Моноклональные антитела выделение

Чувствительность в определении единичных аминокислотных замен в случае моноклональных антител значительно выше по сравнению с антисывороткой и позволяет использовать моноклональные антитела даже для детекции тонких конформационных изменений молекулы белка. Благодаря высокой чувствительности, с которой моноклональные антитела определяют антигенные детерминанты, их можно использовать для точного установления границ и структуры детерминант, а также для идентификации и выделения чистых специфических пептидных фрагментов антигена. [c.306]

Такие продукты, как интерферон, моноклональные антитела, антигены, вирусы и гормоны, могут извлекаться как непрерывным, так и периодическим способом. Были исследованы процессы с применением мембранных реакторов, в которых использовались панкреатические клетки для синтеза инсулина, а также для получения других белковых гормонов и энзимов. Периодический способ давно применялся для выращивания бактерий и дрожжевых клеток ферментацией. Основной стадией непрерывной ферментации является выделение токсичных продуктов. Легче всего эта операция осуществляется путем рециркуляции клеток через блок полых волокон [26]. [c.96]

Для наработки моноклональных антител надо индуцировать сильный иммунный ответ. Для этого необходимы достаточно большие количества иммуногена. Выделение же больших коли честв нативного белка не всегда представляется возможным. Однако клонирование гена в подходящем бактериальном экспрессирующем векторе способно обеспечить повышенное образование кодируемого белка, делает возможным использование очищенного белка в качестве иммуногена. Такая система позволяет клонировать определенные фрагменты меньшего размера, входящие в состав гена известного белка, или, наконец, откры- [c.171]

СЯ, поскольку будут отбираться моноклональные антитела только к эпитопам, свойственным продуктам клонированной вставки. Выделение растворимых гибридных белков детально рассматривается в предыдущей главе. [c.181]

Сеть спектрина расположена на некотором расстоянии от мембраны, но с ней связана. Латеральная подвижность интегральных белков мембраны зависит от присутствия спектрина. При обработке тканей химотрипсином был выделен белок с массой 72 кДа, который ингибировал взаимодействие спектрина с обедненной этим белком мембраной. С помощью моноклональных антител показано, что 72 кДа белок принадлежит полосе 2,1 его назвали анке-рином. [c.57]

Своеобразие рассматриваемых процессов состоит также в том, что. конечный продукт, находящийся первоначально в очень сложной смеси растворенных в воде веществ, должен быть получен со степенью чистоты, определяемой его последующим применением, т. е. с чистотой фармакопейных препаратов. Такая задача была бы крайне трудной, если бы не возможность использования специфических антител. Действительно, промышленное производство моноклональных антител из культур клеток, полученных методами клеточной инженерии (гибридомная техника), оказалось тем биотехнологическим производством, которое дало гигантский эффект в методах выделения особо чистых биопрепаратов. Иммобилизация моноклональных антител,. специфическим антигеном которых является, например, аг-интерферон, позволяет выделять последний в чистом виде из жидких смесей любого состава, пропуская их через колонку, в которой целевой продукт задерживается на твердом носителе, несущем антитело, а все остальные компоненты раствора, не дающие реакции антиген—антитело , проходят неизменными. После промывки комплекс интерферона с антителом легко разрушается и продукт получается в чистом виде. [c.28]

Эффективность применения моноклональных антител может быть продемонстрирована на примере выделения общего лейкоцитарного антигена (L- -антигена) тимоцитов крысы [7]. На первом этапе с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном лектине чечевицы и гель-фильтрации в присутствии дезоксихолата получают частично очищенный препарат мембранного гликопротеина тимоцитов с молекулярной массой [c.188]

Проблема получения специфических антител при отсутствии чистого антигена была решена с разработкой технологии получения моноклональных антител (МКА) [9], позволяющей выделять антитела к индивидуальным компонентам любой сложной смеси антигенов [10]. Очень скоро МКА были использованы в аффинной хроматографии — вначале для очистки антигенов клеточной поверхности [И, 12], а затем для выделения множества других белков [13, 14]. [c.165]

Этот антиген содержится в лейкоцитах и эндотелиальных клетках [33] и особенно интересен тем, что на его примере проиллюстрирована процедура выделения антигенов из двух типов тканей, а именно из селезенки и мозга. Кроме того, пример выделения ОХ-45 из мозговой ткани крысы, где антиген сосредоточен в основном в эндотелии капилляров, показывает, какой высокой степени очистки можно достичь с помощью аффинной хроматографии на моноклональных антителах. [c.180]

Использование моноклональных антител, выделенных и асцитной жидкости или культуральной среды, существенно облегчает получение подклассов IgG мыши. Значительно более-высокая концентрация Ig олределенного изотипа в сочетании с гомогенностью белка позволяет с помощью протеина А получать иммуноглобулины высокой чистоты. [c.110]

На иммунизацию организм отвечает синтезом очень неоднородной популяции антител, молекулы к-рых могут сильно отличаться друг от друга по сродству к антигену. Такая неоднородность объясняется участием в иммунном ответе очень большой популяции В-лимфоцитов, каждый из к-рых синтезирует лишь одну разновидность молекул антител. С помощью техники гибридом (гибридные клетки, получаемые слиянием злокачественных и нормальных анти-телобразующих клеток лимфоцитов) удается получить в больших кол-вах однородные моноклональные антитела, к-рые широко используют в качестве высокоспецифич. реагентов для обнаружения, локализации и выделения разл. в-в, а также для диагностики и лечения нек-рых заболеваний. Гомог. И. накапливаются в больших кол-вах в крови и моче больных при ряде злокачеств. поражений лимфоцитов (т. наз. миеломные И.). [c.217]

Растения дают большое количество биомассы, а выращивание их не составляет труда, поэтому разумно было попытаться создать трансгенные растения, способные синтезировать коммерчески ценные белки и химикаты. В отличие от рекомбинантных бактерий, которых культивируют в больших биореакторах (при этом необходимы высококвалифицированный персонал и дорогостоящее оборудование), для выращивания сельскохозяйственных культур не нужно больших средств и квалифицированных рабочих. Основная проблема, которая может возникнуть при использовании растений в качестве биореакторов, будет связана с выделением продукта введенного гена из массы растительной ткани и сравнительной стоимостью производства нужного белка с помощью трансгенных растений и микроорганизмов. Уже созданы экспериментальные установки по получению с помощью растений моноклональных антител, функциональных фрагментов антител и полимера поли-Р-гидроксибутира-та, из которого можно изготавливать материал, подверженный биодеградации. [c.412]

Новые возможности для специфичного выделения отдельных фрагментов белка открылись а связи с разработкой техники моноклональных антител (рис. 15). Иммуносорбенты на основе моноклональных антител к различным участкам белковой молекулы могут быть использованы для селектианого выделения пептидных фрагментов, несущих антигенные детерминанты этих антител. Поскольку в основном антигенные детерминанты находятся во фрагментах полипептидной цепи, располагающихся на поверхности глобулы, метод применяется также для изучения топографии белков. [c.56]

Применение моноклональных антител. Практическое использование МкАТ исключительно многообразное — в медицине И ветеринарии (в целях диагностики, терапии), в биотехнологии для получения, выделения и очистки специфических продуктов, в исследованиях фундаментальных и прикладных проблем. Так, например, стволовые клетки костного мозга не обладают какими- [c.579]

Астат-211. Альфа-излучатель At (Т[/2 = 7,2 ч ЭЗ 58,3%, а 41,7% основные 7-кванты с = 92,4 кэВ (2,3%) 687,0 кэВ (0,25%) Еа = = 5,866 МэВ), изотоп пятого, самого тяжёлого элемента в группе галогенов, относится к числу немногих нейтронодефицитных изотопов, применяемых в радиотерапии. У астата нет стабильных изотопов, а радиоактивные изотопы имеют короткие периоды полураспада (самый большой Т1/2 = 8,3 ч у At). Поэтому исследование химических свойств этого элемента происходит на уровне ультрамикроколичеств, что требует исключительной аккуратности в создании определённых экспериментальных условий и их стабильности во времени с учётом того факта, что астат имеет несколько устойчивых валентных состояний, как аналог йода. Всё это привело исследователей к открытию целого ряда новых свойств элемента, на основе которых были разработаны методы выделения ультрамикроколичеств At из сложных смесей продуктов ядерных реакций и синтеза ряда неорганических и органических соединений астата [19]. В последнее время было показано, что перспективными для применения в радиотерапии по своим свойствам могут быть такие препараты с At как метиленовый голубой, моноклональные антитела (МКАТ), коллоидный металлический Те (размер зёрен 3-5 мкм) с сорбированным At [19, 20]. [c.356]

Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимые агрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибридной технологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]

В распоряжении исследователя имеется охарактеризованная кДНК, но ему требуются антитела, поскольку 1) нужный белок содержится в клетке в небольшом количестве или его трудно очистить, 2) либо необходимо получить антисыворотку, специфичную к определенному участку или субъединице данного белка. Последний подход обладает значительно большей избирательностью, чем скрининг группы моноклональных антител, и гораздо проще, чем выделение пептидных фрагментов путем ферментативного или химического расщепления. [c.142]

Линии клеток, продуцирующих моноклональные антитела, обычно получают от грызунов, например мышей и крыс, дающих хороший иммунный ответ на иммуноген. Готовят суспензию клеток селезенки этих животных и вызывают их слияние с мие-ломными клетками. Полученные в результате слияния клетки обладают свойствами и тех, и других родительских клеток, сочетая в себе способность к неограниченному размножению, свой-ствеипую миеломным родительским клеткам, со способностью продуцировать специфические антитела, присущей В-лимфоци-там селезенки. Выделение клона клеток, продуцирующих одно антитело, позволяет нарабатывать эти моноклональные антитела в больших количествах. [c.180]

Выделение гибридных белков, содержащих -галактозида-зу, было детально описано в предыдущей главе. Для иммунизации мышей требуются относительно небольшие количества антигена, поэтому его можно наработать любым методом. Хотя белковый материал, полученный в результате препаративного ДСН-электрофореза в ПААГ, не всегда обладает такими имму-ногенными свойствами, которые присущи большинству нативных препаратов, он имеет то преимущество, что вызываемый им иммунный ответ обусловлен устойчивыми к денатурации эпитопами. Используемый нами метод выделения нерастворимых гибридных белков приведен в табл. 6.4. Моноклональные антитела к таким эпитопам часто удается с успехом использовать в последующем детальном иммунохимическом анализе белковых антигенов. Наличие абсолютно чистого иммуногена не требует- [c.180]

Головки NA семи таких вариантов штамма А/Токуо/3/67,, селекционированные с различными моноклональными антителами к NA, изучены с целью выявления изменений аминокислотных последовательностей. У четырех из них было обнаружено одно изменение псоледовательности (аргинин в положении 344 на изолейцин), в другом варианте остаток аспарагина в положении 221 заменился на гистидин, а в третьем лизин в положении 368 — на глутаминовую кислоту. Это последнее изменение произошло также в полевых штаммах, выделенных в 1972 и 1975 гг. В седьмом моноклональном варианте изменения не было обнаружено оно могло быть расположено в нерастворимом участке. [c.145]

Относительно мала информация об антигенном дрейфе в NA вирусов гриппа животных и птиц. Известен антигенный дрейф среди вирусов гриппа свиней [52]. Анализ вирусов гриппа птиц с нейраминидазой N2 с использованием набора моноклональных антител к N2 человека показал, что все штаммы птиц были родственны штамму A/Jарап/305/57 человека [116]. Некоторые антигенные вариации были различимы в штаммах N2 птиц, выделенных в 1965—1981 гг., но не было постепенного антигенного дрейфа, подобного тому, что обнаружено у штаммов вирусов гриппа человека. Результаты указывают на то, что множество различных штаммов того же подтипа существуют одновременно и персистп-руют в популяции птиц. Последовательности первых 200— 300 нуклеотидов 5 -концов кДНК, транскрибированных с генов NA 20 вирусов птиц восьми из девяти подтипов NA, также не обнару- [c.146]

Эти исследования были продолжены с моноклональными антителами к НА вируса гриппа В/Оге оп/5/80 [40]. Большинство из 20 моноклональных антител не ингибировало вирусы гриппа В, выделенные до 1970 г., хотя некоторые препараты выявляли одну общую детерминанту между вирусами В/Ьее/40 и В/Оге/80. Большинство моноклональных антител к В/Оге/80 реагировало с вирусом B/Sing/222/79, но отмечались некоторые отличия. При изучении более 50 штаммов вируса гриппа В, выделенных после 1975 г., было показано, что 20 моноклональных антител выявляют 13 различных картин реактивности в РТГА, указывая тем самым, что большая часть антител индуцирована различными эпитопами на вирусе В/Оге/80. [c.284]

В 1982 г. во многих странах мира были зарегистрированы эпидемии гриппа В. Особенно тяжело они протекали в Японии и Англии. Анализ недавно полученных изолятов из этих стран показал, что там циркулировали антигенные варианты, которые реагировали только с одним или двумя из 13 анти-В/Оге/80 моноклональных антител (т. е. B/Eng/19/82 и B/Shiga/75/82). Это свидетельствовало, что в них произошел антигенный дрейф. С другой стороны, остальные изоляты из этих же эпидемий обладали 10 из 13 эпитопов. Предварительные исследования дали основания полагать, что большинство вирусов гриппа В, выделенных в Японии и Англии в 1982 г., реагирует только с ограниченным количеством моноклональных антител, в то время как большинство изолятов из США реагирует с гораздо более широким набором моноклональных антител. [c.284]

Иммунологические методы пгароко используются для идентификации мембранных компонентов, их локализации, оценки количества, выделения. Это методы получения поликлональных и моноклональных антител к компонентам мембран, иммуно-блоттинг (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата на рия с перенесением разделенных белков на нитроцеллюлозные фильтры для последуюп] его выявления с по- [c.202]

Полностью процедура получения моноклональных антител включает в себя следующие этапы (рис. 43) иммунизация животных, подготовка клеток к слиянию, слияние, отбор продуцирующих специфические антитела клонов, клонирование и реклонирование, массовая наработка гибридомных клеток, получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела, и выделение этих антител. Обычно вся процедура от момента начала иммунизации до выделения антител занимает 3—4 мес. [c.96]

На первом этапе работы от мышей, иммунизированных опеределенным антигеном (АГ), получали суммарную, недифференцированную популяцию Т-клеток, содержащую самые различные клоны (на рис. цифры 1 -6). Второй этап состоял в выделении отдельных клонов Т-клеток, среди которых были и специфичные к использованному антигену (на рис. в качестве примера приведено четыре клона, один из которых — клон 3, — специфически реагирует с антигеном). Третий этап работы включал получение моноклональных антител (мАТ) к антигенреактивно-му клону. Задача этого этапа — получение моноклональных антител, способных реагировать только с клоном, использованным для иммунизации. В то же время перекрестная реакция мАТ говорит об общей специфике антигенреактивного клона и непримированных клонов (верхняя таблица). Отсутствие перекрестной реактивности мАТ указывает на наличие у положительно реагирующего примирован-ного клона особой специфичности — предположительно, антигенраспознающего рецептора. Подтверждением подобного предположения является реакция задержки взаимодействия мАТ с соответствующим клоном в присутствии использованного антигена (нижняя таблица). Получение мАТ к антигенраспознающему рецептору Т-клеток создало условия для его полноценного изучения [c.101]

Для понимания многих биологических явлений необходимо выделение субпопуляций клеток, находящихся на различных стадиях дифференцировки и в различных формах специализации. Разделение клеток особенно важно для изучения иммунной системы, состоящей из множества клеток, обладающих специфическими фенотипами и функциями. Основные методы основываются на наличии специфических компонентов на поверхности выделяемых клеток, например рецепторов лектинов, антигенов, иммуноглобулинов. Их развитию в большой степени способствовала возможность получения моноклональных антител против детерминант клеточной поверхности. [c.243]

Выделение подгрупп Т-лимфоцитов человека, покрытых специфическими моноклональными антителами (ОКТ4, ОКТв) [c.244]

Розеточные методы [4—8] фиксация антимышиных иммуноглобулинов на эритроцитах быка (с помощью хлорида хрома) и обработка в розетках выделяемыми клетками, предварительно покрытыми специфическими моноклональными антителами (продуцируемыми мышиной гибридомой) выделение связавшихся клеток достигается селективным лизисом эритроцитов. [c.247]

Предварительные результаты подтверждают, что процесс, заключающийся в иммобилизации антител против иммуноглобулинов мыши на мерсалил-трисакриле и выделении клеток, предварительно покрытых специфическими моноклональными антителами мыши, может применяться как общий метод. Этот процесс, уже использованный в чашечных методиках , требует лишь небольших количеств указанных моноклональных антител (Бонафо и др., неопубликованные данные). Этот метод имеет хорошие перспективы использования для разделения подгрупп специфических клеток и выделения антигенспецифических лимфоцитов. [c.259]

Высокая специфичность моноклональных антител позволяет создать иммуноферментные диагностику мы для определения антигенов, которые имеются в ограниченных количествах или же недоступны в очищенном состоянии. В таких случаях для иммунизации животных и получения гибридом может быть использован препарат, содержащий около 1 % антигена. Высокоочищенный антиген необходим на стадии тестирования гибридом однако при наличии высокочувствительного метода определения нужные количества антигена исчисляются несколькими микрограммами. После получения гибридомы антиген может быть выделен методом аффинной хроматографии на моноклональных антителах. Полученный в вы-сокоочищенном состоянии в значительных количествах антиген в дальнейшем может быть использован в составе иммуноферментных диагностикумов. [c.170]

Выделенне антител. По завершении ферментации получают раствор, содержащий активные растворенные моноклональные антитела, отработанную питательную среду, цельные клетки и большое количество продуктов их деградации. При очистке антител сначала удаляют твердые примеси. Для этой, цели культуральную жидкость или фильтруют (до 100 л в одной операции), или, чаще, подвергают непрерывному проточному центрифугированию. Эффективность последнего процесса может быть существенно повышена за счет использования агентов, ускоряющих флокуляцию клеток и их фрагментов. В этом отношении наиболее эффективной оказалась полигалактуроновая кислота [37 ]. [c.46]

Во-первых, в зависимости от области применения существует возможность выбора наиболее подходящего и удобного источника получения моноклональных антител культуральной или асцитной жидкости. При использовании препаратов асцитной жидкости возникают определенные трудности при интерпретации полученных результатов, обусловленные примесью естественных мышиных антител к моноклональным антителам (высокие фоновые уровни). Однако в 1 мл асцитной жидкости содержится несколько мг МКА. Поэтому, когда используют разведение 1 1000 или более, значительная часть посторонних мышиных антител удаляется разбавлением. Иногда необходимо полностью удалить из препарата примесь естественных иммуноглобулинов (например, при использовании моноклональных антител для выделения и очистки небольшого количества белкового антигена с целью биохимического анализа). В последнем случае предпочтительно выделять моноклональные антитела из культуральной жидкости. При использовании в иммунологических реакциях асцитной жидкости следует иметь в виду присутствие посторонних фоновых антител. В некоторых случаях в организме мыши может существовать высокий титр природных антител, реагирующих с антигеном, специфически распознаваемым моноклональными антителами. При использовании асцитной жидкости возникают и проблемы неспецифического характера. Например, культуральная жидкость дает более ясное и точное окрашивание образца в иммуногистологических исследованиях. [c.148]