект достигает 5. Внутри фермент-субстратного комплекса эпимеризация идет с константой скорости порядка 10 с , что соответствует верхнему пределу скорости ферментативного переноса протона. [c.151]

За исключением особых случаев с участием растворителя большинство реакций, протекающих в воде, характеризуется тем, что согласованный механизм имеет малое значение [106]. Это заключение было подтверждено Свейнол и сотр. [107] ири изучении изотопных эффектов водорода в ряде реакций. Следовательно, нет оснований для того, чтобы все механизмы ферментативных реакций относить к области иуш-пул катализа, и в то же время несомненно, что эффективность такого рода процессов может быть увеличена благодаря внутримолекулярной реакции в фермент-субстратном комплексе. [c.377]

При использовании NADD (водород замещен на дейтерий) скорость восстановления ацетальдегида, катализируемого спиртовой дегидрогеназой дрожжей, уменьшается, причем kjjkr, = 1,8 [230]. Хля реакции этанола-1,1-dj с NAD в той же ферментативной системе /гн/ в имеет такую же величину. К сожалению, заранее предвидеть влияние изотопного замещения на стадию процесса, определяющую скорость, невозможно, хотя можно ожидать, что реакция переноса электрона не будет иметь большого изотопного эффекта. [c.86]

Ферментативный катализ альдольной конденсации также можно условно разделить на составляющие стадии. Нативная альдолаза катализирует стереоспецифическое отщепление протона от фосфата диоксиацето-на, причем было найдено, что скорость этой реакции, измеренная по обмену трития с растворителем, намного выше, чем общая скорость реакции, катализируемой альдолазой. Иными словами, скорость реакции определяет преимущественно стадия конденсации [схема (64)]. Если фермент модифицировать действием карбоксипептидазы, то происходит специфическое уменьшение ферментативной активности на стадии отщепления протона и скорость определяющим процессом становится именно эта стадия. Обмен трития при этом становится незначительным, а при использовании диоксиацетона, содержащего дейтерий в положении, где идет отщепление протона, скорость общей реакции начинает зависеть от дейтериевого изотопного эффекта. С этим же модифицированным ферментом наблюдается быстрая реакция обмена карбонильного компонента реакции глицераль-дегид-З-фосфата на гексозодифосфат схема (64), стадия 2, быстрая [121]. [c.102]

Изотопные эффекты в ферментативных реакциях, которые проводят в окиси дейтерия, нельзя интерпретировать строго, хотя из данных достаточно детального исследования можно с различной степенью уверенности сделать определенные выводы. Прежде всего наобходимо определить, насколько наблюдаемый изотопный эффект отражает изменения характеристик различных ионогенных форм фермента или субстрата при замене воды на окись дейтерия. Кислотность растворов в окиси дейтерия mojkho определить при помощи обычных стеклянных электродов, если к наблюдаемым показаниям рН-метра, который прокалиброван обычным стандартным буфером в водном растворе, прибавить поправку, равную 0,4 [74]. Желательна проверка этой процедуры непосредственным сравнением показаний рН-метра, полученных с 0,001М НС1 в воде и с 0,001 М D 1 в окиси дейтерия. Различие в константах ионизации субстрата в воде и в окиси дейтерия можно определить непосредственно соответствующее различие активных форм фермента можно обнаружить лишь из зависимости ферментативной активности от pH (или pD), либо путем изучения изотопного влияния на кислотность ионогенных групп, о которых известно, что они важны для проявления ферментативной активности. Сопоставление изотопных эффектов ионизации различного типа ионогенных групп было сделано Бантоном и Шайнером [17]. В окиси дейтерия большинство кислот в 3 — 5 раз слабее, чем в воде, что соответствует разнице в значении p/iT 0,5...0,7 единицы. [c.218]

Эта реакция представляет собой один из примеров, в которых важно сделать четкое различие между экспериментами, проводимыми в чистой окиси дейтерия или с субстратом, полностью помеченным дейтерием, и экспериментами, проводимыми со смесями изотопно-меченных реагентов или растворителей. В первом случае все реакции протекают только с изотопно-меченным соединением и непосредственно из результатов измерений скоростей с мечеными и немечеными субстратами можно сделать определенные выводы. В последнем случае равновесная или стационарная концентрация изотопно меченного промежуточного соединения может меняться сложпыл образом в зависимости от кинетики реакции и необходим детальный кинетический анализ для правильной интерпретации величины изотопного эффекта. Измерения скоростей и распределения продуктов в ферментативных реакциях, изученных в смесях вода — окись дейтерия, часто приводят к различающимся результатам, по-видимому, вследствие вторичных изотопных эффектов, как было отмечено в разд. Г,5 для неферментативных реакций. [c.220]

Если бы константа Михаэлиса была простой константой связывания и если бы изотопные эффекты вызывались полной потерей нулевой энергии валентного колебания в переходном состоянии, можно было бы ожидать, что изотопные эффекты не будут проявляться в константе Михаэлиса ферментативной реакции. Поскольку ни одно из этих предположений не является полностью справедливым, не удивительно, что существование изотопного влияния на константу Михаэлиса является скорее правилом, чем исключением. Интересно отметить, что существует большое и пеобъясненное различие (до 30%) в адсорбции различных изотопов водорода на активированном угле [81]. Ниже рассмотрены возможные причины изотопных эффектов константы Михаэлиса. [c.220]

Рассматриваемые изотопные эффекты являются весьма ценным инструментом исследования простых химических реакций, хотя величины этих эффектов могут сильно варьировать. Например, установлено, что для реакций типа (2.86), катализируемых по механизму общего оснс5вного катализа, отношение йн/йо равно 2, тогда как для нуклеофильной атаки эфира оно близко к 1. Изотопные эффекты в ферментативных реакциях труднее интерпретировать, поскольку в молекуле белка слишком много протонов, которые способны обмениваться на атомы дейтерия [64]. Кроме того, при замене растворителя может слегка измениться структура белка. [c.99]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология