Иммунодиффузия в агаровом геле

ДВОЙНАЯ ИММУНОДИФФУЗИЯ В АГАРОВОМ ГЕЛЕ [211 [c.92]

Сравнительно новой разновидностью зонального электрофореза является электрофорез на ацетат-целлюлозной мембране [6]. Ацетат-целлюлозная мембрана, по-видимому,— очень хорошая поддерживающая среда, уже нашедшая благодаря ряду достоинств широкое применение. Выше мы отмечали, что приготовление крахмального и агарового гелей—довольно трудоемкая операция, осложняющая метод. В то же время способы предварительной обработки ацетат-целлюлозной мембраны почти так же просты, как и в случае с фильтровальной бумагой. При этом разделение белков происходит лучше и быстрее, а для анализа достаточно 5—1000 мкг белка, растворенного в объеме 0,1—10 мкл. Как белки, так и гликопротеиды очень хорошо окрашиваются на ацетат-целлюлозной мембране, поэтому она является прекрасной поддерживающей средой с точки зрения количественной оценки этих соединений. Электрофорез на ацетат-целлюлозной мембране позволяет получить больше белковых фракций сыворотки крови, чем электрофорез на бумаге, но меньше, чем электрофорез в крахмальном геле. С помощью электрофореза на ацетат-целлюлозной мембране можно определять весьма малые количества индивидуальных белков, благодаря чему он очень подходит для анализа гомогенности выделенного нативного белка. Ацетат-целлюлозные мембраны могут быть использованы также в опытах по иммунодиффузии, что является еще одним достоинством этого метода электрофореза. [c.14]

Примененные Коном (стр. 71) для электрофореза ацетат-цел-люлозные мембраны могут быть также успешно использованы в опытах по иммунодиффузии, Ацетат-целлюлозные мембраны лишены ряда недостатков, присущих агаровому гелю. [c.161]

Иммунодиффузию в агаре можно проводить по методу Хансона [14]. После гель-фильтрации на пластинках 10-20 см гель сефадекса удаляют механическим путем, оставляя только полоску шириной 3—5 см, содержащую разделяемые белки. Затем пластинку заливают расплавленным агаром (охлажденным до 50 °С), который при застывании образует гель толщиной 1 мм. При аккуратном выполнении этой операции агар покрывает полоску сефадекса, не нарушая слоя. Таким путем удается получить хорошие зоны преципитации, однако следует заметить, что эта методика требует большого экспериментального навыка. Иммунодиффузию в геле агара можно также выполнять после переноса белков на ацетилцеллюлозные мембраны [57] или полоски фильтровальной бумаги [13]. Полоски помещают на агаровый гель, где осуществляют иммунодиффузию. [c.271]

Для анализа антигенов, разделенных с помощью электрофореза или электрофокусирования в полиакриламидном геле, разработаны многочисленные методы иммунодиффузии. Так, для этой цели можно использовать различные варианты двойной иммунодиффузии. Цилиндрические столбики геля разрезают продольно на две половинки (см. разд. 1.15.6), а из пластин нарезают полоски, содержащие разделенные антигены. Разрезанный гель помещают на стеклянные пластинки, заливают их теплым раствором агара и дают ему застыть. Канавки для антител располагают на соответствующем расстоянии от полиакриламидного геля. Как только полиакриламидный гель покроется слоем агара толщиной 1 мм, в непосредственной близости от него сразу же вырезают канавку для антисыворотки. Если для анализа используют разрезанные вдоль столбики полиакриламидного геля, то их кладут на слой агарового геля и в нем рядом с полоской геля по обеим ее сторонам быстро вырезают канавки для антител. Преципитаты образуются под полоской полиакриламидного геля. Столбик полиакриламидного геля можно также разрезать в поперечном направлении на диски и проанализировать присутствующие в них антигены методом двойной радиальной диффузии 203, 394]. [c.244]

Кроме того, для анализа антигенов применяют принцип простой иммунодиффузии. Лучше всего это сделать, поместив продольно разрезанные цилиндрические столбики геля на поверхность агарового геля, содержащего антитела. Оптимальную концентрацию антител, которую следует внести в гель, определяют в предварительных опытах. Был предложен еще один интересный экспериментальный прием [802]. Полиакриламидный гель формируют в виде полого цилиндра, используя для полимери- [c.244]

В классическом методе иммуноэлектрофореза в агаровом геле сочетание электрофореза с иммунодиффузией дает большое увеличение числа различаемых компонентов, хотя степень разрешения электрофореза при этом не повышается. В сыворотке человека таким путем можно обнаружить 20—30 компонентов в зависимости от качества применяемой антисыворотки. Линии преципитации соответствуют индивидуальным белкам, а не группам белков с одинаковой подвижностью. Обычно иммуноэлектрофорез рассматривают как источник качественной информации о белковом составе сыворотки. И действительно, он служит наиболее эффективным способом обнаружения недостаточности того или иного белка и изучения свойств моноклональных иммуноглобулинов. Описан также полуколичественный метод определения белкового состава сыворотки с применением иммуноэлектрофореза [8, 80]. Более удачным решением пробле- [c.335]

Через месяц после первой инъекции берут кровь и определяют в сыворотке содержание антител методом двойной иммунодиффузии в агаровом геле (см. гл. 6) либо непрямым методом по связыванию на пластиковых панелях для микротитрования, нагруженных мышин ым IgG. [c.169]

Простая радиальная иммунодиффузия дает возможность количественно определять антигены (Аг). В агаровый гель добавляют антитела (Ат), затем наливают его на предметные стекла и оставляют для застывания. В застывшем геле вырезают лунки и вносят в них стандартный объем различных по концентрации растворов антигена. Стекла оставляют не менее чем на 24 ч. В течение этого времени антиген диффундирует в гель и образует с антителами растворимые комплексы (при избытке антигена). Комплексы продолжают диффундировать, связывая все больше антител, пока не будет достигнута точка эквивалентности и не произойдет осаждение комплексов с образованием кольца. По радиусу зоны, ограниченной кольцом преципитации, определяют ее площадь. Величина площади пропорциональна концентрации антигена, которую вычисляют с помощью калибровочной кривой (график внизу). Для определения концентрации антител применяют тот же метод, но в обратной постановке, т. е. в гель добавляют антиген, а антитела вносят в лунки. [c.529]

При иммуноэлектрофорезе сначала разделяют смесь антигенов действием электрического поля (антигены с разной скоростью мигрируют в агаровом геле, приготовленном на соответствующем буфере). Затем заполняют антисывороткой траншею, идущую параллельно движению антигенов под действием электрофореза, и проводят иммунодиффузию. [c.367]

Для проведения двойной иммунодиффузии агаровый гель наливают на предметные стекла, после застывания вырезают в нем лунки и заполняют их исследуемыми растворами антигена (Аг) и антител (Ат). Растворы диффундируют в гель, и на той линии, где происходит взаимодействие Аг и Ат (с перекрестным связыванием и осаждением иммунных комплексов), образуется линия (дуга) преципитации. Ее можно наблюдать визуально, если промыть гель (для удаления растворимых белков) и нанести на него краситель, выявляющий белки, например кумасси синий. Такой метод может быть использован для определения родства между антигенами (синие кружки) и в реакции с данными тест-антителами (желтый кружок). При этом возможны три основных типа результатов (цифры в синих кружках обозначают эпитопы антигена). В реакции (1) дуги преципитации, образованные антителами и двумя исследуемыми антигенами, сливаются это показывает, что антитела взаимодействуют с идентичными эпитопами на двух антигенах (эпитоп 1). Такой результат не означает полную идентичность самих антигенов, но только их идентичность в том смысле, что данные антитела не выявляют различий между ними. В реакции (2) антитела выявляют 3 разных антигена, которые образуют независимые дуги преципитации. В реакции (3) антигены имеют общий зпитоп 1, однако один из них несет еще эпитоп 2. [c.528]

При постановке реакции радиальной иммунодиффузии иммунную сыворотку вносят в агаровый гель. В лунки геля помещают раствор антигена, который, диффундируя в гель, образует кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диамеф кольца преципитации пропорционален конценфации антигена. Реакцию используют, в частности, для определения содержания в крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента. [c.178]

В своей классической форме иммуноэлектрофорез представляет сочетание электрофореза в агаровом (или агарозном) геле с последующей двойной иммунодиффузией в той же среде. При двухмерной двойной иммунодиффузии антиген и антитело, помещенные в круглые или прямоугольные углубления в геле, мигрируют навстречу друг другу, в результате чего в нейтральной зоне среды, где они встречаются, образуются линии преципитации (рис. 82). Положение полос преципитации зависит от коэффициента диффузии антигена (скорость диффузии антитела можно рассматривать как постоянную) и концентрации антигена относительно антитела. Существует определенный интервал концентраций антигена и антитела, в котором их соотношение является оптимальным для образования преципитата. При двойной иммунодиффузии в этом интервале относительных концентраций (называемом зоной эквивалентности) получаются четкие линии преципитации. [c.236]

ИММУНОДИФФУЗИЯ в АГАРОВОМ (АГАРОЗНОМ) ГЕЛЕ ПОСЛЕ ПРОВЕДЕНИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ДРУГОЙ СРЕДЕ [c.243]

В настоящей главе описаны методы иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза (ИЭФ) 1В агаровых и агарозных гелях, а также иммунохимическое окрашивание реплик, полученных методом Вестерн-блоттинга после электрофореза в полиакриламидном геле. [c.197]

Фракции белка, разделившиеся в крахмальном геле, можно идентифицировать в реакции преципитации со специфической антисывороткой. Для этого Шёрлен и Голь [25] предложили комбинировать электрофорез в крахмальном геле с иммунодиффузией в агаровом геле. [c.82]

Агарозные гели используются для фракционирования белкоа и нуклеиновых кислот (гель-фильтрация, электрофорез) и их характеристики (иммунодиффузия, иммуиоэлектрофорез). Б агаровых гелях иммобилизуют бактерии и лимфоидные клетки а молекуляр-но-биологических и иммунологических исследованиях. [c.501]

В качестве поддерживающей среды можно применять и агаровый гель, но размер пор в нем гораздо больше, и движение белковых частиц происходит беспрепятственно (гель с низкой разрешающей способностью ). Большая скорость диффузии и прозрачность геля были использованы Грабаром и Уильямсом, которые создали так называемый иммуноэлектрофорез , являющийся развитием ранее существовавшего метода иммунодиффузии . Суть иммуноэлектрофореза состоит в том, что для проявления электрофореграммы и идентификации белковых компонентов применяется преципитация их иммунной сывороткой крови. После предварительного электрофореза на бумаге из последней вырезают продольную полоску, не проявляя зон. Еще влажную бумагу прижимают к поверхности агарового геля. Параллельно этой полоске вырезают канавку в агаре и наливают в нее иммунную сыворотку. В результате встречной диффузии антитело встречается с антигеном происходит преципитация, и в прозрачном геле образуются дугообразные ясно видимые полосы, которые можно еще окрасить. [c.99]

В методе иммунодиффузии наблюдается полоса преципитадии при диффузии препарата в гель, содержащий антитела. Каждая система антиген—антитело образует свою полосу. Диффузия может быть проведена в тонкой пленке геля или в вертикальных трубках. При помощи иммунофореза можно разделить очень сложную смесь близких по физико-химическим свойствам гликопротеинов. Первоначально проводится электрофорез в агар-агаровом геле, а затем иммунодиффузия ( перпендикулярном направлении). [c.75]

Результаты иммуноэлектрофореза, очевидно, зависят от факторов, действующих как во время электрофореза, так и на этапе нммунодиффузии. Повышение разрешающей способности электрофореза (см., например, описанный в гл. 1.9 микроэлектрофорез в агаровом геле по Вейме 1417]) приводит к улучшению разделения полос преципитации. На иммунодиффузию влияют специфичность, титр и сродство используемой антисыворотки, а также концентрация антигенов и геометрическое расположение в геле лунок для антигенов и канавок для антител. [c.237]

Для гуморального типа иммунного ответа характерна выработка антител, которые являются показателями функциональной активности В-звена иммунной системы [87,98,99]. Общий пул иммуноглобулинов в сыворотке крови неиммунизированных крыс определяли методом двойной радиальной иммунодиффузии в агаровом геле [100-101]. В лунки 24-х луночного планшета разливали по 2 мл 1,5% агара 01 ко, лунки вырезали шаблоном. В центральную лунку разливали по 20 мкл гиперим-мунной преципитирующей сыворотки производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, а в периферийные - по 20 мкл двухкратных разведении исследуемой сыворотки. После 24 часовой инкубации при комнатной температуре учитывали реакцию по количеству [c.226]

Агаровый или агарозный гель является наиболее подходящей средой для иммунодиффузии, В классическом варианте иммуноэлектрофореза и электрофорез, и иммунодиффузию осуществляют в одном и том же геле. Однако во многих случаях иммунодиффузию приходится проводить уже после того, как макромолекулы были разделены в другой среде, менее подходящей для иммунодиффузии. Паулик [1027] еще в 1852 г. применил иммунодиффузию для анализа антигенов, разделенных с помощью электрофореза на бумаге. Хотя иммунодиффузию можно осуществлять и на ацетате целлюлозы (см. ниже), Кон [695] предложил переносить антигены с ацетата целлюлозы в агаровый гель вместо того, чтобы проводить весь иммуноэлектрофо-ретический анализ на ацетате целлюлозы. Пленку из ацетата целлюлозы, на которой антигены подвергали электрофорезу, разрезают на две половинки одну из них окрашивают, а из другой вырезают полоску шириной 1 см (на расстоянии 1 см от центральной линии) и помещают ее на поверхность заранее приготовленного агарового геля, следя за тем, чтобы под ней не образовывались пузырьки воздуха. Можно также быстро окрасить одну половинку полоски, а вторую разрезать на кусочки, так чтобы каждый из них содержал отдельную электрофоретическую фракцию. Эти кусочки пленки помещают на поверхность агарового геля, оставляя между ними промежутки в несколько миллиметров. Пропитанные соответствующей антисывороткой полоски фильтровальной бумаги шириной 2 мм кладут на гель параллельно кусочкам пленки и на оптимальном расстоянии от них. Это расстояние определяется теми же факторами, что и в случае иммуноэлектрофореза в агаровом геле. После завершения иммунодиффузии с поверхности геля удаляют полоски бумаги и кусочки пленки, а затем фотографируют полученную картину преципитации. Для приготовления стабильных препаратов гель высушивают и окрашивают по методике, предназначенной для иммуноэлектрофореграмм в агаре. Удаление лишних белков перед высушива1нием геля, как правило, не является обязательным. [c.243]

Двойная иммунодиффузия. Используют 1,2%-ные (масс./об.) агаровые гели для двойной иммунодиффузии [26]. После образования дуг преципитации гели промывают буфером (0,15 М Na l в 10 мМ фосфатном буфере, pH 7,4) в течение 3 сут, а затем окрашивают, как описано для полиакриламидных гелей. [c.153]

Встречный электрофорез проводят в агаровом геле, pH которого устанавливают так, чтобы антитела (Ат) несли суммарный отрицательный заряд, а исследуемый антиген (Аг) - положительный. В электрическом поле антиген и антитела движутся навстречу друг другу и преципитируют. Принцип метода тот же самый, что и при двойной иммунодиффузии, однако чувствительность выше в 10 - 20 раз. Ракетный электрофорез позволяет количественно определять антиген в антителосодержащем геле, pH которого подбирают с таким расчетом, чтобы движения антител не происходило, а антиген нес суммарный отрицательный заряд. Линия преципитации очерчивает область в виде ракеты, длина которой пропорциональна концентрации антигена. Определить эту концентрацию можно по калибровочной кривой. Внизу справа - фотография окрашенного геля. Оба метода основаны на различии суммарных зарядов антигена и антител при выбранном pH для большинства антигенов такие различия существуют, так как антитела имеют более высокую изоэлектрическую точку (т. е. несут нейтральный заряд при более высоком значении pH, чем большинство антигенов). Если заряды антигена и антител существенно не различаются, можно химически модифицировать антиген, чтобы сдвинуть изоэлектрическую точку. Ракетный электрофорез проводят и в обратной постановке, если требуется определить концентрацию антител здесь важно подобрать правильно гель и pH для иммобилизации антигена, чтобы не нарушалась его структура и не возникло препятствий для реакции антиген-антитело. (Р - диаметр кольца преципитации.) [c.530]

Л—лунка заполняется белком 5 — электрофорез приводит к движению белков. Затем ток отключают и в желобок добавляют антисыворотку В — иммунодиффузия приводит к образованию преципитиновых линий. 1 — предметное стекло микроскопа 2 — лунка, заполненная антигеном 5—желобок для смеси антител 4 —полоска фильтровальной бумаги, насыщенная буфером 5 — агаровый гель 5 — антисыворотка. [c.244]

Для постановки реакции двойной иммунодиффузии по Оухтерлони растопленный агаровый гель выливают тонким слоем на стеклянную пластинку и после затвердевания вырезают в нем лунки размером 2—3 мм. В лунки раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые, диффундируя в агар, образуют в месте встречи преципитат в виде белой полосы. [c.178]

После завершения иммунодиффузии иммуноэлектрофорег-рамму можно сразу же сфотографировать без всякой обработки геля, причем лучше в рассеянном свете (при темнопольном освещении [952]). Кроме того, линии преципитации можно окрасить каким-либо белковым красителем. Перед окрашиванием непрореагировавшие белки необходимо отмыть солевым раствором. Для этого пластины геля вымачивают в течение 24—48 ч в солевом растворе, который несколько раз меняют. В последний раз гель промывают дистиллированной водой. Во время промывания слой геля может отделиться от стеклянной пластинки. Чтобы этого не произошло, стеклянную пластинку перед нанесением на нее горячего агарового золя следует покрыть тонкой. пленкой агара (на пластинку наливают разбавленный золь агара и дают ему высохнуть). После промывания гель накрывают полоской влажной фильтровальной бумаги, размеры которой на несколько сантиметров должны превышать размеры геля. Гель вместе с бумагой высушивают под вентилятором, а затем отделяют бумагу от высушенного слоя агара. Линии преципитации можно окрашивать практически любым красителем, применяемым для окрашивания белков после электрофореза в агаровом или агарозном гелях. [c.239]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология