Методы ферментативного переноса

Большие возможности при использовании гидролаз в синтетических реакциях представляет метод ферментативного переноса ацильных групп. В общем виде реакции такого типа могут быть представлены следующим образом [c.54]

При помощи изотопного метода доказано, что ферментативный перенос водорода с дейтерированного субстрата на НАД+ происходит стерео- [c.253]

Не желая слишком усложнять материал, мы рассмотрели процесс индуцированного переноса чисто качественно, но используя подходы, аналогичные тем, которые применялись при анализе обычного изотопного обмена, можно без труда получить соответствующие кинетические уравнения. Метод индуцированного переноса пока не получил широкого распространения, однако рассмотренный нами пример с фосфоглюкомутазой ясно показывает, насколько ценным он может быть для выяснения тех особенностей механизма ферментативных реакций, которые не обнаруживаются в экспериментах по ингибированию продуктом реакции. [c.141]

Флуоресцентный метод применяют для изучения быстрых реакций возбужденных молекул, кислотно-основных реакций возбужденных молекул и комплексообразования в возбужденном электронном состоянии, определения концентрации люминесцирующих веществ в смеси, изучения кинетики и механизма ферментативных реакций, изучения межмолекулярного переноса энергии. [c.74]

Обработка данных производится с помощью компьютера. Метод широко используется для изучения кинетики кислотноосновного равновесия, межмолекулярного переноса, образования комплексов металлов, реакций переноса электрона, ферментативного катализа. Метод позволяет измерять константы скорости вплоть до 10 лДмоль с). [c.323]

Основное направление научных работ — исследование сверхбыстрых химических реакций разработанными им методами химической релаксационной спектрометрии. С помощью метода температурного скачка исследовал кинетику реакций ионов водорода и гидроксила с кислотно-основными индикаторами в водном растворе. Для изучения быстрых реакций в растворах слабых электролитов предложил метод наложения сильного электрического поля, увеличивающего степень диссоциации электролита. Благодаря применению созданных им методов, использующих периодическое возмущение системы, получены данные об образовании ионных пар и десольватации ионов в водных растворах электролитов, о реакциях переноса протона, о кинетике ассоциации карбоновых кислот в результате образования водородных связей и др. Изучал ферментативный катализ, механизм передачи информации и другие вопросы молекулярной биологии. [c.589]

Приводятся некоторые примеры применения этих методов с целью характеристики промежуточных стадий в различных реакциях гидролиза, а также модель реакционного пути таких ферментативных реакций. Эта модель основана на идентификации основных групп на активных центрах и может быть применена и для объяснения природы реакций переноса. [c.326]

Через образец мгновенно пропускают электрический ток образующиеся в результате этого ионы сталкиваются с молекулами растворителя, и в результате раствор нагревается. Если применяют микроволновой импульс, то раствор нагревается за счет вращательной энергии полярных молекул растворителя. Импульсный инфракрасный лазер вызывает перенос колебательной энергии от молекул растворителя к раствору. Перечисленные методы позволяют вызывать в течение микросекунды подъем температуры на 10°С. Таким путем было изучено множество ферментативных реакций. [c.199]

Из сказанного ясно, что метод ЭПР только начинает применяться к исследованию процессов ферментативного катализа. В настоящее время более всего необходимы точные количественные кинетические исследования. Поскольку метод ЭПР позволяет следить в принципе не только за концентрацией неспаренных электронов, но и за их переносом между отдельными активными центрами и за их делокализацией по структуре, можно утверждать, что он окажет существенную помощь в решении такой важной проблемы современной науки, как ферментативный катализ. [c.215]

В связи с появлением современных биохимических методов прямое обнаружение биосинтетических путей настолько упростилось, что интуитивные чисто химические подходы в значительной степени потеряли свое значение. Химические методы могут оказаться весьма полезными в будущем для раскрытия подробного механизма ферментативных процессов. Несмотря на это, всегда будет происходить перенос результатов биологических опытов, полученных на простых организмах или с. простыми соединениями, на большие или более сложные организмы или вещества, для которых нельзя легко осуществить прямой биохимический эксперимент. Такого рода подходы при надлежащем и благоразумном их применении будут стимулировать дальнейшие фундаментальные биохимические исследования. [c.118]

Использование иготопов позволило разработать приемы идентификации расщепляемой связи для исследования ферментов группы гидроаз, ил ферментов переноса. В частности, много дала в этом направлении М. Кон [62], использовавшая О . Методы изотопного обмена позволили уточнить характер реакций переноса. Используя так называемый метод оптической инверсии, можно получить сведения о механизмах некоторых реакций замещения [63]. Для анализа механизма ферментативных реакций с успехом используют изучение явлений конкуренции и некоторых других явлений. Изотопные механизмы позволили приступить к расшифровке механизма действия даже некоторых синте-таз. Большие успехи были достигнуты при изучении ферментативного переноса водорода. [c.175]

Методы ферментативной регенерации АТФ in vitro. Они получили наибольшее развитие. Среди более чем 100 ферментов, катализирующих перенос фосфатсодержащих групп, наиболее часто применяют полифосфаткиназы (реакция 1) и фосфотранс-феразы (киназы) (реакция 2) [c.145]

Чтобы достичь максимального выхода целевого продукта при использовании метода ферментативного синтеза с переносом ацильной группы, требуется глубокое понимание закономерностей протекающих превра- [c.56]

Биораспознающий компонент биосенсора—это белок, макромолекула или комплекс со специфической поверхностью или внутренними распознающими центрами, необходимый для распознавания определяемого вещества. Компонент обусловливает селективность по отношению к определяемому веществу и передает сигнал на преобразователь. Тип реакции, катализируемой фермен> том, определяет выбор преобразователя. Определяемое вещество, а значит, и доступньк методы преобразования обусловливают природу биораспознающего компонента. Рассмотрим два примера, в которых фермент используют для создания сенсора на субстрат этого фермента. На схеме 7.8-1 ферментативная реакция включает перенос злектрона таким образом, для определения холестерина можно использовать в качестве преобразователя амперометрический электрохимический сенсор. Схема 7.8-2 включает изменение [Н+1 следовательно, контроль превращения ацетилхолина возможен с помощью рН-электрода или рН-чувствительного красителя в оптическом приборе. Другие ферменты можно использовать в случае реакций гидролиза, этерификации, расщепления и т. д. определяемое вещество обычно является субстратом фермента. (Как можно провести анализ, если вы не смогли найти подходящую ферментативную реакцию с участием определяемого вещества, ио знаете, что оно является иигибитором ферментативной реакции ) [c.519]

Приведенный выше пример переноса водорода in vitro, несомненно, является предвестником многих подобных стереоспе-цифичных синтезов. Проявляется интерес также к изучению методов переноса водорода in vivo. В течение последних десяти лет широко изучались ферментативные процессы переноса водорода в стероидное ядро. Значительная часть этих исследований посвящена гидроксилированию метиленовых групп, в особен- ности в кольце С [ПО]. Имеются сообщения по крайней мере об одной интересной реакции дегидрирования, а именно 1-дегидрировании Д -кетостероидов [111, 112] под. действием различ- [c.358]

В течение многих лет эти методы использовали главным образом при исследованиях в области физиологии и биохимии, особенно Роутон, а позже Джибсон и другие (работавшие над изучением реакций гемоглобина), а также Чанс — для исследования ферментативных реакций. Однако недавно область исследуемых этим методом реакций начали расширять. В табл. 7 (стр. 64) указаны различные реакции, исследованные струевыми методами к ним относятся реакции с переносом протона, окисли-тельно-восстановительные реакции, гидролиз, образование и диссоциация комплексов, реакции двуокиси углерода с водой, аммиаком и ионом гидроксила. Можно коротко упомянуть некоторые из этих реакций. [c.57]

Рассмотрены механизм активации реагентов катализатором катализ на цеолитах ферментативный катализ электродных реакций перенос водорода на мембранных катализаторах. Приведены современные представления о строении органических кристаллов, описаны новый хроматоструктурный метод изучения структуры молекул и методы электронного зонда для исследования строения поверхностей и тонких пленок. [c.2]

Для хроматографического разделения следовых количеств и(VI) и ТЬ(1У) использовали систему ТОФО — минеральная кислота. ТОФО, нанесенный на стеклянный порошок, использовался для сорбции урана (VI) из раствора мочи, подвергнутой частичному ферментативному разложению [53] ТОФО вместе с ураном элюировался спиртом. Аналогичный метод использован в улучшенной модели полуавтоматического прибора для анализа мочи на содержание урана [54]. Опубликована серия статей [55—57], посвященных методам выделения тория и урана из биологических объектов и их разделению на основе разной способности ТОФО экстрагировать эти актиноиды из сернокислого раствора [55]. После разложения (минерализации) мочи при помощи перекиси водорода и азотной кислоты торий и уран сорбируют из 4 М раствора НЫОз на колонке с ТОФО, нанесенным на микротен (микропористый полиэтилен) с размером зерен 100—170 меш США. Торий(1У) элюируют 0,3 М Н2304, уран(У1) —1 М НР [56, 57]. Извлечение при помощи ТОФО на микротене в статических условиях особенно удобно при серийных анализах мочи, поскольку этот метод очень прост и требует мало времени при выполнении анализа раствор минерализованной мочи перемешивают с твердым экстрагентом, а затем переносят полученную суспензию в хроматографическую колонку для последующего элюирования. Методика подробно описана в гл. 10. [c.270]

Представление о фермент-субстратном комплексе было выдвинуто для объяснения зависимости скорости реакции от концентрации субстрата. Позднее наблюдение над тем, что кинетика поглощения катионов растительными тканями подчиняется уравнению Михаэлиса—Ментен, было принято за доказательство существования комплексов, переносящих катионы [12]. Метод кинетического анализа можно назвать методом исключения . Если кинетика реакции, вытекающая из предполагаемого механизма, не соответствует экспериментально полученным результатам, нужно отвергнуть исходное предположение. Однако иногда ряд возможных механизмов реакции приводит к одному и тому же уравнению скорости и потому нельзя сделать выбор между этими механизмами. Например, кинетические данные, укладывающиеся в теорию Михаэлиса — Ментен, соответствуют представлению о фермент-субстратном комплексе, но возможны и другие механизмы реакции. Так, Медведев [24] предложил теорию ферментативного действия, согласно которой комплекс, образуемый ферментом и субстратом, каталитически не активен. Медведев предположил, что скорость ферментативной реакции пропорциональна концентрации молекул фермента, участвующих в неэластических столкновениях, т. е. столкновениях, при которых происходит перенос кинетической энергии. [c.58]

Экспериментально установлено, что НАД, восстановленный ферментативно при действии СН3СН2ОН в среде ОаО, не содержит дейтерия. В то же время НАД, восстановленный при действии СНзСВгОН в среде НаО, содержит в молекуле 1 атом дейтерия. Эти данные согласуются с представлением о механизме прямого переноса и исключают возможность действия механизма, связанного с переносом электрона. С помощью аналогичного метода было показано, что имеет место прямой перенос водорода из положения 4 никотинамидного кольца восстановленного НАД обратно к карбонильному углероду ацетальдегида с образованием этилового спирта. Используя дейтерий, нельзя ответить на вопрос о том, происходит ли прямой перенос водорода гидроксильной группы этилового спирта к атому азота никотинамидного кольца, поскольку водород гидроксила и водород, связанный с атомом азота, обмениваются (не ферментативно) с ионами водорода среды. [c.229]

Число точек фосфорилирования и их локализация в цепи переноса электронов были установлены с помощью целого ряда прямых и косвенных методов. Прямые измерения обычно проводят с помощью полярографического метода, определяя поглощение кислорода, или же используют изотопную метку (Р ), или, наконец, определяют образование АТФ или убыль АДФ с помощью ферментативных методов. Сравнение полученных при этом значений для отношения Р/0 показало, что для истинного фосфорилирования, обусловленного реакциями в дыхательной цепи, отношение Р/0 равняется 3 (окисление восстановленного НАД и субстратов НАД-дегидрогеназы) и 2 (для субстратов флавиновых ферментов, например для сукцината). Поскольку стадии, следующие за реакциями, которые протекают с участием флавопротеидов, для всех субстратов одинаковы, одна из точек фосфорилирования должна быть локализована в пределах комплекса I. Оставшиеся две точки, таким образом, должны быть расположены на коротком отрезке цепи между коферментом Q (цитохром Ъ) и Ог- Одна из них (точка 2), вероятно, локализована между коферментом Q и цитохромом (или с), т. е. в пределах комплекса III. Такое заключение подтверждается тем, что в системе, в которой цитохромоксидаза блокирована с помощью H N, для окисления восстановленного НАД или В- 3-оксибутирата при добавлении цитохрома с величина Р/2о (то же, что и Р/0) оказывается равной 2. О локализации третьей точки фосфорилирования в области цитохромоксидазы можно судить по результатам только что описанных экспериментов, а также исходя из того факта, что окисление аскорбиновой кислоты — переносчика, способного отдавать электроны только цитохрому с,— в присутствии тетраметил-га-фениленди-амина (ТМФД) характеризуется отношением Р/0, равным единице. Ни скорость, ни стехиометрия этой реакции не изменяются в присутствии антимицина А. В основном к тем же выводам пришли Чанс и Уильямс, исходя из своих экспериментов с использованием ингибиторов (см. стр. 392). Когда к интактным митохондриям добавляют субстрат и Фн, наблюдается явление, получившее название дыхательного контроля] при этом в отсутствие АДФ скорость дыхания становится очень низкой (так называемое состояние 4). После добавления АДФ система возвращается в состояние 3. [c.394]

Картина механизма ксантиноксидазной активности, которая вырисовывается главным образом по результатам опытов, проведенных методом ЗПР, состоит в том, что фермент содержит два независимых каталитических центра. Молибден образует центр, связывающий восстановительные субстраты, и в процессе ферментативной реакции Мо(У1) восстанавливается до Мо(У) и до Мо (IV). Электрон переносится на конечный электронодонорный флавиновый центр непосредственно или при участии железосерусодержащего фрагмента. Хотя флавин является основным центром, связывающим кислород — физиологический конечный акцептор электронов, иные акцепторы электронов могут присоединяться и в других [c.284]

Наиболее широко изучена стереоспецифичность реакций, в которых участвуют пиридиннуклеотидные коферменты. Веннесланд [8] и ее сотрудники с помощью изотопных методов доказали, что атом водорода в положении 4 пиридинового кольца при ферментативном восстановлении НАД занимает всегда лишь одно из двух возможных положений в пространстве. Углеродный атом, который принимает водород, не асимметричен ни в окисленной, ни в восстановленной форме кофермента, но фермент катализирует прямой перенос атома водорода от субстрата строго на определенную сторону плоскости пиридинового кольца в четвертом положении. Одни ферменты специфически переносят водород на одну сторону плоскости пиридинового кольца, другие — на другую сторону. [c.97]

По-видимому, самым убедительным способом доказательства механизма двухтактного замещения является выделение замещенной формы фермента из реакционной смеси в условиях, соответствующих протеканию ферментативной реакции, однако в отсутствие второго субстрата. Если удается это осуществить и показать, что выделенный белок содержит группировку субстрата, подлежащую переносу, но не остаточную группировку донорного субстрата, доказательство Может считаться достаточно строгим. Если, помимо того, можно показать, что выделенное промежуточное производное фермента достаточно быстро реагирует с соответствующим вторым субстратом, образуя второй продукт, и, возможно, с первым продуктом, образуя исходный субстрат, доказательство может считаться полным. Все это настолько ясно, что не требует дальнейших разъяснений. Этот метод, однако, применим, далеко не всегда, так как не всегда удается найти заместитель, который давал бы с ферментом продукт, достаточно стабильный для целей выделения. Тем не менее в литературе описано несколько примеров промежуточных производных ферментов, отвечающих всем этим критериям ацил-а-химо-. трипсин [12], серусодержащая роданеза [13, 14] и КоА-трансфераза [15, 16]. [c.127]

При выводе уравнений (3) и (4) исходили из предположения, что обратными направлениями реакций второй и третьей стадии можно пренебречь. Это всегда верно, когда проводят измерения начальной скорости. Применение кинетических уравнений трехстадийного процесса к гидролизу и реакциям переноса ацила будет рассмотрено в следующих разделах. Предполагается в дальнейшем пользоваться этим приближенным методом для исследования большого числа ферментативных реакций с применением ультрафиолетовой спектроскопии для обнаруже-ния промежуточных соединений во время фазы престационарного состояния. [c.330]

Это вторая книга (первая вышла в 1980 г.) ежегодного издания, обобщающего современные достижения физикохимии. Она состоит из ряда обзоров, посвященных главным образом катализу (4 обзора) и проблеме взаимосвязи строения и свойств вещества (3 обзора). Рассмотрены механизм активации реагентов катализатором катализ на цеолитах, используемых в нефтехимической промышленности ферментативный катализ электродных реакций перенос водорода на мембранных катализаторах. Приведены современные представления о строении органических кристаллов, описан новый хроматоструктурный метод изучения параметров молекул. [c.142]

Нами использован ферментативный метод определения глюкозы в мальтозе [1]. Описанный метод аналогичен определению глюкозы в крови. Он имеет ряд преимуществ перед химическим методом благодаря своей высокой специфичности, позволяющей определять глюкоз . в присутствии других сахаров, а также различных редукцирующнх веществ неуглеродной природы. Метод основан на применении глюкозооксидазы. Механизм действия глюкозооксидазы сводится к переносу двух атомов водорода от шестого углеродного атома глюкозы на кислород воздуха, при этом в реакции образуется глюконовая кислота и перекись водорода [c.71]

В раннем исследовании роли поверхностно-активных веществ Линдлэид и Терджесен [138] установили, что скорость экстракции иода водой из капель четыреххлористого углерода с размерами от 2 до 7 мм уменьшается примерно на 70 % при добавлении в воду поверхностно-активного вещества — сульфата олеил-п-анизидина— в концентрациях всего лишь 6-10 г/л. Много позднее были обнаружены подобные эффекты и при применении других веществ однако общие приемлемые методы предсказания снижения скорости переноса отсутствуют. Этот вопрос представляет промышленный интерес, как, например, при жидкостной экстракции антибиотиков из ферментативных бульонов, которые, несомненно, содержат заметные количества поверхностно-активных веществ. [c.263]

На вопрос о том, протекает ли рассматривае1мая реакция переноса фосфата посредством разрыва связи Р— О или X—О, часто можно ответить, анализируя продукты реакции, хотя ферментативные реакции могут быть сложнее, чем представляются при поверхностном рассмотрении, и нередко включают образование промежуточных соединений. Иногда их можно обнаружить, используя метку Ю, по методу, предложенному Кон [13].Если нуклеофилом служит вода, то расщепление связей Р—О и X—О приводит к одним и тем же продуктам реакции и использование воды, меченной Ю, является единственным способом сделать выбор. В случае пути (I) метка оказывается в фосфате, а в случае пути (II)—в НО—X [c.630]

Катализ реакции переноса фосфата от АТФ (аденозинтрифосфат) к воде или к другим акцепторам — это интересный пример электрофильного катализа металлами [106]. Ион металла в реакциях такого рода может вести себя по-разному 1) экранироватр (гасить) отрицательные заряды на фосфатной группе, которые в противном случае стремились бы препятствовать атаке электронной пары нуклеофила, особенно в случае анионного нуклеофила 2) увеличивать реакционную способность атакуемого атома, оттягивая на себя электроны 3) способствовать улучшению свойств уходящей группы 4) служить связующим звеном между нуклеофилом и субстратом 5) изменять рХ и реакционную способность нуклеофила 6) изменять, по-видимому, геометрию молекулы субстрата таким образом, чтобы облегчить протекание реакции. Катализ ионами металлов является важным для многих ферментативных процессов и включает, по-видимому, эти же факторы. Кроме того, ион металла может участвовать и в связывании субстрата на ферменте в правильном положении. Применение методов ЭПР и ЯМР к исследованию непосредственного окружения иона металла позволило различить эти возможные механизмы как в ферментативных, так и неферментативных реакциях [107, 108]. [c.95]

Многие окислительно-восстановительные процессы в живых системах связаны с передачей электрона по цепи последовательных ферментативных реакций. В подобных системах перенос электрона осуществляют специализированные субстраты переноса, важнейшим из которых является цитохром с. Структура и свойства последнего разобраны достаточно подробно в гл. П1, 3. Здесь рассмотрим только те его свойства, которые связаны с переносом электрона. Механизм передачи электрона к цитохрому с пока неясен, но наиболее интересные данные в этой области получены методами ЭПР [92, 93], мессбау-эровской спектроскопии [94] и ЯМР [95, 96]. В [92] показано, что фер- [c.141]

Поверхностные монослои широко используют в качестве модельных мембранных систем. С их помош ью изучают подвижность и типы упаковки молекулярных компонентов в мембранах, межмолекулярные взаимодействия в мембранах, механические свойства мембран исследуют кинетику и механизмы ферментативных процессов, протекаюш их на границе раздела фаз изучают процессы переноса ионов и электронов через границу раздела фаз, инжекцию заряда в липидный слой (диэлектрик) и т. д. Однако этот метод имеет ряд ограничений, в значительной степени обусловленных тем, что монослой — это лишь половина липидного слоя мембран, обраш енного в газовую фазу. Последнего ограничения удается избежать при использовании в качестве мембраны мономолекулярного слоя, образуюш егося на границе двух несмешиваюш ихся жидкостей (углеводород-вода). Более адекватные модели, представляюш ие собой липидные бислои, удается получить в виде полимо-лекулярных структур, которые образуются липидами в объеме водной фазы. Лиотропный и термотропный полиморфизм липидов. Как было показано, полярные части мембранообразуюш их липидов сильно взаимодействуют с водой, поэтому эти соединения могут смешиваться с водой в любых соотношениях. Однако возникаюш ие смеси не представляют собой истинных растворов, а образуют многообразные упорядоченные фазы с периодической структурой. В зависимости от [c.11]