Обнаружение гибридов

При проведении гибридизации на фильтрах имеется два основных источника ошибок загрязнение очищенных гибридов большими количествами свободной РНК (РНК- фон ) и, во-вторых, неколичественная сорбция ДНК на фильтрах. Последняя проблема подробно обсуждалась в предыдущем разделе с первой трудностью сталкиваются при любом способе обнаружения гибридов, и поэтому здесь мы рассмотрим ее подробно. [c.158]

Необычайный интерес в последние годы вызвали РНК-содержащие онкогенные вирусы. Большинство исследователей, занимающиеся биохимической генетикой и функциями нуклеиновых кислот, считали, что ДНК образуется только за счет репликации других молекул ДНК- Если транскрибирование РНК с ДНК может протекать свободно, то обратный процесс, а именно образование ДНК на РНК-матрице, считался маловероятным. Большой неожиданностью поэтому оказалось обнаружение во многих онкогенных РНК-содержащих вирусах, и в том числе в вирусах, вызывающих у животных лейкоз, РНК-зави-симой ДНК-полимеразы (т.е. обратной транскриптазы). Этот фермент обнаруживается в зрелых вирусных частицах. Наиболее тщательно очищенный фермент вирусов миелобластоза птиц состоит из двух белковых субъединиц, имеющих мол. вес ПО ООО и 70 000, и содержит два атома связанного Zn +. Для функционирования фермента необходима короткая затравка и матричная цепь РНК. При этом сначала получается гибрид ДНК—РНК, из которого затем (вероятно, после гидролитического расщепления цепи РНК под действием РНКазы Н, разд. Д, 5, в) получается двухцепочечная ДНК. Таким образом, заражение РНК-содержащими вирусами сопровождается образованием [c.288]

Современный уровень развития биотехнологии обусловлен общим прогрессом науки и техники, особенно — в течение последних 50 лет Достаточно отметить лишь такие события, как установление структуры и функций нуклеиновых кислот, обнаружение ферментов рестрикции ДНК и выявление их значения в жизни клеток с последующим использованием в генно-инженерных работах, создание гибридом и получение моноклональных антител, внедрение ЭВМ и компьютерной техники в биотехнологические процессы и т д [c.9]

Удобным средством для обнаружения гибридизации являются нитроцеллюлозные фильтры [177], пропускающие свободную РНК (стр. 64), но задерживающие гибриды РНК с денатурированной ДНК. [c.234]

Ф и г. 2. Обнаружение ДШ — РНК-гибрида с помощью хроматографии на МАК [22].. ДНК и РНК выделяли из Е. соН. Гибриды были получены в растворе, их анализ проводили [c.156]

Фиг. 197. Схема образования и обнаружения специфических молекулярных гибридов между полинуклеотидными цепями ДНК и РНК-

Наконец, существует и прямой способ доказательства родства фагов по обнаружению способности их к рекомбинации и образованию жизнеспособных гибридов. Именно так было открыто родство фагов Р22 и Х. [c.194]

Помните, что необходимо отбирать для анализа супернатанты из лунок с хорошим ростом гибридом такая проба будет содержать оптимальное количество антител. Очень простой радиоиммунологический метод может быть использован для тестирования адекватных уровней антител в супернатантах и для повседневного контроля за образованием антител в лунках [13]. Особую ценность данный метод приобретает в том случае, если наблюдается рост в большом числе лунок, а скрининг супернатантов еще не дает положительных результатов. Обнаружение с помощью антиглобулиновых реагентов значительных титров антител означает, что чувствительность первичного скрининг-теста недостаточна и его необходимо усовершенствовать. Если выявляют мышиные иммуноглобулины в незначительной концентрации, то необходимо подождать, пока гибридомные клетки вырастут, а затем взять повторные пробы для скрининга. Можно сконцентрировать анализируемые супернатанты, хотя обычно в этом нет необходимости. [c.135]

Гетерологичные зонды. Гетерологичные олигонуклеотидные зонды получают на основании предположения о наличии гомологии в последовательностях у генов организмов разных биологических видов, которые выполняют аналогичные функции. При гибридизации гетерологичных зондов с ДНК исследуемой клонотеки используют более низкие температуры их отжига для того, чтобы даже при наличии нескольких неправильно спаренных оснований в гибриде он оказался достаточно стабильным для обнаружения. Понижение температуры отжига зонда значительно ниже его температуры плавления будет почти неизбежно сопровождаться получением ложноположительных результатов, т.е. гибридизацией зондов с неродственными последовательностями, которые обладают определенной гомологией с искомой. Во многих случаях этот результат не опасен, поскольку после такого предварительного отбора, круг поиска нужной последовательности существенно сужается. Проведение повторной гибридизации в других условиях среди предварительно отобранных клонов может привести к положительному результату. Ситуация становится угрожающей в том случае, если число ложноположительных клонов, выявленных на первом этапе отбора, становится слишком большим. В этом случае цена повторного скрининга может оказаться слишком высокой. [c.164]

После гибридизации смесь содержит четыре вида молекул непроги-бридизовавшуюся РНК, РНК-ДНК-гибриды, одноцепочечную ДНК и ре-натурированную ДНК. Методы обнаружения гибридов, которые здесь будут рассмотрены, служат в основном для отделения молекул первого вида от всех остальных видов. Этого вполне достаточно, так как изучение гибридизации преследует своей целью определить соотношение между гибридизированной РНК и общим количеством ДНК. Обычно после очиспш [c.153]

Следует всегда номиить о том, что примеси основных белков в препаратах ДНК также увеличивают уровень фона. Для очистки ДНК можно посоветовать метод Мармура [20] в модификации Джилесни и Сиигелма-на [8]. Возрастание уровня фона за счет загрязнений препаратов ДНК определяют, проводя при 4° ложную гибридизацию, для чего используют ДНК фильтры и РНК с нулевым фонола . При этой температуре за короткий срок (1—2 дня) гибриды не образуются, однако сорбция ДНК, обусловливающая возрастание фона, происходит нормально. Независимо от методики гибридизации и обнаружения гибрида препараты ДНК должны быть свободны от следов РНК-азы. [c.159]

Гибридизация является ценным аналитическим и препаративным методом. Большое разнообразие способов образования и обнаружения гибридов позволяет применять для изучения данной проблемы различные экспериментальные приемы, однако для каждой конкретной системы следует тщательно подобрать наиболее выгодшлй метод. Ниже приводятся некоторые общие соображения. [c.167]

Другим методом, позволяющим производить отбор гибридов, является генетическая комплементация. Этот метод был применен для обнаружения гибридов табака, при этом использовались хлорофиллдефектные мутации у родителей с последующей комплементацией в гибридных продуктах. Сочетание двух ядерных рецессивных мутаций у табака вызывает светозависимую хлорофильную недостаточность. Растения, гомозиггот-ные по любому из этих генов, выращиваемые при интенсивном освещении, обесцвечиваются и гибнут. После слияния и регенерации клеточные колонии пересаживают на среду, индуцирующую стеблевой органогенез, и культивируют на свету. [c.158]

Недавно было обнаружено, что короткая цепь РНК, образующая гибрид РНК—ДНК, может служить затравкой для ДНК-полимеразы in vitro. Эти данные в сочетании с обнаружением фрагментов Оказаки и лигазы дают основание думать, что в репликационной вилке происходят следующие события двухцепочечная ДНК раскрывается в ограниченном участке, вероятно, при участии расплетающих белков (разд. Д). В специальной затравочной области синтезируется короткий фрагмент РНК-зат1равки, образующей пары оснований с ДНК. Далее [c.198]

На иммунизацию организм отвечает синтезом очень неоднородной популяции антител, молекулы к-рых могут сильно отличаться друг от друга по сродству к антигену. Такая неоднородность объясняется участием в иммунном ответе очень большой популяции В-лимфоцитов, каждый из к-рых синтезирует лишь одну разновидность молекул антител. С помощью техники гибридом (гибридные клетки, получаемые слиянием злокачественных и нормальных анти-телобразующих клеток лимфоцитов) удается получить в больших кол-вах однородные моноклональные антитела, к-рые широко используют в качестве высокоспецифич. реагентов для обнаружения, локализации и выделения разл. в-в, а также для диагностики и лечения нек-рых заболеваний. Гомог. И. накапливаются в больших кол-вах в крови и моче больных при ряде злокачеств. поражений лимфоцитов (т. наз. миеломные И.). [c.217]

В качестве детектора для определения компонентов, разделенных в газохроматографической колонке, можно использовать масс-спектрометр. В этом случае мы получаем еще более сложный гибрид систему газовый хроматограф — масс-спектрометр. Это сочетание развивалось, например, в Институте химической физики АН СССР членом-корреспондентом АН СССР В. Л. Тальрозе и его сотрудниками. Выпускались соответствующие приборы, например Хромасс-2. Эта комбинация получила широкое распространение и в других странах, причем в качестве третьего элемента устройства выступает ЭВМ. Такое сочетание обеспечивает экспрессность определений, низкий предел обнаружения. [c.93]

Большинство антигенов вызывает в организме образование целого набора антител, но каждый отдельно взятый лимфоцит продуцирует лишь одно из них. Миеломы — это злокачественные новообразования иммунной системы они развиваются в результате неконтролируемой пролиферации одной линии лимфоцитов. При этом в больших количествах синтезируется один тип белков-антител. Иными словами, миеломы являются природными продуцентами моноклональных антител. По методу Миль-штейна проводят слияние нормальных (неопухолевых) лимфоцитов и клеток миеломы. Вначале полученные гибриды синтезируют смесь антител, включающую два типа антител родительских клеток, а также гибридные их формы, образующиеся путем ассоциации тяжелых и легких цепей антител двух родительских форм. Впоследств ии в результате элиминации хромосом образуются клетки, способные к синтезу антител лишь одного типа. Это могут быть либо антитела, закодированные в геноме лимфоцита, либо антитела, характерные для клеток миеломы. Скрининг и обнаружение клона, синтезирующего искомое антитело, ведут при помощи биохимических и иммунохими-ческих методов. Схема этого метода дана на рис. 7.5. [c.313]

Она обладает способностью давать гибриды с гомологичной ДНК [125, 126]. Нанример, клетки асцитной опухоли Кребс II метили в течение 20 мин уррздином, меченным тритием, затем экстрагировали всю РНК клетки и центрифугировали в градиенте сахарозы. К тому времени, когда основная масса РНК в клетке почти не успела стать радиоактивной, уже был обнаружен пик быстро- [c.244]

Опыты проведены на 33 индуцированных мутантных линиях гороха (хлорофильные, карлики, с измененной формой листочков, цветков и бобов, скороспелые, без воскового налета). При скрещивании мутантов с исходными сортами во всех случаях в Рг наблюдали моногибридное расщепление на исходную форму и мутант в соотношении 3 1. Гетерозйготу по-мутантному гену сравнивали с гомозиготами по нормальному и мутантному аллелям по признакам высота растений, число бобов, число и вес семян на одно растение. Высокий гетерозисный эффект обнаружен по мутациям карликовости и хлорофильным, обусловливающим в гомозиготе желто-зеленую окраску листьев. Некоторые мутации вызывали одинаковую депрессию развития в гомозиготном состоянии, но оказывали неодинаковое влияние на развитие организма в гетерозиготном состоянии. Выявлены различия по гетерозисному эффекту у реципрокных гибридов, полученных от скрещивания мутантов с исходным сортом. На примере аллельных мутантов, индуцированных у разных сортов, показано, что влияние мутантногО гена на развитие организма в значительной степени зависит от генотипической среды. [c.344]

На четырех сортах и двух гиоридах льна-долгунца испытано действие трех химических мутагенов — НММ, ДМС и ЭН. Установлено, что химические мутагены по своей мутагенной активности не равнозначны и действуют на лен-долгунец специфически. Показана специфичность сортов и гибридов в реакции на различные химические мутагены, которая проявляется в частоте и спектре мутаций. У высокомутабильных сортов обнаружен полный спектр учитываемых мутаций, маломутабильные сорта дали далеко не полный набор учитываемых мутаций. Среди большого разнообразия измененных форм отобраны мутанты, имеющие значение, как исходный материал. С ними ведется дальнейшая селекционная работа. [c.350]

Обратная транскриптаза —РНК-зависимая ДНК-полимераза. этот фермент обнаружен в составе онкогенных и неонкогенных вирусов, в спонтанной карциноме млекопитающих, в нормальных клетках мыши и человека, а также в клетках опухолей человека при отсутствии каких-либо РНК-содержащих вирусов. Обратная транскриптаза, осуществляющая синтез ДНК, использует в качестве матрицы одноцепочечную РНК. Рибонуклеозидтрифосфаты в этой реакции не могут заменить дезоксирибо-нуклеозидтрифосфаты. Актиномицин D в этом случае не влияет на процесс синтеза ДНК. Непосредственным продуктом реакции является двухцепочечный гибрид РНК—ДНК, образующийся в результате синтеза комплементарной цепи ДНК на одноцепочечной РНК. . [c.64]

Фильтры, на которых сорбирована суммарная ДНК и неочищенные гибриды, помещают прямо в флаконы для сцинтилляционного счетчика, содержащие 5 мл раствора предварительно прогретой РНК-азы в буфере 2XSS (4 мкг мл). Флаконы встряхивают 60 мин при комнатной температуре. Отметим, что обработку РНК-азой проводят уже после того, как гибриды были сорбированы на мембранных фильтрах, т. е. после того, как большая часть РНК была удалена [8]. Это существенно, потому что РНК-аза — основной белок, который связывается как с мембранными фильтрами, так и с устойчивой к ее действию частью ( ore), обнаруженной у большинства видов РНК. Радиоактивность, обнаруживаемая на фильтре в результате сорбции на нем РНК-азы, зачастую не позволяет точно определить радиоактивность РНК в гибриде. [c.156]

Гибриды кукурузы на стерильной основе занимают такие большие площади, с которыми не может сравниться ни одна другая-культура. Впервые в нашей стране стерильные растения кукурузы нашел в 1931 г. М. И. Хаджинов. В 1933 г. Родс (США) описал признаки мужской стерильности, обнаруженные им у кукурузы. В 40-х годах в техасском сорте Мексикан Джюн были выделены растения с признаками ЦМС. Этот тип стерильности был назван техасским (Т). В результате селекционной работы он был введен во многие линии и получил широкое распространение. [c.21]

Ткани, в которых помимо А- и В-полипептидов присутствуют и другие, имеют более сложный изоферментный состав. В сперме теплокровных позвоночных синтезируются полипептиды А, В и С. Первые два из них образуют гибриды обычного типа, но полипептид С обнаруживают в экстрактах из спермы обычно в виде гомотетрамера С4, с небольшой примесью гибридов АС или ВС. In vitro, однако, такие гибриды образуются в большом количестве [2981]. Полипептиды Е, А и В, обнаруженные у некоторых рыб, обычно гибридизуются с А- и В-це-пями, так что в тканях некоторых органов рыб присутствует большое число различных тетрамеров [236, 2981]. [c.110]

Рис. 36.10. Метод прогулка по хромосоме . Пусть необходимо обнаружить ген X в рамках протяженного фрагмента ДНК. Точное положение гена неизвестно, однако имеется первичный зонд ( ), соответствующий некоему участку генома (показан в данном случае на 5 -конце исследуемого фрагмента ДНК). Кроме того, имеется библиотека перекрывающихся фрагментов генома. (Для упрощения на рисунке изображены только пять фрагментов.) Первичный зонд гибриди-зуется только с клонами, содержащими фрагмент 1. Этот фрагмент можно использовать далее в качестве зонда для выявления фрагмента 2. Процедура последовательной гибридизации повторяется вплоть до обнаружения фрагмента 4, который гибридизуется с фрагментом 5, содержащим искомый ген X.

Гибриды F подверглись самоопылению, и образовавшиеся семена вновь были высеяны. Так было получено второе поколение гибридов, или р2. среди гибридов F2 обнаружилось расщепление по каждому из признаков появились как круглые, так и морш 1-нистые семена как с желтой, так и с зеленой окраской семядолей как с серой, так и с белой семенной кожурой, и т. д. по всем признакам. Таким образом, у части гибридов F2 вновь появились признаки, не обнаруженные у гибридов F,. Эти признаки названы рецессивными. Соотношение потомков с доминантным проявлением признака и потомков с рецессивным проявлением признака оказалось очень близко к 3/4 1/4. Это соотношение выражает второй закон Менделя, или закон расщепления. [c.25]

Самые низкомолекулярные ДНК, обнаруженные к настоящему времени, содержат только несколько тысяч звеньев, тогда как наиболее крупные достигают длины целых эукариотических хромосом и содержат до 10 звеньев. Известны двухцепочечные молекулы, у которых одной цепью является РНК, а другой — ДНК. Они образуются как промежуточные формы, когда обратная транскриптаза синтезирует ДНК, комплементарную РНК. Такие комплексы возникают на короткое время — по крайней мере в ограниченной области — и при синтезе РНК на ДНК. Гибриды РНК — ДНК легко получаются in vitro путем отжига двух цепей с комплементарными последовательностями. Известно несколько случаев, когда участки РНК и ДНК ковалентно сшиваются с образованием одной цепи. Это происходит при инициации синтеза ДНК обратной транскриптазой, поскольку этот фермент использует РНК-затравку для начала синтеза новой ДНК. [c.156]

Если видоспецифичные гены и существуют, как мы это предполагаем, поскольку рассматриваемые виды экологически и репродуктивно изолированы, то эти гены не попали в случайную выборку из 24 локусов. Таким образом, даже если абсолютное число таких видоспецифичных генов велико, все равно они, вероятно, составляют небольшую долю всего генома, почти наверное меньше 10%. Можно предложить и другое объяснение видоспецифичных генов не существует, а различие между видами обусловлено накоплением количественных различий по частоте аллелей, как в случае локуса эстераза-5. Последняя гипотеза не очень привлекательна, так как при этом предполагается, что видовые различия просто представляют собой очень низкие вероятности полной генетической идентичности особей. Однако с учетом степени обнаруженного внутривидового полиморфизма вероятность идентичности особей в пределах вида уже по существу равна нулю. Например, если взять только 20 наиболее полиморфных генов, известных в настоящее время у человека, вероятность генетической идентичности двух англичан уже сейчас ниже 10- . Скорее всего следует предположить, что D. persimilis и D. pseudoobs ura действительно полностью отличаются друг от друга по определенным локусам, подобным тем, которые обнаружил Добржанский при исследовании стерильности у гибридов между этими видами, но что различия затрагивают только особую часть генома, тогда как большая его часть остается недифференцированной. Открытие значительной генетической гетерогенности внутри электрофоретических классов при изучении тепловой денатурации (см. стр. 177) могло бы существенно изменить это заключение. [c.182]

Наказато использовал этот прием для обнаружения немеченного гибрида РНК—ДНК. Против такого гибрида удается получить антисыворотку кролика. Как обычно для нуклеиновых кислот [Ples ia, 1968], иммунизацию осуществляли его комплексом с метилированным альбумином. Интересно, что полученная анти- [c.285]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология