Денатурация и гибридизация

Рис. 4.13. Скрининг библиотеки геномной ДНК с применением меченого зонда. Клетки после трансформации высевают на твердую питательную среду, обеспечивающую рост только трансформированных клеток. 1. Переносят клетки из каждой выросшей колонии на твердую подложку (например, нитроцеллюлозный или найлоновый фильр) так, чтобы их расположение соответствовало таковому на чащке. 2. Клетки лизируют, высвободившуюся ДНК подвергают денатурации и депротеинизации и фиксируют на фильтре. 3. На фильтр наносят меченый ДНК-зонд и проводят гибридизацию. Смывают с фильтра негибридизовавшийся зонд и проводят радиоавтографию с тем чтобы определить, какие клетки содержат меченый ДНК-зонд. 4. Идентифицируют на чашке колонии, содержащие искомую ДНК (положительный гибридизационный сигнал), отбирают из них материал и культивируют.

Так как при денатурации нуклеиновых кислот их первичная структура сохраняется, то данный процесс может иметь обратимый характер. На способности нуклеиновых кислот восстанавливать свою нативную конформацию после денатурации (ренативация) основан чрезвычайно важный метод определения степени гомологичности, или родственности, нуклеиновых кислот. Этот метод называют молекулярной гибридизацией. Сущность этого метода (рис. 8.15) сводится к следующему сначала смешиваются растворы ДНК, вьщеленных из организмов разного вида (например, лягушки и кролика) затем эти растворы нагревают (для денатурации ДНК), а потом охлаждают. При этом возникают двухспиральные структуры разного состава наряду с двухспиральными молекулами, идентичными исходным ДНК, могут образовываться гибридные ДНК, содер- [c.283]

Дот-блот гибридизация РНК проводится практически по той же схеме, но для денатурации РНК используют глиоксаль или формальдегид, а гибридизацию проводят при 42 °С. [c.97]

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР-амплификации Более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13, -сайт-специфический мутагенез в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Один из вариантов этого подхода состоит в следующем. Ген-мишень встраивают в плазмидный вектор (рис. 8.4) и помещают препарат в две пробирки. В каждую из них добавляют по два специфических праймера для ПЦР 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 - в другую. Праймеры 2 и 3 полностью комплементарны одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, а 1 и 3 комплементарны другому участку, но содержат один некомплементарный нуклеотид и гибридизуются с разными цепями, так что в результате происходит замена обоих нуклеотидов данной пары. Положение сайтов гибридизации праймеров 1 и 2 в одной пробирке и 3 и 4 - в другой таково, что ПЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатура-цию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из двух пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевьгх молекул с [c.163]

Ранее П. Доти (США) и его сотрудники показали, что двойную спираль ДНК можно расплетать или денатурировать, применяя различные воздействия (повышение температуры, изменение pH и др.). В то же время, если инкубировать денатурированную одноцепочечную ДНК при температуре ниже той, которая вызывает денатурацию, комплементарные цепи реагируют между собою, вновь образуя двойную спираль, — происходит ренатурация ДНК. Если к ДНК добавить комплементарную РНК, может происходитьобразование гибридов ДНК—РНК — гибридизация, которая в дальнейшем стала одним из мощнейших методов изучения нуклеиновых кислот, позволяя выявлять комплементарные молекулы. [c.20]

Опыты по гибридизации позволили исследовать гомологичность нуклеиновых кислот из разных источников. Вначале молекулы расщепляют (например, с помощью ультразвука) на фрагменты длиной 1000 нуклеотидов и подвергают денатурации. Фрагменты денатурированной ДНК смешивают с денатурированной ДНК из другого источника. Участки ДНК разных видов, имеющие близкие нуклеотидные последовательности, в той или иной степени гибридизуются, тогда как участки с сильно различающимися последовательностями гибридизации не поддаются. Рассмотрим один из вариантов постановки таких экспериментов. Денатурированную ДНК определенного организма, не подвергавшуюся деградации, заключают в агаровый гель [90] или наносят на нитроцеллюлозный фильтр [91]. Фрагменты ДНК из другого источника пропускают через колонку с ДНК-содержащим агаром или через фильтр с абсорбированной ДНК. Комплементарное спаривание соответствующих фрагментов задерживает их на колонке или фильтре, тогда как фрагменты, не нашедшие себе партнеров , свободно проходят дальше. [c.143]

Процедура ДНК-гибридизации состоит в следующем. ДНК-мишень подвергают денатурации и одноцепочечные молекулы необратимо пришивают к твердой подложке (нитроцеллюлоз-ному или найлоновому фильтру). Эту процедуру обычно проводят при высокой температуре. Затем фильтр инкубируют с одноцепочечным ДНК-зондом, меченным радиоизотопом или другой меткой. Если нуклеотидные последовательности зонда и ДНК-мишени комплементарны, то происходит их спаривание (т. е. гибридизация) (рис. 4.11). Гибридные молекулы можно [c.65]

Различия в высшей структуре нуклеиновых кислот легко обнаруживаются по гиперхромному эффекту после тепловой или химической денатурации или после химического или ферментативного гидролиза. Важную информацию можно также получить при помощи других аналитических методов о гетерогенности по мол. массам, химическом составе и размерах молекул — методами ультрацентрифугирования [19, 35], о соответствии (комплементарности) первичной последовательности в двух полинуклеотидах— методами гибридизации [36, 37], о размерах и [c.68]

Если можно получить радиоактивно меченые молекулы белков, как, например, в случае бактерий, то для изучения четвертичной структуры можно использовать метод гибридизации. При денатурации, приводящей к обратимой диссоциации белковых молекул на субъединицы, можно получить гибриды тяжелых и легких молекул и разделить затем эти гибриды центрифугированием в градиенте плотности. Число субъединиц, появляющихся при денатурации, можно установить непосредственно по различиям плотностей гибридных тяжелых и легких молекул. [c.402]

ДНК/ДНК-гибридизация гомологичные последовательности нуклеотидов в ДНК разных видов. Как мы уже говорили, при нагревании изолированной ДНК две полинуклеотидные цепи расходятся в результате разрыва водородных связей. Такая денатурация (или плавление ), приводящая к образованию одиночных цепей, обратима при очень медленном охлаждении препарата будет происходить спаривание и реассоциация комплементарных участков. Если смешать короткие фрагменты денатурированных ДНК, полученных из двух различных, но близких между собой видов бактерий, при температуре выше точки их плавления и затем медленно охладить смесь, тоже будет происходить реассоциация. Двойные спирали, образовавшиеся из одиночных цепей ДНК двух разных организмов, называют гетеродуплексными молекулами. Для того чтобы в эксперименте можно было проследить за образованием гетеродуплексов, нужно, конечно, пометить ДНК одной из бактерий тяжелым или радиоактивным изотопом. [c.41]

Рис. 8.4. Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР. Реакцию проводят в двух пробирках, в каждой из которых содержится одинаковая двухцепочечная плазмидная ДНК, но разные наборы праймеров. Праймеры 1 и 3 содержат один неспаривающийся нуклеотид и комплементарны разным цепям плазмидной ДНК. Праймеры 2 и 4 полностью комплементарны соответствующим участкам плазмидной ДНК и тоже гибридизуются с разными цепями. Положение сайтов гибридизации для праймеров каждой пары различается, но их концы стыкуются. В результате ПЦР-амплификации образуются линейные молекулы. По окончании реакции содержимое пробирок смещивают и проводят денатурацию, а затем ренатурацию. В результате кроме двух исходных линейных амплифицированных молекул образуются две кольцевые плазмидные ДНК, каждая с двумя одноцепочечными разрывами. После трансформации кольцевыми молекулами клеток Е. соН разрывы репарируются ферментами клетки-хозяина, и плазмида может реплицироваться независимо. Линейные молекулы ДНК в Е. oli не сохраняются.

Реассоциация двух комплементарных последовательностей ДНК происходит путем спаривания оснований-в отличие от процесса денатурации, при котором они разделяются (см. рис. 2.15). Мы уже рассмотрели многие эксперименты, в основе которых лежит использование этого метод для выделения индивидуальных последовательностей ДНК или РНК и их способности гибридизоваться со специфическим зондом. Сейчас мы увидим, что кинетика реассоциации отражает разнообразие присутствующих в клетке последовательностей, причем эта реакция может быть использована для определения количества генов и их РНК-продуктов. Такие реакции при их проведении в растворе называются гибридизацией в растворе. [c.224]

Для четырех видов морских ежей степень нуклеотидной гетерозиготности оценивалась посредством денатурации ДНК с последующей конкурентной реассоциацией ( гибридизацией ). Этот метод не точен, но его достоинство состоит в том, что он позволяет рассматривать геном организма в целом. Результаты по одноцепочечной ДНК суммированы в табл. 22.16. Оценка доли нуклеотидных замен колеблется между 2 и 4%. [c.102]

Геномы эукариот содержат не только интроны, но также и большое число копий ДНК, которая не кодирует белок и представляется ненужной. Присутствие таких повторяющихся последовательностей ДНК у высших эукариот впервые было обнаружено методом гибридизации, позволяющим оценить число копий гена (см. разд. 4.6.7). При иснользовании этого метода геном механически нарезается на короткие двухцепочечные фрагменты длиной около 1000 нуклеотидных пар затем фрагменты подвергают денатурации и получают одноцепочечную ДНК. Скорость, с которой одноцепочечные ДНК гибридизуются в смеси, зависит от комплементарности фрагментов. Для большей части фрагментов реакция протекает очень медленно. Например, гаплоидный геном клетки млекопитающего представлен примерно 6 млн различных фрагментов ДНК длиной 1000 нуклеотидов, и любой фрагмент, последовательность которого содержится лишь в одной копии, должен случайно столкнуться с 6 млн некомплементарных цепей, чтобы наш гомолога. [c.242]

Останавливают реакцию и удаляют матрицу обработкой ДНКазой. Неясно, необходим ли этот этап, если учесть, что матрица не подвергается денатурации ни на одной из стадий получения зонда. Кроме того, существует опасность разрушения зонда примесями РНКазы. Присутствие ДНК-матрицы при гибридизации в растворе может мешать гибридизации лишь при температурах, близких к температуре плавления (Т л) ДНК, когда ее цепи могут па отдельных участках начать расходиться и вступать во взаимодействие с РНК-зондом, защищая его от воздействия РНКазы и тем самым искажая результаты опыта. [c.25]

По температуре денатурации — ренатурации можно оценить степень комплементарности нуклеиновых оснований в цепях ДНК. Для денатурации сегментов ДНК, характеризующихся высоким уровнем комплементарности. требуются соответственно большие затраты энергии. Расхождение цепей таких фрагментов ДНК происходит соответственно при более высокой температуре. Это физическое явление используется на практике для определения степени сродства (гомологии) различных нуклеиновых кислот и лежит в основе метода гибридизации (одного из главных в генной инженерии). [c.36]

Препараты митотических хромосом получали из культуры лимфоцитов, подвергали специальной обработке с целью денатурации хромосомной ДНК и затем проводили гибридизацию с меченным тритием ДНК-зондом в течение 16-18 ч при 40°С. [c.130]

Рис. 4.11. ДНК-гибридизация. Исследуемую ДНК подвергают денатурации и фиксируют на твердой подложке, например на нитроцеллюлозном или найлоновом фильтре. Меченый ДНК-зонд (обычно длиной от 100 до 1000 п. н.) тоже денатурируют, наносят на фильтр с исследуемой ДНК и проводят их отжиг. Для удаления негибри-дизовавшегося ДНК-зонда фильтр промывают и визуализируют метку. Если гибридизация между зондом и исследуемой ДНК не произошла, то никакой метки на фильтре не обнаруживается. (Метка на рисунке обозначена цветной звездочкой.)

Чтобы определить, произошло ли лигирование, 5 -конец зонда X метят биотином, а З -конец зонда V — дигоксигенином, низкомолекулярным соединением, связывающимся с соответствующим антителом. После гибридизации и лигирования проводят денатурацию ДНК для высвобождения гибридизовавшегося зонда и переносят смесь в небольшую пластиковую лунку, покрытую стрептавидином. Лунку промывают, чтобы удалить весь материал, кроме связавшегося со стрептавидином биотинилированного зонда. Затем добавляют в лунку антитела к дигоксигенину, предварительно соединенные со щелочной фосфатазой. После промывания, в ходе которого происходит удаление несвязанного конъюгата, добавляют бесцветный хромогенный субстрат. Окрашивание раствора в лунке свидетельствует о связывании антитела к дигоксигенину с зондом, меченным дигоксигенином, т. е. о том, что этот зонд был лигирован с зондом, меченным биотином. Если же окрашивания не происходит, значит лигирования не было. [c.198]

Более простым, хотя и менее чувствительным вариантом ПЦР/ЛОЗ является метод лигазной цепной реакции. Тестируемую ДНК смешивают с избытком двух индикаторных зондов, описанных выше, в присутствии термостабильной ДНК-лигазы. Проводят лигирование при 65 °С, затем повышают температуру до 94 °С, чтобы произошла денатурация образовавшихся гибридов зонд-ДНК-мишень, и вновь понижают температуру до 65 °С для гибридизации свободных нелигированных индикаторных ЛОЗ-зондов с ДНК-мишенью. Этот цикл повторяют 20 раз. Если иггдикаторные ЛОЗ-зонды полностью комплементарны ДНК-мишени, то лигирование будет происходить в каждом цикле, и после 20 циклов накопится достаточно продуктов лигирования ( сшитых зондов X и Y) для того, чтобы их можно было обнаружить с помощью электрофореза или ELISA. Если комплементарность неполная, то лигирование не произойдет и никаких продуктов зарегистрировано не будет. [c.198]

Разрушение и восстановление двуспиральных структур. Денатурация, ренатурация, и гибридизация. Д спиралььые структуры очень стабильны в физиологических условиях при значениях рН, близких к нейтральным, температурах около 30 — 40 и в присутствии 0,15 моля соли. Одиако увеличение или уменьшение pH, повышение температуры и добавление в среду некоторых веществ, таких, например, как мочевина, приводит к разрушению даух-цепочечной структуры, предельным случаем которого является Оена-турация, т. е. полное разделение отдельных нитей. [c.342]

Для постановки ПЦР необходимо знать последовательность как минимум 17 пн с обеих сторон исследуемого фрагмента ДНК Обычно синтезируют два дезоксинуклеотида длиной 20-30 оснований, представляющие собой концевые последовательности интересующего нас фрагмента ДНК Используя комплементарные к этим участкам олигомеры — праймеры, запускают амплификацию Избыточные количества праймеров смешивают с геномной ДНК, а затем последовательно осуществляют реакции денатурации, отжига (реассоциации) и наращивания цепи (удлинение праймера) Тепловая денатурация сопровождается расплетением двойной спирали ДНК При снижении температуры имеет место отжиг олигонуклеотидов, то есть происходит гибридизация олигонуклеотидных праймеров со своими комплементарными последовательностями Наращивание цепи праймеров катализируется ДНК-полимеразой [c.204]

Рис. 84. Гибридизация путем совместной денатурации и ренатурации ( отжигом ) ДНК из Вас. виЬИИз, выращенных на средах с N и с N1 .

Рис. 87. Гибридизация ДНК двух различных видов бактерий Вас. аиЫШа и Вас. паШ) при совместной денатурации и ренатурации ( отжиге ).

Денатурация и ренативация ДНК. Гибридизация ДНК — ДНК и ДНК — РНК. Двухцепочечные структуры ДНК при нагревании, экстремальных значениях pH, обработке мочевиной могут переходить в форму неупорядоченных клубков — денатурироваться. Молекулы нуклеиновых кислот максимально поглощают ультрафиолет при 260 нм за счет поглощения азотистых оснований. Раствор нативной ДНК имеет при 260 нм оптическую плотность на 40% ниже оптической плотности смеси нуклеотидов —. гиперхромный эффект. Поэтому о денатурации ДНК судят по увеличению Е250- При нагревании поглощение при 260 нм возрастает в узком диапазоне температур (точка плавления 80—85 °С). Денатурация обратима, если остались спирализованные участки ДНК. Восстановление структуры ДНК после удаления денатурирующего фактора (за счет комплементарного спаривания оснований нуклеотидов) называется ренативацией ДНК. На явлении денатурации ренативации основан метод гибридизации. [c.295]

На чашку Петри с бактериальными колониями накладывают лист специального нейлонового фильтра на него переходит часть клеток бактерий каждой колонии, тогда как другая часть остается на чашке. В результате получается реплика на чашке и на фильтре колонии распределены одинаково. ДНК прочно связывается (иммобилизуется) с нейлоновым фильтром. Для лизиса бактерий и денатурации ДНК клонов нейлоновый фильтр обрабатывают щелочью. Затем фильтр помещают в раствор, содержащий меченый зонд (кДНК или мРНК, или синтетический олигонуклеотид). При гибридизации зонд связывается с теми колониями, которые содержат последовательности, комплементарные меченому зонду фильтр отмывают от несвязавшихся молекул зонда и проводят радиоав- [c.46]

Рис. 4-73. Сравнение нескольких модификаций метода гибридизации, отличающихся различной жесткостью условий. В реакции слева (жесткие условия) температура раствора поддерживается лищь на несколько градусов ниже температуры денатурации полностью комплементарной спирали ДНК (ее температуры плавления). В этих условиях спирали, совпадающие не полностью и формирующиеся при пониженной жесткости (см. справа), оказываются нестабильными. Справа - указаны условия гибридизации, используемые для поиска родственных генов, не полностью

Формамид является лучшим растворителем для снижения температур денатурации двухцепочечных комплексов ДНК и гибридов РНК — ДНК. При более низких температурах денатурации снижается степень термической деградации нуклеиновых кислот. В буферах, содержаш,их от 0,035 до 0,88 М Na I, на каждый процент формамида Тт ДНК снижается на 0,60 °С [34]. Для гибридизации рРНК на фильтре Джиллеспи и Джиллеспи [29] применяли 50%-ный формамид в буфере [c.159]

Для идентификации и выделения интересующих исследователя клонов разработан метод гибридизации в бактериальных колониях или фаговых бляшках. На колонии бактерий, выращенные на твердой среде, сначала накладывают нитроцеллюлозный фильтр. Бактерии прилипают к фильтру. После лизиса и денатурации под действием NaOH и фиксирования денатурированной ДНК прогреванием фильтр инкубируют в растворе с радиоактивно меченным зондом. По окончании гибридизации фильтр отмывают от избытка зонда и выявляют образовавшийся меченый гибридный комплекс путем контакта с рентгеновской пленкой. Сравнивая положение пятна на радиоавтографе с положением колоний на чашке, выбирают ту из них, которая дала положительный сигнал. Аналогичным образом поступают и при идентификации клонов на основе фаговых векторов. Результатом этих манипуляций является вьщеление искомых индивидуальных клонов (бактериальные колонии или фаговые бляшки). [c.43]

ПЭО с молекулярными массами 1500, 4000, 6000 применяют также для гибридизации соматических клеток, которая, как известно, вызывает изменения в мембранах. Используют способность препаратов ПЭО (М. М. 2000—4000) осаждать белки из раствора, не вызывая их денатурации. Установлено, что ПЭО может приводить к компактизацин молекул ДНК. Вопрос о проникновении ПЭО в клетки остается до конца не выясненным. [c.35]

Более тонкий метод оценки генетического сходства организмов — метод гибридизации их ДНК, позволяющий количественно оценивать степень гомологичности ДНК этих организмов. В основе его лежит способность денатурированной (одноцепочечной) ДНК в подходящих условиях ренатурироваться, т. е. соединяться с комплементарной нитью с образованием двухцепочечной молекулы ДНК. Для этого ДНК, выделенную из организмов одного вида, денатурируют нагреванием и в таком виде фиксируют в каком-нибудь носителе, например в геле. Из другого вида организмов приготавливают меченую ДНК, подвергают ее денатурации и деградации на отдельные более или меиее мелкие фрагменты, после чего создают условия для реассоциации с ДНК, закрепленной в носителе. Количество двухцепочечной ДНК, образованной в результате взаимодействия однонитевых ДНК из разных организмов, служит мерой сходства этих организмов. (Количество образовав [c.138]

В бляшке фага % содержится много фага и фаговой ДНК. Фаг и ДНК можно прямо из бляшек перенести на нитроцеллюлозу, если наложить на чашку сухой нитроцеллюлозный фильтр. После денатурации перенесенной на фильтр ДНК она оказывается уже готовой для гибридизации. Таким способом можно проверять до 25 ООО бляшек на одной чашке. Связанную с фильтрами денатурированную ДНК гибридизуют с ДНК, меченной Р с помощью ник-трансляции. После этого фильтр промывают и экспонируют с ним рентгеновскую пленку. Пятна почернения на пленке соответствуют гибридизующимся клонам. [c.46]

Двухцепочечную ДНК можно денатурировать любым способом. Однако если концентрация соли в ней выше, чем в буфере ТЕ, то мы рекомендуем проводить денатурацию щелочью. Если зонд повторно используется после длительной гибридизации в водном растворе, его можно денатурировать NaOH. Добавьте к зонду 1/10 объема 1,5 М NaOH и через 10 мин добавьте 1/10 объема 1,5 М НС1. Если зонд в формамиде, то можно использовать тепловую денатурацию. Зонд становится наполовину ренатурированным в соответствии с таким уравнением [c.128]

Гибридизацию по Саузерну [7] используют для выявления и изучения организации последовательностей ДНК после их разделения с помощью гель-электрофореза. Процедура гибридизации подразделяется на два этапа. Первый этап — перенос разделенных фрагментов ДНК на нитроцеллюлозную мембрану, осуществляемый под действием капиллярных сил (в последнее время применяется электроперенос) таким образом, чтобы относительное положение каждой молекулы ДНК осталось неизменным. Второй этап — гибридизация связанной ДНК с пробами, меченными изотопами (комплементарной ДНК), для выявления определенных последовательностей ДНК. Анализ ДНК по Саузерну включает в себя апуриниза-дию, денатурацию и нейтрализацию ДНК внутри геля с последующим переносом и связыванием нуклеиновой кислоты с мембраной. Далее мембрану инкубируют с одноцепочечной пробой, меченной радиоактивным изотопом, а после отмывания — выявляют гибридизовавшиеся гомологичные фрагменты ДНК путем авторадиографии с использованием рентгеновской пленки. [c.277]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология