Методика гибридизации

В настоящее время предложено большое количество различных методик гибридизации и не ясно, какая из них наиболее приемлема. Гибридизация может быть успешной как с формамидом, так и без него, В состав гибридизационных смесей могут [c.80]

Примечание по оригинальной методике гибридизацию проводят в течение 10—12 ч. Считается, что за это время реакция реассоциации между фрагментами геномной ДНК и РНК-зондом достигает насыщения. В клонированных и амплифицированных в ПЦР фрагментах геномной ДНК доля последовательностей-мишеней намного больше, поэтому время гибридизации можно значительно уменьшить. Сокращение сроков инкубации облегчает проведение эксперимента и уменьшает деградацию зонда. [c.151]

Методика дот-блот гибридизации ДНК. Исследование проводят в несколько этапов. [c.97]

Еще 15 лет назад был разработан метод гибридизации соматических клеток для проведения генетических исследований на клеточных культурах. На его основе была создана методика генетической рекомбинации путем искусственно вызываемого слияния протопластов ее уже удалось с успехом применить на материале грибов и растений. Первичный продукт такого слияния-клетка, объединяющая в себе геномы обеих родительских клеток. [c.471]

Однако трудность априорного учета гибридизации орбиталей и валентного состояния атома приводит в ряде случаев к некоторому произволу в вычислении интегралов перекрывания, а значит и N. Поэтому нами была предложена методика расчета AfJ, базирующаяся только на геометрических параметрах вещества. Если провести сферу через ближайшие к центральному атому лиганды, а все остальные-более удаленные-лиганды [c.88]

ДНК-зонды применяют и в реакциях гибридизации с РНК до выявления экспрессии данного гена в клетках. В этом случае ДНК-зонд. содержащий часть носледовательности гена, пытаются гибридизовать с РНК, выделенной из анализируемой клетки. Если гибридизация происходит, проводят количественное определение экспрессии. Более усовершенствованные методики предполагают обработку ДНК-зонда специфическими нуклеазами для обнаружения участков, гибридизующих с клеточной РНК. Таким образом можно определить начальные и концевые участки транскриптов РНК (рис. 4-71) этот же метод может быть полезен для выяснения точных границ участков, вырезаемых из транскриптов РНК в процессе сплайсинга РНК. [c.238]

Более точную информацию о сходствах и различиях между молекулами ДНК разных видов ( гомологичности ДНК ) дают эксперименты по гибридизации (спариванию оснований) ДНК. В многочисленных работах описано много различных методик для определения гомологии и приведено много результатов [493, 470, 887, 1203, 1215, 1521, 1628, 1755, 1831]. [c.30]

Анализу предполагаемых трансформантов обычно придается большое значение, и мы не остались в стороне от этой проблемы и разработали несколько соответствующих методик. Не нужно объяснить, насколько важно определить, являются ли колонии, отобранные как трансформанты, на самом деле трансформантами или же это ревертанты. Анализ трансформантов предполагает гибридизацию с колониями или выделение и анализ плазмидной ДНК. Кроме того, для оценки экспрессии чужеродного гена в дрожжевой системе весьма важно определить копийность плазмиды как фактор, оказывающий существенное влияние на уровень экспрессии. [c.230]

Титр вируса в культуральной среде инфицированных клеток можно определить с помощью целого ряда методик, в основе которых лежат физические, биохимические или биологические методы анализа. Наибольшее распространение получил способ, заключающийся в количественном определении вирусной геномной РНК в культуральной среде с помощью гибридизации с меченным ДНК-зондом. Эту стандартную процедуру дот-блот-гибридизационного анализа проводят после концентрирования препарата вируса, как описано в табл. 9.4. Количественное определение достигается путем сравнения интенсивности полученного гибридизационного сигнала с интенсивностью контрольных сигналов гибридизации точно титрованного вируса (разд. 9.6.1.3) или известных количеств РНК, или ДНК, нанесенных на фильтр. Используя разные ДНК-зонды, можно оценить концентрацию индивидуальых компонентов в вирусном препарате и непосредственно определить, содержит ли вирус интересующие нас последовательности. [c.297]

Более половины геномной ДНК эукариотических организмов принадлежит к классу уникальных, или неповторяющихся, последовательностей. Это утверждение (а также оценки, касающиеся распределения в геноме повторяющихся последовательностей ДНК) базируется на данных непрямых экспериментов с применением различных методик ДНК-РНК-гибридизации, позволяющих получить лишь приблизительную оценку. У дрожжей—низших эукариот—экспрессируется около 4000 генов. В типичной ткани млекопитающих (печень или почки) экспрессируется от 10000 до 15000 генов. При этом в каждой ткани происходит экспрессия специфического набора генов. Каким образом это достигается, по-прежнему остается одним из центральных вопросов современной биологии. [c.69]

Существуют чисто экспериментальные методы поиска гомологий нуклеотидных последовательностей.Наиболее распространенными являются подходы, основанные на гибридизации молекул нуклеиновых кислот и дальнейшем анализе дуплексов тем или иным методом. Пр7, анализе протяженных гомологий применяют также сопоставление рестрикционных (физ/ческих) карт соответствующих фрагментов ДНК. й в том, и в другом случае нет необходимости определять последовательность оснований в сравниваемых молекулах. Рассмотрение соответствующих методик не является предметом настоящей книги. [c.12]

Примерно через 6 ч проявите пленку, экспонированную с фильтром II. Выявите бляшки, соответствующие гибридизации. Отберите их уколом и приготовьте препараты фага на чашках. Используйте чашки с агарозой и следуйте методике 11-П быстрого выделения фаговой ДНК. Выращивайте по одной чашке каждого фага (от одного до шести). После выращивания в течение 6 ч налейте на чашку 5 мл среды для разведения фага Я"и инкубируйте при 5°С в течение 2—12 ч. Если позволит время, то, используя быстрый метод, выделите ДНК из этих препаратов фага. [c.48]

Проводите гибридизацию, как описано в методике 23. [c.117]

И. Гибридизацию проводите, как указано в методике 23. [c.118]

Наконец, исследования показали, что искусственная гибридизация между различными формами, в том числе и между различными видами, происходит во много раз труднее, чем это наблюдается при скрешивании диплоидов. По-видимому, для преодоления этого затруднения потре буется разработка для тетраплоидов своей методики гибридизации. [c.212]

Следует всегда номиить о том, что примеси основных белков в препаратах ДНК также увеличивают уровень фона. Для очистки ДНК можно посоветовать метод Мармура [20] в модификации Джилесни и Сиигелма-на [8]. Возрастание уровня фона за счет загрязнений препаратов ДНК определяют, проводя при 4° ложную гибридизацию, для чего используют ДНК фильтры и РНК с нулевым фонола . При этой температуре за короткий срок (1—2 дня) гибриды не образуются, однако сорбция ДНК, обусловливающая возрастание фона, происходит нормально. Независимо от методики гибридизации и обнаружения гибрида препараты ДНК должны быть свободны от следов РНК-азы. [c.159]

Перед тем как рассмотреть некоторые наиболее существенные модификации, мы остановимся на двух основных методиках гибридизации, которые используются одинаково успешно. Они иллюстрируют возможность широких вариаций при осуществлении различных стадий метода без снижения эффективности гибридизации. В частности, в первом случае клетки после слияния культивируют в 96-луночной панели для микротитрования. Во втором случае гибридомы выращивают в 24-луноч-аых панелях для культуры тканей (объем лун ки 2 мл). В данном случае выбор панели может быть обусловлен как удоб- [c.123]

Эта методика теперь редко используется, но одно время она была настолько распространена, что заслуживает краткого упоминания. При приготовлении гибридов ДНК—РНК учитывали тот факт, что в случае полинуклеотидов с приблизительно 50%-ным G- -составом плотности ДНК и РНК в s l отличаются приблизительно на 0,1 г/см (очень большое различие). Следовательно, денатурированную и ренатурироваиную смеси можно было центрифугировать до достижения равновесия в растворе s l и обнаружить гибридизацию по появлению полосы при соответствующей плотности. Для гибридов ДНК—ДНК, содержащих ДНК из одного и того же вида организмов, обычно используют различия в плотности между ДНК, меченной N, Н или С, и ДНК, содержащей только N, Н и С. Если бы ДНК были из различных организмов и имели различный G- -состав, характерные для этих ДНК плотности были бы неодинаковы и гибрид можно было бы обнаружить по появлению полосы, указывающей на ДНК с промежуточной плотностью (рис. 18-6). Отметим, что при использовании этой методики, гибридизацию ДНК проводят в растворе. [c.527]

Современные представления о генах эукариот и их РНК-пролуктах были сформулированы i лавным образом на основе опытов по гибридизации нуклеиновых кислот. Методика гибридизации включает 01ЖИГ одноцепочечных фрагментов РНК и ДНК, позволяющий комплеменгарным цепям обра- [c.80]

Следует заметить, что иммуноанализ с регистрацией аналитического сигнала амперометрическим методом предложен сравнительно недавно. Наиболее многообещающие результаты достигнуты в тех случаях, когда датчики разрабатывались с учетом специфических требований электрохимического детектирования, а не приспосабливались к существующим методикам. В частности, большие надежды возлагаются на амперометрические зонды для диагностики генетических заболеваний (ДНК-зонды). Разработана конструкция датчика, состоящего из стеклоуглеродного электрода, поверхность которого модифицирована ковалентно пришитой односпиральной ДНК. После ее гибридизации с ДНК-мишенью регистрируют концентрацию дипиридильного комплекса Со(Ш), который взаимодействует с двойной спиралью ДНК. При генетических нарушениях односпиральная ДНК не способна гибридизоваться с ДНК, взятой у больного человека. [c.508]

Пачечно-бахромчатая (мицеллярно-бахромчатая или кристаллитная) модель строения углерода была постулирована в начале 50-х годов независимо друг от друга Франклин и Касаточкиным. Она получила значительное развитие во многих работах. В рамках данной теории интерпретировались практически все результаты исследований была предложена методика экспериментального определения доли ароматического углерода , было разработано множество моделей беспорядка или частичной аморфности полимерного углерода . Считали, что аморфность обусловлена, главным образом, беспорядочными трансляциями, поворотами и изгибами слоев , нетождествеиностью валентных связей отдельных атомов (хиноидная структура Полинга ) или состояний разных поверхностей одной и той же или разных двумерных ароматических молекул , а также двухфазностью системы. Предполагалось", что аморфный углерод характеризуется всевозможными степенями гибридизации внешних электронов. Хотя и акцентировалось внимание на более или менее регулярной упаковке ароматических слоев в пачке (кристаллите), но тем не менее наряду с атомными слоями допускалось существование и цепочечных фрагментов, упакованных нерегулярным образом. Казалось, что не существует другой возможности для интерпретации многочисленных фактов, особенно данных рентгеновской дифракции. [c.20]

В рекомбинационной ДНК-технологии фрагменты нуклеиновых кислот, вырабатываемых при обработке двухнитевой ДНК ограниченными эндонуклеазами, выделяются электрофоретически на агаровых или полиакриламидных гелях. Окрашиванием этидиумбромидом добиваются того, что выделенные ленты становятся видимыми. Затем ДнК денатурируется обработкой щелочью и помещается в буферный раствор. Ленты ДНК переносят на нитратцеллюлозные мембраны тампоном по методике, называемой Сазенов-ским переносом [16]. После окончания переноса и термофиксации нуклеиновых кислот процедура гибридизации выполняется, как описано выше. [c.88]

Обычно гибриды получают в соловых растворах, забуференных до нейтральных pH, при повышенной температуре. Здесь мы рассмотрим основные этапы этого процесса, подробные методики будут приведены далее (разд. I, В). Концентрации солей, которые обычно успешно применяются для гибридизации, варьируют от 0,3 до 1,5 М нри температурах от 25 до 80°. Чаш е всего применяют 0,3 М раствор Na l в 0,015 М натрий-цитратном или 0,01 М г/)мс-буфере с pH 7,0. Растворы с такой ионной силой пригодны ночти для всех экснеримонтов (отдельные исключения будут обсуждены в дальнейшем). [c.148]

Гольданский и др. [174] провели дальнейшее усовершенствование этой методики, предположив эффективную р -гибридизаци ю шести эквивалентных связывающих орбиталей л я октаэдрических комплексов железа и проведя учет экранирования 4 -электро-нов Н только 3d- но и 4р-электронами. Эти авторы нашли величину AR/R f Pe) = = — О 9-10- . [c.139]

Принцип методики ПЦР ясен из рис. 5-89, В. В каждом цикле реакции необходимо сначала кратковременное нагревание ДНК для разделения двух цепей двойной спирали (1-й этап) Последующее охлаждение ДНК в присутствии большого избытка двух упомянутых ДНК-олигонуклеотидов приводит к специфической гибридизации этих олигонуклеотидов с комплементарными последовательностями ДНК (2-й этап). После отжига смесь инкубируют с ДНК-полимеразой и четырьмя дезоксииуклеозидтрифосфатами, в результате чего избирательно синтезируются те участки ДНК, которые располагаются книзу от затравки (3-й этап). Для эффективной амплификации ДНК требуется от 20 до 30 циклов реакции В каждом последующем цикле количество ДНК по сравпепию с предыдущим циклом удваивается Отдельный цикл занимает около 5 мин, поэтому при автоматизации всей процедуры для бесклеточпого молекулярного клонирования какого-либо фрагмента ДНК требуется несколько часов, гогда как обычные процедуры клонирования растягиваются на несколько дней [c.341]

В некоторых случаях крайне желательно экстрагировать разделенные в агарозном геле фрагменты. Они могут понадобиться для исследования химическими и физическими методами, а также для установления деталей структуры рестрикционным анализом, определения последовательности оснований в ДНК, гетеродуплексно-го анализа и гибридизации с использованием эндонуклеазы [6] или блоттинга методом Саузерна [28]. Приводимая ниже методика [11] позволяет экстрагировать с хорошим выходом всевозможные интактные, биологически активные молекулы ДНК непосредственно из полос, которые они образуют в агарозном геле. Для осуществления этой операции нужен выпускаемый промышленностью препарат агаразы ( albio hem, La Jolla, alif., номер по каталогу 121811)—фермента, расщепляющего агарозу. [c.144]

Основой для любого изучения гомологии является диссоциация двухцепочечной плазмидной ДНК и последующий специфический отжиг одноцепочечной ДНК из гомологичного или гетерологичного источника (реассоциация ДНК). Плазмидные гомо- и гетеродуплексы анализируют с помощью специфичной по отношению к одноцепочечной ДНК эндонуклеазы S1 из Aspergillus огу-zae. Приводимая ниже методика [6] позволяет точно и быстро определять, насколько гомологичны или гетеро-логичны полинуклеотидные последовательности. Это особенно полезно для проведения экспресс-анализов и для других исследований, в которых требуется постановка большого числа проб на гибридизацию ДНК — ДНК. [c.152]

Предложено множество различных вариантов гибридизацп-онных смесей в табл. 1.4 мы подробно приводим простой метод, при котором используются те же растворы, что и при обычной гибридизации с ДНК.-зондами. Строго говоря, основная часть компонентов этой гибридизационной смеси не является принципиально необходимой для протекания реакции гибридизации. И если мы пользуемся именно этой методикой, то лишь исключительно для удобства. [c.28]

Важно проверить транскрипционную смесь, поскольку мы получаем в некоторых случаях низкую эффективность включения, что обычно связано с деградацией зондов, которые, естественно, не годятся для гибридизации. Проверьте включение осаждением ТХУ на фильтрах DE8I либо ватман 540 (описание методики приведено в гл. 1). При использовании РНК-полиме-разы фага Т7 включение в отсутствие холодного UTP достигает 90%, а с полимеразой фага SP6 — 30—60% (в нашем случае 5Р6-полимераза была всегда менее эффективной, ч м Т7-фер-мент). [c.66]

Как сказано выше, приведенные здесь методики используются для отбора уникальных космидных (или плазмидных) клонов из больших библиотек с применением генетической селекции, а не скрининга библиотек путем гибридизации колоний. Этот подход получил широкое распространение использование в качестве селекционных зондов последовательностей, клонированных в pU 8 и pU 9, позволяет выделить многие космидные клоны из библиотек мыши и человека (см., например, [5, 6, 22]). [c.82]

Для того чтобы максимально эффективно использовать моноклональные антитела в функциональном анализе, необходимую, чтобы сайты связывания были картированы как можно точнее. Довольно простой подход к решению этой проблемы состоит в блот-гибридизации колоний с серией перекрывающихся гибридных белков, что позволяет идентифицировать искомые последовательности, состоящие примерно из 50 аминокислот. Методика блот-гибридизацки колоний приводится в табл. 6.1. Следующий шаг — это синтез перекрывающихся пептидных последовательностей для идентификации участка с точностью до нескольких аминокислот. Мы успешно использовали этот подход при картировании РАЬ204, ингибирующего АТРазу [6], [c.200]

Гибридизация с колониями позволяет анализировать дрожжевые штаммы на содержание специфических нуклеотидных последовательностей. Приготовление дрожжевых образцов несколько отличается от процедуры, описанной для Е. соИ однако после того, как нитроцеллюлозный фильтр-реплика с ДНК подготовлен, дальнейшие операции аналогичны тем, которые используются для бактерий. Соответствующая методика приведена в табл. 7.7. Другой вариант этого метода описан Р. Ротстейном в гл. 3 первого тома [29] данной серии. [c.231]

Надрежьте мешочек, в котором проводили гибридизацию, по заваренному месту и слейте гибридизационную смесь. Разрежьте мешочек и выньте фильтр. Промойте фильтр, как описано в методике 23. Гибридизационную смесь поместите в холодильник и храните для повторного использования. Обязательно наденьте двойные перчатки, защитные очки и пластиковый фартук. Высушите фильтр. Оберните его пластико- [c.47]

Выделяют ДНК из различных штаммов Salmonella. Выделяют ее прямо из колоний, используя методику быстрого выделения ДНК- Затем выделенную ДНК расщепляют разными рестрикционными эндонуклеазами, проводят электрофорез в агарозном геле и разделенные фрагменты переносят на нитроцеллюлозу. После этого проводят гибридизацию таких полосок нитроцеллюлозы с ДНК, меченной с помощью ник-трансляции. С этими полосками экспонируют рентгеновскую пленку. После того как пленка проявлена, мол<но определить размеры тех рестрикционных фрагментов, которые гомологичны использованной ДНК-зонду. [c.50]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология