Макромолекула хроматографировании

Следует отметить, что при хроматографировании макромолекул в условиях Е 1 Е,(р 1 их поведение определяется, главным образом, спецификой гель-проникающей хроматографии, а при [c.64]

При хроматографировании гибкоцепных макромолекул на набухающих сорбентах (гелях) процесс их разделения усложняется. Понятие поры становится условным. Сегменты макромолекул перемешиваются с сегментами геля и проникают в глубь его гранул не только в зависимости от размеров макромолекул, но и от степени их термодинамической совместимости с гелем . [c.123]

Такие макропористые адсорбенты были использованы и для разделения растворимых в воде полимеров — биополимеров (вирусов и фагов) [77]. В этом случае хроматографирования растворов полимера с весьма активными функциональными группами, сильно адсорбирующегося на гидроксилированной поверхности кремнезема из слабее адсорбирующегося растворителя, адсорбцию макромолекул можно снизить путем соответствующего химического модифицирования поверхности сита. Это модифицирование должно, во-первых, заменить или надежно экранировать силанольные группы и возможные активные примесные центры на поверхности макропористых кремнеземов и, во-вторых, сохранить хорошее смачивание сита водными растворами. [c.62]

Различие между водородными и молекулярными связями обусловливает различие в растворимости и реакционной способности целлюлозы и ее производных. Таким образом, линейные цепочки целлюлозы сшиты между собой весьма непрочно и могут разрушаться в процессе хроматографирования различных веществ. Так, например, при пропускании через целлюлозоионитную колонку раствора смеси белков, сорбция белковых молекул происходит не только за счет ионных и полярных связей, но и за счет водородных связей. Возникает своего рода конкуренция за водородные связи между макромолекулами целлюлозы, с одной стороны, и молекулами целлюлозы и белков, с другой. Этим объясняется высокая емкость поглощения ионообменных целлюлоз в процессе сорбции белков и других высокомолекулярных веществ. Макромолекулы целлюлозы могут соединяться между собой также и через обычные валентные связи (глюкозидные и сложноэфирные). [c.62]

Другим фактором, который необходимо учитывать при хроматографировании олигомеров, является их высокая адсорбируемость. Если адсорбционные центры статистически распределены по цепи, то энергия взаимодействия макромолекул с поверхностью сорбента возрастает с ростом ММ, и адсорбция приводит к ухудшению разделения, а в пределе - к разделению по адсорбционному механизму, сопровождающемуся инверсией порядка элюирования. Если же адсорбционные центры сосредоточены на концах макромолекул, то при неизменности энергии адсорбции изменение энергии Гиббса из-за снижения энтропии с уменьшением ММ увеличивается. При этом слабая адсорбция не препятсгвует анализу и, более того, несколько увеличивает селективность в низкомолеьц лярной области. Внешне адсорбционные эффекты проявляются в зависимости формы хроматограмм от полярности растворителя, исключить их удается ггутем гфименения в качестве сорбента органических гелей, а в качестве подвижных фаз -растворителей достаточно высокой полярности. [c.118]

Т. Лорент развил иную трактовку механизма эксклюзии, которая в большей степени соответствует реальной структуре геля. Он считал, что набухший гель можно уподобить раствору полимера. Влияние, которое кислый полисахарид (гиалуроновая кислота) оказывает на седиментацию макромолекул, можно объяснить лишь образованием из полимерных цепей трехмерной сетки, которая действует в отношении макромолекул как молекулярное сито [23]. Если к раствору белка прибавлять высокомолекулярный декстран, то по мере увеличения концентрации полисахарида белок осаждается [24, 25]. Можно представить, что при растворении декстран связывает часть воды за счет гидратации, что приводит к осаждению белка. Фактически в этом случае высокомолекулярный белок осаждается в большей степени, чем низкомолекулярный [24]. В другой серии опытов Лорент [26] сравнивал эксклюзию белков (при равновесном диализе против раствора гиалуроновой кислоты) с их поведением при хроматографировании на геле гиалуроновой кислоты равной концентрации [27]. Расчеты подтвердили предположение, что гиалуроновая кислота (независимо от присутствия поперечных мостиков) образует в водном растворе непрерывную сеть, состоящую из длинных линейных цепей. [c.118]

Когда макромолекулы совершенно не проникают в гранулы геля (/ at, = 0), а соль диффундирует свободно (/ ati=l), различие в объемах выхода равно внутреннему объему колонки (см. гл. П1). Именно этот объем является предельным для того образца, который рассчитывают разделить на данном слое геля. Если же принять во внимание, что диффузия солей редко бывает совершенно свободной (т. е. обычно а зоны в процессе хроматографирования несколько расширяются, то можно прийти к выводу, что объем образца может составлять лишь около 75% внутреннего объема. Это означает, что при работе на сефадексах G-25 и G-50 для того, чтобы обессоливание было полным, объем образца должен составлять менее 40% общего объема колонки. Так и обстоит дело в приведенном примере (фиг. 22, Б). После обессоливания 500 мл сыворотки на сефадексе G-25 (9X60 см, 3 л) объем фракции, содержащей белок, составлял 600 мл [2]. Таким образом, здесь разбавление составило всего 1,2, хотя объем образца был равен лишь 17% объема колонки. [c.138]

Принцип гель-хроматографирования (гель-фильтрации), описанный Олтгелтом и Муром [20], заключается в следующем. Колонка заполняется студнеобразными частицами набухшего в растворителе сшитого полимера, содержащего поры с определенным набором по размерам. Образец полимера, подлежащий фракционированию по молекулярному весу, заливают в виде раствора в колонку и элюируют тем же растворителем. В зависимости от размеров макромолекулы проникают в соответствующие поры студня. Очень крупные молекулы остаются в промежутках между частицами студня и извлекаются с первыми порциями растворителя. Чем меньше размер молекул, тем при большем объеме элюирующей жидкости они будут извлечены из пор студня. [c.239]

Однако некоторые макромолекулы в процессе гель-хроматографирования ведут себя аномально и не подчиняются указанному соотношению. Такие отклонения наблюдались, в частности, при разделении на сефадексе белков с сильно асимметричными молекулами и некоторых гликопротеинов. Как показал Девидсон [10], эти аномалии можно существенно уменьшить или даже избежать их, если вести хроматографирование в диссоциирующей среде 6М раствора гуанидингидрохлорида на сефарозе 6В. [c.390]

Для определения качественного и количественного состава аминокислот белка дрожжей, активного ила и других биомасс предназначен метод, основанный на колориметрическом определении количества каждой аминокислоты, выделенной хромато-графией на бумаге. Мономерные аминокислоты определяют после их экстракции из пробы горячей водой. Полимерные аминокислоты, составляющие макромолекулы белка, предварительно гидролизуют [75]. Для выделения аминокислот проводят нисходящее, многократное хроматографирование двумя растворителями. Проявителем служит слабокислый раствор нингид-рина, который с аминокислотами дает сине-фиолетовое соединение (ДИДА) по уравнению [c.217]

Ионообменную хроматографию белков [20] выполняют на ионообменниках, имеющих гидрофильную матрицу, например на целлюлозе и декстране. Анионообменники, особенно ОЕАЕ-целлюлозу и ОЕАЕ-сефадекс, используют чаще, чем катионооб-менники типа СМ-целлюлозы. Ионообменники на основе целлюлозы имеют открытую сетчатую структуру с ионизованными центрами, легкодоступными для белков. Число ионных связей, образующихся между обменником и белком, зависит не только от используемого материала, но также в большой степени от pH и ионной силы буфера. Эти ионные пары постоянно диссоциируют и образуются вновь, так как ионы элюента конкурируют за центры обмена. Обменники, пригодные для фракционирования белков, имеют низкую плотность зарядов, поэтому число ионных связей между ионитом и отдельными молекулами белка не столь велико, чтобы вообще воспрепятствовать продвижению последних вдоль колонки. Хотя ионные связи постоянно диссоциируют и образуются вновь, в начале хроматографирования белок связывается с ионообменником и не элюируется с колонки. Однако когда концентрация небольших конкурирующих ионов буфера возрастает до такого уровня, что все связи одновременно разрываются, белок начинает двигаться вниз по колонке. Если в процессе разделения используют градиент ионной силы, белок, перемещающийся в стартовой зоне медленнее, чем буфер, элюируется им при увеличении концентрации ионов. Таким образом, элюирующая способность буферного раствора постоянно увеличивается и макромолекула перемещается все быстрее и быстрее. Скорость ее перемещения становится сравнимой со скоростью движения жидкости, когда в элюенте достигается такая концентрация соли, которая эффективно препятствует взаимодействию молекулы белка с обменником. Важное значение в каждом отдельном случае имеет профиль градиента чтобы увеличить разрешение пиков в определенных участках хроматограммы, используемый градиент должен быть сравнительно пологим, но в то же время достаточно крутым в других участках, чтобы избежать уширения пиков. [c.108]

С увеличением степени разбавления уменьшается вероятность интермолекулярных соединений и возрастает число петель в макромолекулах декстрана или количество молекул мостикообразователя, присоединенного только одной функциональной группой. Декстрановые гели проницаемы для очень крупных органических молекул, и степень их проницаемости можно изменять в широких пределах. Это позволяет широко использовать ситовой метод хроматографирования сложных смесей органических веш еств различного молекулярного веса. Даже при сильном набухании гранулы сефадекса сохраняют форму и прочность, что облегчает протекание жидкости по высоким колонкам, заполненным набухшим гелем. Набухший гель может иметь и форму пленки любой толщины, легко смачивающуюся водными растворами. [c.120]

Выбор элюанта. Вещества, совершенно не взаимодействующие с сефадексом, можно элюировать дистиллированной водой. Хроматографирование макромолекул, имеющих обменные группы, лучше проводить при ионной силе элюанта 0,02. Если фракции необходимо лиофилизи-ровать, используют летучие буферы, такие, как бикарбонат или формиат аммония. При обессоливании больших объемов в качестве элюанта можно использовать дистиллированную воду. [c.135]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология