ДСН—ПААГ разделяющий гель

Фрагменты ДНК, полученные тем или иным методом, разделяют с помощью электрофореза в гелях (агарозном, полиакриламидном — ПААГ), из которых их экстрагируют, вырезая соответствующие участки геля, эти участки геля, например агарозного, расплавляют в пробирках при 68°С и ДНК экстрагируют фенолом, затем концентрируют изобутанолом, переосаждают этанолом и проводят анализ выделенных и очищенных фрагментов При не- [c.192]

На стыке гелей ПААГ и агарозы в силу заметного различия степени эндосмоса может иметь место смазывание линий иммунопреципитации и искажение ее картины, поэтому используют специальный метод наложения полосы ПААГ на гель агарозы. Последний формируют из двух частей. У края пластины, который впоследствии будет обращен к катоду, заливают слой геля агарозы без антисыворотки с таким расчетом, чтобы он был на несколько миллиметров шире, чем полоса ПААГ, которую предстоит уложить на этот слой вровень с наружным его краем. Вплотную к пустому слою агарозы на остальной площади пластины слоем такой же толщины формируют гель агарозы в смеси с антисывороткой. Линия раздела двух слоев должна быть параллельна катодному краю пластины и ориентированной по нему полосе ПААГ. Переносить и накладывать эту последнюю на гель агарозы удобно с помощью упомянутой выше тонкой металлической пластинки. Перед наложением пластинку следует повернуть полосой геля к себе, а затем перевернуть гелем вниз и таким образом уложить его на поверхность агарозы. Электродные фитили накладывают на наружный край полосы ПААГ (катодный) и на противоположный край пластины геля агарозы. В ходе электрофореза во втором направлении антигены из ПААГ переходят в гель агарозы и далее мигрируют в ней, образуя пики преципитации. Различие степени эндосмоса в этом случае никаких проблем не создает. [c.151]

На втором этапе трубочка геля, содержащего разделенные белки, снова подвергается электрофорезу, на этот раз в направлении перпендикулярном тому, что на первом этапе. В этом слу чае электрофорез ведут в присутствии ДСН и белки разделяют по их молекулярной массе, как в одномерном ДСН-ПААГ. Исходный гель пропитывают додецил-сульфатом натрия и, поместив его на блок ДСН-ПААГ-геля, проводят электрофорез, в ходе которого каждая из полипептидных цепей мигри- [c.217]

Разделение антигенов в первом направлении путем электрофореза в теле агарозы базируется, в основном, на различии электрических зарядов белков, входящих в состав смеси, так как торможение миграции за счет трения в крупнопористом геле агарозы существенной роли не играет. Между тем, в ряде случаев белки-антигены желательно разделять по их размерам. Для этой цели электрофорез в первом направлении проводят в ПААГ. [c.150]

Вторая особенность электрофореза нуклеиновых кислот и их фрагментов — очень широкий диапазон молекулярных масс. Например, при определении нуклеотидной последовательности ДНК или РНК приходится разделять полученные при их гидролизе олигонуклеотиды, содержащие единицы и десятки мономерных звеньев, т. е. молекулы с массами от тысячи до нескольких сотен тысяч дальтон, а это — тот же диапазон, что для белков и пептидов. Естественно, что электрофорез при этом ведут в ПААГ с концентрацией от 5 до 20%, в зависимости от конкретной задачи. С другой стороны, электрофорез можно успешно использовать для разделения плазмид, крупных рестриктов ДНК и даже целых молекул ДНК или РНК вирусов. В этих случаях электрофорез ведут в гелях агарозы. [c.121]

Преимущества электрофореза в градиенте пористости (концентрации) ПААГ были отмечены в предыдущем разделе при обсуждении фракционирования белков. По-видимому, нет оснований предполагать, что эти преимущества не будут ощутимы и при фракционировании нуклеиновых кислот. Вероятно, лучших результатов можно ожидать в денатурирующих гелях, поскольку гибкость нитей нативных нуклеиновых кислот в обычных гелях может смазывать эффект торможения полос при уменьшении размера пор. [c.142]

Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их диффузии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и вымачивают в смеси кислоты со спиртом так, что белки или нуклеиновые кислоты выпадают в осадок в том самом месте, где закончилась их миграция в ходе электрофореза. После фиксации (или одновременно с ней) проводят окрашивание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно связываюш егося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют. На фотографии окрашенного цилиндрического ПААГ (рис. 2) хорошо видны четкие, узкие полосы разделившихся компонентов исходной смеси белков. [c.5]

Молекулы, разделенные с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, можно электрофоретически перенести на нитроцеллюлозную мембрану, с которой они свяжутся, воспроизведя картину элекрофоретического разделения. Этот процесс называют Вестерн-блоттингом или электроблоттингом [10, 17]. После блоттинга треки стандартного антигена и маркеров мол. массы окрашивают белковым или углеводным красителем, а остальные. инкубируют с образцами антител 9, 18]. С помощью меченых антител выявляют отдельные антигенные полосы (после электрофореза в. восстанавливающих условиях — субъединицы сложных молекул антигенов). Эту стадию называют иммунохимическим окрашиванием. В полном варианте метода используют как исключительную способность электрофореза в ПААГ разделять молекулы, концентрации которых очень малы, так и свойство антител выявлять специфические антигенные компоненты. Таким образом, метод чаще всего применяют для определения состава и молекулярных размеров антигенов, но, кроме того, он очень эффективен для определения специфичности антител (в частности, МКА) и поиска антигенно родственных молекул в однотипных или раз-лич.ных антигенных препаратах (например, различные виды бактерий, вирусные мутанты, клеточные экстракты и т. д.). [c.230]

Зоны, представляющие интерес, вырезают и белок выделяют экстракцией [49, 64] или элюированием в условиях электрофореза [2, 175]. При определении аминокислотного состава приготовленных таким способом образцов обязательно вводят необходимые поправки, учитывающие присутствие акриламид-ного геля [26]. Согласно другому варианту, белки разделяют электрофорезом в блоке акриламидного геля, при этом под действием электрического поля белковые фракции попадают в проточную камеру, откуда и вымываются раздельно потоком элюэнта. Ход элюирования регистрируют с помощью проточного денситометра, элюат собирают на фракционном коллекторе. Недавно разработана методика элюирования белков из системы ПААГ —ДСН в промежуточный гель с использованием восходящего электрофореза [121]. Выход достигается высокий, однако образец может содержать примеси компонентов акриламидного геля и буферной системы. Гели для препаративного электрофореза могут иметь форму столбиков (LKB) или пластин (блоков) (Biorad). Для разделений по описанной методике 1 сп()льзуют различную аппаратуру, выпускаемую фирмами. [c.39]

Важное достоинство ГФ-секвенатора заключается в том, что с его помощью можно проводить анализ малых количеств белка, нанесенного в присутствии ДСН. Высокая разрешаюндая способность ДСН—ПААГ-электрофореза делает этот метод мощным средством выделения в чистом виде труднодоступных белков из сложных смесей, обогащенных многими белками. В данном разделе описаны в деталях оригинальные методики, используемые для анализа последовательности белков, присутствующих в ДСН-гелях лишь в пикомольных количествах. [c.471]

Интересный подход при ИЭФ щелочных белков сыворотки был развит недавно Томасом и Ходсом. Его можно назвать двухстадийным процессом ИЭФ. На первой стадии в пластине ПААГ в присутствии 4 М мочевины и 15% глицерина формировали щирокий и нелинейный градиент pH за счет следующей комбинации амфолитов 0,6% pH 9—11+0,4% pH 7—9-Ь0,2% pH 3,5—10. На большую часть пластины геля при этом ложился диапазон pH 8,5—10,5, где и оказывались интересующие авторов щелочные белки. Однако разделялись они плохо, так как основное падение напряжения приходилось на прилегавшую к аноду часть пластины геля, где располагались амфолиты нейтральной области pH, отличающиеся худшей электропроводностью. Туда же собирались и кислые белки сыворотки. Этот процесс занимал 3—4 ч. Для осуществления второй стадии фракционирования примерно треть прилегающей к аноду части геля вместе с находящимися в ней нейтральными амфолитами и кислыми белками отрезали бритвой и отбрасывали. Ленту анода переносили на новый конец геля и возобновляли электрофокусирование. Теперь все напряжение источника ложилось на нужную область pH и осуществлялось эффективное фокусирование щелочных белков [Thomas, Hodes, 1978]. [c.33]

Во втором направлении белки разделяли ступенчатым электрофорезом в пластине ПААГ размером 13X14 см и толщиной 0,8 мм. В качестве рабочего геля до уровня на 2,5 см ниже верхнего края пластины полимеризовали экспоненциальный градиент (5—22,5%) ПААГ в 0,375 М Трис-НС1 (pH 8,8) с добавлением 0,1% ДДС-Na, стабилизированный глицерином. Формирующий гель представлял собой 4,75%-ный ПААГ, полимеризованный в 0,125 М Трис-НС1 (pH 6,8) с 0,1% ДДС-Na. Клиновидную полость над пластиной для помещения в нее цилиндри-, ка геля первого направления формировали так, как это принято делать при двумерном электрофорезе [Остерман, 1981]. Эту полость заполняли расплавленным 1%-ным раствором агарозы в том же буфере, а затем закладывали в нее цилиндрик геля. В качестве верхнего электродного буфера использовали, как обычно при электрофорезе по Лэммли, раствор, содержащий 0,025 М Трис, 0,192 М глицин и 0,1 % ДДС-Na (pH 8,3) с добавлением бромфенолового синего в качестве лидирующего красителя. Электрофорез длился 5 ч при силе тока 20 мА. За это время полоса красителя достигала нижнего края пластины. Для окрашивания белков после электрофореза использовали 0,1%-ный раствор СВВ R-250 в 50%-ной ТХУ. Перед авторадиографией гель высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой от суток до месяца в зависимости от исходной радиоактивности препарата и необходимости выявления слабых пятен. Прн этом следует иметь в виду, что при увеличении продолжительности экспозиции увеличивается и размер каждого пятна — примерно вдвое при 10-кратном удлинении экспозиции. Соответственно может ухудшаться разрешение близко лежащих пятен. [c.47]

Этот метод количественного двумерного, или, как его чаще называют, перекрестного иммунозлектрофореза является комбинацией рассмотренных выше методов [ larke, Freeman, 1967]. Сначала в первом направлении смесь белков-антигенов разделяют обычным электрофорезом в агарозе (или ПААГ). Затем следует электрофоретическая миграция разделившихся антигенов в перпендикулярном (втором) направлении. Миграция идет в геле агарозы, смешанной с полифункциональной антисывороткой против исходной смеси антигенов. Каждый белок-антиген во втором направлении мигрирует независимо от других и образует зоны преципитации, подобные ракетам Лорелла , но более широкие у основания и напоминающие обычные хроматографические пики. Эта форма пиков обусловлена тем, что миграция начинается не из резко очерченной лунки, заполненной одинаковым по всему ее объему раствором антигена, а из более или менее размытой белковой зоны, образовавшейся в результате электрофореза в первом направлении. [c.144]

Щелочные белки рибосом удается разделять не только в кислых, но и в слегка щелочных условиях, например в Трис-борат-ном буфере, pH 8,7. Электрофорез проводят в 4%-ном ПААГ [Howard, Traut, 1973]. Исходный белковый препарат полимеризуют в геле с мочевиной на середине высоты трубки. Вблизи из0-электрической точки часть рибосомальных белков оказывается заряженной отрицательно, а, другая — положительно. Миграция в электрическом поле идет в обе стороны, к катоду и аноду. Щелочные белки рибосом при pH 8,7 растворяются с трудом и только в присутствии 6 М мочевины, которую вводят также и в бу фер геля. [c.56]

Так, для разделения плазмид и их крупных рестриктов использовали 0,8%-ный гель агарозы, а в некоторых случаях и 3,5%-ный ПААГ, полимеризованные в 0,089 М Трис-боратном буфере (pH 8,5) с 2,5 мМ ЭДТА [Smith et al., 1979]. В таком же буфере, но в 1,4%-ном геле агарозы, разделяли рестрикты ДНК фага X с целью обследования бактериальных экстрактов на наличие в них рестриктаз. Бромистый этидий (1 мкг/мл) вводили в гель еще при его полимеризации [Lui et al., 1979]. [c.127]

Шуерх и соавторы обнаружили, что оптимальное фракционирование двунитевых РНК реовируса в интервале молекулярных д сс от 0,3 до 3 млн. получается в 7,5%-ном ПААГ (С=2,6). Однонитевые РНК в том же диапазоне молекулярных масс лучше разделять в смешанном геле (1,8%-ный ПААГ с 0,6% агарозы и добавлением мочевины до 6 М) (S huer h et al., 1975]. В последнем случае электрофорез приходилось вести в трубках из стекла Perspex , вымоченных в течение ночи в 1%-ном ДДС-Na и промытых перед использованием стерильной водой (лишенной РНКаз), так как обычное стекло плохо сцепляется с гелем столь малой концентрации. [c.128]

Определение видовой специфичности необходимо для выявления в культуре примесных клеток, а также для анализа процессов, происходящих при культивировании клеток и при создании клеточных гибридов. Эта задача может быть решена с помощью изофермент-ного анализа [1]. По принятому сейчас определению, изоферментами являются ферменты с одинаковой субстратной специфичностью, которые представляют собой результат экспрессии одного или нескольких структурных генов, имеющихся в геноме вида. Изоферменты могут отличаться друг от друга по своим физико-химическим параметрам, например по заряду, что позволяет разделять их с помощью электрофореза (ЭФ) в крахмальном, агарозном или полиакриламидном (ПААГ) гелях [2] (подробно об ЭФ см. [3, 4]). В данном сообщении основное внимание уделено методам ЭФ и последующего анализа спектра изоферментов применительно к проблемам типиро-вания клеточных культур. Процедура состоит из следующих этапов [c.98]

Недавно появилось сообщение об еще одной попытке преодолеть указанные трудности. Препаративное фракционирование белков вели в кольцевом 2,3%-ном ПААГ с ДДС-Na. Диализную мембрану, отделяющую камеру элюции от нижнего электродного резервуара, заменили слоем 10%-ного ПААГ. Во избежание сползания рабочего геля в камеру элюирующий буфер в нее подавался под гидростатическим давлением, уравновешивающим вес геля, а скорость элюции задавалась перистальтическим насосом, стоящим на выходе из камеры. Сама камера имела форму незамкнутого кольца. Элюирующий буфер подавался с одного ее конца и выходил с другого. Сообщается о хорошем разделе- [c.116]

Смотреть страницы где упоминается термин ДСН—ПААГ разделяющий гель: [c.24] [c.221] [c.38] [c.434] [c.100] [c.54] [c.73] [c.80] [c.81] [c.82] [c.116] [c.122] [c.137] [c.143] [c.144] [c.145] [c.161] [c.73] [c.80] [c.81] [c.62]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология