Линейная и кольцевая формы ДНК фага

ВИДНЫ два конца растянутой молекулы ДНК (фиг. 28) [270]. Не могло быть сомнения, что ДНК в Т-четных фагах носит линейный характер, а не кольцевой. Это, конечно, не исключало возможности, что внутри клетки такая ДНК существует в кольцевой форме, аналогично тому как это было обнаружено для ДНК фага X. Но концевую избыточность нельзя было объяснить таким способом. После того как недавно в инфицированных клетках была обнаружена сверхгигантская линейная фаговая ДНК [145, 146], объяснение, предложенное в начале этого раздела, представляется наиболее правдоподобным, если не единственно возможным, для описания состояния ДНК этих фагов. [c.126]

ЛИНЕЙНАЯ И КОЛЬЦЕВАЯ ФОРМЫ ДНК ФАГА X [c.383]

Рис. 30.28. Превращение линейной ДПК фага X в кольцевую форму.

Кроме линейных молекул ДНК существуют ковалентно замкнутые кольцевые молекулы, например однонитевая циркулярная ДНК фага фХ-174 [46] и ее двунитевая репликативная форма [47]. Ковалентно замкнутыми, циркулярными молекулами являются ДНК фага Я [48—51] и митохондриальная ДНК. Эти свойства молекул ДНК влияют на их поведение при фракционировании на колонках. [c.69]

Длину одноцепочечных концов в ДНК фага X можно оценить, изучая равновесие между 215- и 245-формами при достаточно малых концентрациях последних, чтобы не допустить образования л-меров более высокого порядка. Чтобы найти константу равновесия в реакции образования колец, нужно знать долю кольцевой (х ) и линейной форм = = х/(1 Хк)- Измерив зависимость от температуры и построив график в аррениусов-ских координатах, получаем кажущуюся энтальпию образования колец, равную [c.384]

Поскольку имеется фермент экзонуклеаза III, отщепляющий нуклеотиды с З -концов двухцепочечных ДНК, присутствие одноцепочечных 5 -концевых отрезков нетрудно обнаружить. В свете рассмотренного ранее перехода из суперспирализованного состояния к кольцевому с разрывом в одной цепи и затем к линейному нетрудно себе представить, как могли произойти молекулы ДНК, наподобие ДНК фага К. А с какой легкостью такие молекулы вновь приобретают кольцевую форму [c.120]

На самом деле существуют две кольцевые формы внутриклеточной ДНК фага К. Материал, седиментирующий в градиенте концентрации сахарозы почти вдвое быстрее, чем линейная ДНК фага %, оказался суперспирализован-ной ДНК. Материал же, седиментирующий в 1,14 раза быстрее, был нескрученной кольцевой ДНК, одна из цепей которой оставалась замкнутой (ковалентной связью). Последнее заключение было сделано на основании того, что при нагревании эта форма не превращалась в линейную [43, 352]. [c.121]

Вьщеленные из вирусных частиц молекулы ДНК имеют либо линейную, либо кольцевую форму. Линейные молекулы ДНК in vivo свертываются в плотный клубок. В таком состоянии они более устойчивы к деградации. Например, кольцевая форма ДНК находится в фаге фХ174. Кольцевую ковалентно-связанную структуру имеют двухцепочечные ДНК бактерий, вирусов, плазмид, митохондрий и др. Двухцепочечные кольцевые ДНК [c.276]

Фаг Т7 содержит линейную двухцепочечную по всей длине молекулу ДНК. Частичное расщепление этой ДНК экзонуклеазой III с последующим отжигом выявляет наличие в ее структуре концевых повторов. При этом в отличие от фагов Т2 и Т4 у фага Т7 не происходит кольцевых перестановок генов. При инфекции фагом Т7 репликация фаговой ДНК инициируется на участке ori, расположенном на расстоянии, соответствующем 17% общей длины молекулы от левого конца ДНК. В репликации участвует линейная молекула ДНК кольцевые формы не образуются. На более поздних, стадиях инфекции наблюдается образование весьма протяженных линейных конка-темеров ДНК Т7. Предложите модель репликации ДНК фага Т7, объясняющую необходимость возникновения конкате-мерных структур для полной репликации линейного фагового генома. [c.129]

Поддержание кольцевой формы необходимо для репликации ДНК фХ174. Расщепление единичной фосфодиэфирной связи в одноцепочечной кольцевой ДНК переводит ее в линейную форму и лишает фаг способности инфицировать бактерию. В то же время для перевода двухцепочечной кольцевой ДНК в линейную форму необходимо, чтобы разрывы фосфодиэфирной связи имели место в каждой из двух комплементарных цепей вблизи одной и той же нуклеотидной пары. Вот почему инфекционность двухцепочечной кольцевой формы при действии дезоксирибону- [c.277]

Кольцевую ДНК другого рода впервые обнаружили у бактериофага X. При исследовании ДНК фага X на ультрацентрифуге оказалось, что она представлена набором компонентов с различными коэффициентами седиментации. Если вьщелить один из компонентов при помоши зонального центрифугирования и оставить его в покое на некоторое время, он медленно перейдет в равновесную смесь компонентов. Использование ферментов, а также исследования с помощью электронного микроскопа показали, что два наиболее медленно седиментирующие компонента, 21S- и 245-компоненты, представляют собой соответственно двухцепочечную линейную и двухцепочечную кольцевую формы молекулы. Более быстрые компоненты являются /i-мерами этих последних, например линейными или кольцевыми лвухцепочечными молекулами двойной длины. Чтобы объяснить способность ДНК фага X претерпевать все эти взаимные превращения, было высказано [c.383]

В природе найдено уже большое число кольцевых ДНК к ним относятся многие ДНК животного происхождения, а также бактериальные и вирусные, плазмидные и митохондриальные ДНК. Большинство из них не являются одноцепочечными (как ДНК фХ174), не имеют разрывов в одиночных цепях и неспособны находиться в равновесии с линейными формами (как ДНК фага X). Напротив, они представляют собой кольцевые двухцепочечные ДНК с совершенно целыми цепями. Такие структуры называют замкнутыми кольцевыми двухцепочечными всякую кольцевую форму с одним разрывом или более в одиночных цепях называют открытой кольцевой двухиепочечной формой. Замкнутую и открытую структуры нетрудно различить опытным путем (рис. 24.2). Допустим, что мы поместили нашу ДНК в щелочной раствор. В любой открытой структуре при высоком значении pH связи между цепями ДНК разорвутся. Даже при наличии одного разрыва в одной из цепей концы последней смогут вращаться относительно другой цепи, и в результате эти две одиночные цепи разойдутся. При центрифугировании в щелочном растворе кольцевой двухцепочечной молекулы с разрывом в одной из цепей мы обнаружим линейную цепь и одноцепочечное кольцо. При высоком значении pH может произойти разрыв водородных связей между основаниями и в замкнутой двойной спирали, но в этом случае два образовавшихся одноиепочечных кольца не смогут разделиться. Действительно, как мы увидим далее, они остаются настолько переплетенными, что образуется клубок из спутанных одиночных цепей ДНК. Такой весьма компактной структуре отвечает большой коэффициент седиментации, и ее легко отличить от любых свободных одноцепочечных форм. [c.387]

Третичная структура ДНК. Молекулы, ДНК существуют в виде линейных и кольцевых форм (рис. 72). В линейной форме находится, видимо, большинство природных ДНК, но ДНК ряда вирусов и фагов, а также ДНК хлоропластов, митохондрий, центриолей и бактериальных плазмид обладают кольцевой структурой. Третичная структура и линейных и кольцевых форм ДНК характеризуется спирализацией и суперспирализацией. Между кольцевыми и линейными формами ДНК, равно как и между ее обычным и суперспирализованным состоянием, предполагается существование динамических переходов. В ДНК ряда вирусов (например, вируса полиомы) и митохондриальной ДНК такие превращения детально изучены (рис. 72). [c.210]

Пример 13-В. Соотношение кольцевой и линейной форм в молекулах ДНК. В 1961 г. было показано, что генетическая карта фага Т2 Е. oli циклична. Поскольку в то время не представлялось возможным наблюдать ДНК в электронный микроскоп для того, чтобы оцепить кольцевую форму, исследовали изменение Т1г единичного образца ДНК фага 12, который непрерывно обрабатывался панкреатической ДНКазой. Этот фермент вызывает одноцепочечные разрывы фосфоэфирных связей, которые накапливаются и в конце концов совпадают таким образом, что образуются двухцепочечные разрывы (рис. 13-9,Л). Эти одноцепочечные разрывы сами по себе не оказывают влияния на вязкость ДНК (рис. 13-9, ) вследствие того, что жесткость молекулы поддерживается стэкинг-взаимодействием оснований (гл. 16). Следовательно, для линейной молекулы т1отп постоянна в течение всего периода, когда образуются только одноцепочечные разрывы, и уменьшается благодаря уменьшению молекулярной [c.375]

В зрелых вирионах фага Я ДНК находится в виде двухцепочечной линейной молекулы размером 48 502 пн. На концах молекулы ДНК имеются взаимокомплементарные G -обога-щенные одноцепочечные концы длиной 12 нуклеотидов (обозначаются как o R и osL). Сразу после попадания в клетку фаговая ДНК цикли-зуется по этим концам и функционирует в клетке в кольцевой форме. Район ковалентно зашитых o R и osh называется os-сайтом. Фаг Я является умеренным фагом, т. е. в зависимости от условий может развиваться в клетке либо по литическому, либо по лизогенному пути. [c.97]

Рис. 28.17. Генетическая карта фага . Показаны лишь некоторые гены. После ироникновения в бактериальную клетку линейная двухценочечная ДПК переходит в кольцевую форму.

Кольцевые замкнутые ДНК, фигурирующие в фагах и бактериях, вследствие топологической невозможности сво- ов/аТ бодного раскручивания с образованием петель, должны плавиться прй более вы- о, сокой температуре, чем те же ДНК в линейной форме. > 5 [c.241]

Прямые физические методы. Самым старым и самым прямым методом исследования биополимеров следует считать, по-видимому, электронномикроскопический метод. Недавно Клейншмидт обнару кил, что если препарат нуклеиновой кислоты, непосредственно выделенный из живого организма методом осмотического шока или взятый после предварительного выделения, комплексировать с каким-нибудь основным белком, например с цитохромом с, то его mohiho нанести на поверхность воды в виде моно-молекулярной пленки. На фиг. 51 приведена электронная микрофотография фаговой ДНК, полученная Томасом и Мак-Хатти при помощи этого метода. Снимок позволяет оценить размеры молекулы ДНК и ясно показывает, что эта молекула замкнута в кольцо. Определенная таким способом длина молекулы, равно как и ее диаметр, соответствуют величинам, которых следует ожидать на основе гипотезы Уотсона — Крика. Показано, что молекулы ДНК из многих источников имеют форму кольца или замкнутой петли. У ДНК фагов Я и Т2 переход от линейной формы к кольцевой осуществляется легко и обратимо. [c.143]

Внутри клетки ДНК фага X является двухцепочечной кольцевой молекулой (еуперспирализованноп без разрывов). В вирусной частице молекула имеет линейную форму, возникающую из-за двух разрывов, показанных на схеме. Нуклеотидная последовательность образовавщихся липких концов приведена в том виде, как она известна сейчас. Сомнительные участки заключены в рамку [569, 570]. [c.122]

Несмотря на то что с точки зрения структуры между длинными линейными и большими кольцевыми молекулами как будто существует большое различие, в действительности это различие сводится лишь к наличию или отсутствию одной лишней фосфодиэфирной связи. При этом замкнутые и разорванные формы в клетке свободно переходят друг в друга. Так же легко переходят друг в друга и одно- и двухцепочечное состояния. И даже еще в большей степени это относится к переходу от двухцепочечной суперспирализованной формы к двухцепочечной открытой форме, происходящему обычно в результате разрыва одной цепи. Механизм репликации фага фХ174 подтверждает, что эти переходы действительно легко [c.252]

Карта генома фага Ми показана на рис. 36.13. Внедренный геном Ми имеет тот же порядок генов, что и свободная фаговая ДНК, которая имеет линейную форму. (Следует отметить существующее отличие от фага лямбда, свободная линейная ДНК которого при инфекции образует кольцевую молекулу в результате интеграции образуется линейный профаг, порядок генов которого является пермутированным относительно порядка генов свободной ДНК фага.) Линейные геномы фага Ми не содержат ни липких концов, ни повторов поэтому не ясно, каким образом осуществляется согласованное действие концов во время интеграции. Возможно, что реакция зависит от гомологии, которая встречается на расстоянии примерно 100 пар оснований от каждого конца. Существование механизма, узнающего специфические концы интегрированной последовательности фага Ми, было обнаружено при открытии способности этого фага вырезаться. Реакция происходит только в том случае, если профаг Ми приобретает ISl-элемент. Механизм вырезания неизвестен, однако установлено, что в него вклю- [c.469]

ВВОДИТ свою ДНК в бактерию-хозяина. Те же реакции, приводящие к эффективной и избирательной упаковке космид в частицы фага Я, можно провести и in vivo [2—5]. В этом случае упаковку обеспечивает система, запускающаяся в бактериальной клетке либо при индукции профага в ответ на тепловую инактивацию термочувствительного репрессорного белка, либо при индуцировании клетки хелперным фагом. При этом способе существенно возрастают эффективность процессов переноса генетической информации между разными клетками и взаимопревращения различных (кольцевых и линейных с выступающими концами) форм ДНК (рис. 3.1). [c.75]

Векторы на основе бактериофага Я. Бактериофаг Я. — это вирус, размножающийся на бактериях Е. соИ. За последние 3U лет он стал излюбленным и наиболее изученным объектом генетиков и молекулярных биологов. Геном фага Я. представлен двуцепочечной ДНК размером в 48,5 т.п.о., которая упакована в головку фага в виде линейной молекулы с однонитевыми комплементарными концами длинои в 12 п.о. (липкие концы). После проникновения в клетку липкие концы объединяются и ДНК замыкается в кольцо. Кольцевая ДНК является репликативной формой. Возможность создания векторов на основе фага Я связана с тем его свойством, что гены центральной части (от I до N) несущественны для литического развития. Уже более 20 лет известны способы замещения центральной части фага сегментами бактериальной хромосомы путем определенных генетических манипуляций in vivo. Созданные таким образом специализированные трансдуцирующие фаги хорошо изучены. Идея провести манипуляцию замены центральной части ДНК фага Я in vitro на чужеродные фрагменты послужила поэтому логическим продолжением опытов in vivo. [c.147]

Методы, используемые нами для синтеза равномерно меченных и меченных по концам одноцепочечных ДНК-зондов, очень похожи. Принцип их проиллюстрирован на рис. 10. Фрагмент ДНК, который предстоит исследовать, клонируется в репликативной форме бактериофага или в плазмидном векторе, продуцирующем одноцепочечные кольцевые молекулы только одной ориентации. Две наиболее распространенные системы такого типа — бактериофаг М13 и плазмиды, несущие точки начала репликации фага М13. Олигонуклеотидный праймер реассоциируют с одноцепочечной кольцевой молекулой так, чтобы он инициировал синтез ДНК на матрице тестируемой вставки в направлении от 5 - к З -концу. Для равномерно меченных зондов один из используемых при синтезе dNTP метится изотопами Р или в альфа-положении. Для зондов с концевой меткой олигонуклеотид метят по 5 -концу [y- PjATP, а для синтеза ДНК используют холодные dNTP. По окончании синтеза ДНК обрабатывается рестриктазой, расщепляющей кольцевую молекулу у конца вставки, противоположном сайту реассоциации с олигонуклеотидным праймером. В результате такой реакции получается линейный фрагмент ДНК, состоящий частично из двухцепочечного и частично из одноцепочечного участков. Денатурируя ДНК и проводя препаративный электрофорез в поли- [c.167]

Насколько существенно эндосмос может влиять на результаты электрофореза, видно из даннь/х Джонсона и др. [Johnson et al., 1980]. Авторы использовали три типа агарозы с различной способностью к эндосмосу (значения — т, составляли соответственно 0,081, 0,175 и 0,441 см. ниже). В одном II том же опыте на параллельных полосках 1%-ной агарозы этих типов они разделяли смесь трех форм репликативной ДНК фага ФХ 174-сверхскручеиной, кольцевой и линейной. С усилением эндосмоса не только происходило сильное замедление скорости миграции всех ДНК (более чем втрое), но и (что хуже) менялось взаимное расположение полос (рис. 4). По-видимому, различные формы ДНК увлекаются потоком эндосмоса по-разному. [c.18]

Мэтью Мезельсон и автор этой книги использовали данный метод для того, чтобы показать, что ДНК профага вставляется в бактериальную ДНК. Штамм Е. oli, содержащий кольцевой половой фактор с местом присоединения для фага подвергали лизогенолизу. Половой фактор вместе с присоединенным профагом выделяли и комбинацией центрифугирования в щелочном градиенте сахарозы и в s l, содержащем бромид этидия, показали, что он обладает кольцевой структурой большей величины. Однако этот тест не давал возможности сделать выбор между двумя альтернативами, так как лизогенная форма могла представлять собой большее кольцо или катенан, состоящий из связанного полового фактора и кольца К. После введения одноцепочечных разрывов при обработке рентгеновскими лучами кольца получали плотность, совпадающую с плотностью линейной ДНК, причем не было обнаружено зон с промежуточной плотностью. Отсюда был сделан вывод, что лизогенная форма представляет собой непрерывное кольцо. [c.344]

ДНК (рис. 2.33). Субстратной матрицей в этом случае является двухцепочечная кольцевая ДНК, которая была репшщирована после превращения на ранних этапах инфекции линейной вирусной ДНК в кольцевую репликативную форму. Для того чтобы образовалась линейная ДНК потомства, двухцепочечные кольца надрезаются и асимметрично реплицируются, как это происходит в случае ДНК фагов М13 и фХ174. Однако отделяющиеся одиночные цепи превращаются в двухцепочечные структуры. Сначала во множестве сайтов вдоль одиночной цепи [c.90]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология