Конкурентные методы определения

Рис. 3.67. Определение равновесных констант конкурентными методами.

КОНКУРЕНЦИЯ ДВУХ ОДНОВАЛЕНТНЫХ ЛИГАНДОВ ЗА ОДИН ЦЕНТР СВЯЗЫВАНИЯ. КОНКУРЕНТНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАВНОВЕСНЫХ КОНСТАНТ. КОНКУРЕНТНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА [c.230]

Как было показано в 3.3, в ряде случаев определение равновесных констант комплексообразования прямыми методами затруднено или невозможно. Тогда используют конкурентные методы определения констант связывания. Рассмотрим некоторые из них. Во избежание возможной путаницы в дальнейшем будем обозначать индексом 1 все, что относится к лиганду с известной константой связывания, а индексом 2 — все, что относится к лиганду с определяемой константой. [c.424]

Существующие конкурентные методы определения равновесных констант можно подразделить на два подтипа [c.424]

Рис. 73. Типичная калибровочная кривая для конкурентного радиоиммунного метода определения количества антигена

Обнаружение, выделение, очистка и изучение свойств фермента зависят прежде всего от наличия достаточно точного и быстрого метода определения активности фермента, а также подходящего метода определения общего белка. Точное определение активности фермента на ранних стадиях очистки часто бывает сопряжено со значительными трудностями, поскольку посторонние ферменты, присутствующие в препарате, могут конкурентно действовать на субстрат. Например, в присутствии АТФ-азы затруднено определение АТФ-зависимых синтетаз, а присутствие р-амилазы мешает определению а-амилазы. Многих трудностей, связанных, например, с подавлением активности продуктами реакции, инактивацией фермента и изменением степени его насыщения субстратом, можно избежать, если измерять начальные скорости реакции. [c.98]

Процессы связывания, протекающие по схеме (10.1) — (10.2), часто используются в двух аспектах а) для определения равновесных констант комплексообразования с помощью конкурентного вытеснения меченого лиганда изучаемым б) для аналитического определения концентраций лигандов конкурентным методом. Рассмотрим эти аспекты применения систем конкурентного связывания подробнее. [c.247]

Определение констант связывания конкурентными методами [c.344]

В заключение приведем результаты недавно выполненной работы Ю. М. Азизова с соавторами [95], исследовавших влияние давления на скорость разложения перекиси водорода каталазой. Определение велось конкурентным методом в качестве конкурентной реакции служило окисление аскорбиновой кислоты перекисью водорода в присутствии пероксидазы. Ранее Азизовым было показано, что давление в 1000 атм практически не влияет на скорость пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты. [c.241]

Химический (мономерный) состав сополимеров, определяемый методом ПГХ, может быть положен в основу изучения сложных процессов сополимеризации, поскольку состав образующегося сополимера связан с конкурентным протеканием различных элементарных процессов при полимеризации. Для понимания процесса полимеризации и управления им необходимым условием является измерение некоторых количественных характеристик и изучение кинетики сополимеризации. Существующие методы определения параметров процесса полимеризации весьма трудоемки и связаны с проведением большого объема экспериментальной работы. Применение хроматографии позволяет значительно снизить трудоемкость и сократить продолжительность проведения эксперимента как за счет экспрессности измерений, так и за счет проведения исследований при наличии небольших количеств вещества. [c.205]

Здесь имеет смысл кратко остановиться на вопросе о применимости конкурентных методов для изучения химических реакций с участием катион-радикальных интермедиатов. Такой подход был использован для оценки относительной реакционной способности ряда замещенных бензолов [13, 14]. Эти реакции протекают через быстрое обратимое взаимодействие окислителя с ароматическим соединением, приводящее к образованию соответствующего катион-радикала. Лимитирующей стадией является идущая после равновесия химическая реакция, такая, как отщепление протона. Исходные концентрации обоих субстратов были одинаковыми. Соотношение двух ион-радикалов, определенное по значению /< равн гомогенных реакций переноса электрона, оказывает влияние на полученную таким образом относительную реакционную способность. Поэтому при простом применении этого метода следует соблюдать осторожность, особенно если заранее известно, что скорость гомогенного переноса электрона велика и равновесие сильно смещено в одну сторону. [c.101]

Конкурентные методы анализа используют для различных антигенов, но чаще всего для определения гаптенов. Они отличаются простотой постановки реакции, но имеют ряд ограничений. Во-первых, в конкурентных методах предъявляются высокие требования к стандартизации количества связанных и добавленных реагентов. Во-вторых, чувствительность этих методов определяется в основном константой связывания антител. [c.118]

Рис. 115. Схема конкурентного метода (с недостатком связывающего реагента) иммуноанализа для определения стероидных гормонов (например, прогестерона).

Усиленный хемилюминесцентный иммуноанализ с пероксидазой в качестве ферментной метки применяли для определения многих соединений. Ряд примеров приведен в табл. 12.5. В этих иммуноанализах применяли конкурентные методы и методы с экстракцией иммунного комплекса, а также большинство обычно используемых твердых носителей (например, шарики, пробирки, мембраны, микротитровальные планшеты или микрочастицы). На [c.171]

Вначале рассмотрим практический метод определения наличия процесса конкурентного связывания лигандов, а затем перейдем к рассмотрению кинетики конкурентного связывания и конкурентных методов анализа. [c.412]

В простейшем случае для определения константы диссоциации конкурентными методами используют следующий алгоритм [c.421]

Показано, что если лиганд взаимодействует с несколькими типами рецепторов, то отношение констант ингибирования равно отношению констант диссоциации. При некооперативном характере взаимодействия лиганда с рецептором константа ингибирования равна константе диссоциации холодного лиганда (см. ниже Определение констант связывания конкурентными методами ). Таким образом, константа ингибирования характеризует степень специфичности данного лиганда по отношению к данному типу рецепторов. [c.421]

Глава 10. Конкуренция двух одяовалеитных лигандов за один центр свя зывания. Конкурентные методы определения равновесных констант [c.344]

Рис. 3.66. Определение константы диссоциации рецепторов с лигандом второго типа и числа мест связывания конкурентными методами.

Рис. 3.68. Определение чувствительности конкурентных методов анализа.

В ряде случаев прямое измерение константы ассоциации комплекса белок — органический лиганд невозможно либо вследствие недоступности меченого соединения, либо вследствие небольшого значения величины константы ассоциации. В этих случаях обычно используют методы определения констант связывания, основанные на вытеснении лиганда с Известной константой связывания исследуемым лигандом. Рассмотрим некоторые из этих методов. Во избежание возможной путаницы будем обозначать индексом 1 все, что относится к лиганду с известной константой, индексом 2 — все, что относится к лиганду с определяемой константой. Суше-ствующие конкурентные методы определения равновесных констант можно подразделить на два типа а) методы, основанные на ингибировании связывания ( вытеснении ) первого лиганда с постоянной концентрацией Lia возрастающими концентрациями второго лиганда Lia (см. рис. 108) б) методы, основанные на анализе равновесных кривых связывания первого лиганда в присутствии постоянной концентрации второго лиганда Ьга (см. рис. 109, ПО). Выбор метода зависит от условий эксперимента, доступности лигандов, поэтому трудно отдать предпочтение какому-либо одному из них. [c.248]

На основе реакции двухсубстратного (люминол и люциферин) пероксидазного окисления разработаны твердофазные иммуиомет-рические методы для определения антител к вирусу краснухи человека и конкурентный метод определения дигоксина. Чувствительность этих анализов была сопоставима с соответствующими вариантами фотометрических методов ИФА. Твердофазный метод [c.137]

В данном разделе рассмотрен конкурентный метод определения тироксина, даоваииый на одновременном связывании определяемого (Т4) и меченного фоксидазой Т4 (Т4-ПХ), адсорбированными иа полистироле специфическими тнтелами. [c.280]

Примечание. Если в препарате дегидрогеназы глюкозо-6-фос-фата имеется примесь дегидрогеназы-6-фосфоглюконата, при энзиматическом методе определения активности фосфоглюкозоизомеразы образуется 6-фосфоглюконат — конкурентный ингибитор фермента. Учитывая количество образовавщегося б-фосфоглюконата, вносят поправку при расчете активности фосфоглюкозоизомеразы. [c.234]

При конкурентном методе РИА на поверхности полистироловых лунок сорбируют известные АТ. Затем в лунки вносят исследуемый антигенсодержащий материал и спустя определенное вре- [c.81]

Дифференцированное определение макроконстант. Если несколько макроконстант имеют близкие значения, т. е. несколько различных групп титруются в одном интервале pH, величина р/Са, определяемая из уравнения (IV. 14), уже не будет постоянной в этом интервале, так как будет происходить параллельная ионизация нескольких групп. Поскольку такой случай встречается достаточно часто, ниже будет описан метод определения макроконстант в условиях конкурентной ионизации нескольких групп микроконстант мы при этом касаться не будем. [c.93]

Существует несколько подходов к оценке чувствительности конкурентных методов анализа. Чувствительность характеризуют тангенсом угла наклона кривой зависимости какого-либо параметра связывания. от концентрации лиганда La (Yalow, Berson, 1968) и определяют как минимально измеряемую из данной кривой концентрацию лиганда (ALa)o (Ekins et al., 1968). Последнее определение является более корректным и поэтому будет служить [c.260]

Рассмотрим теперь, как можно учесть неспецифическое связывание при определении равновесных констант комплексообразования конкурентными методами. Для примера остановимся на методе вытеснения двумя одновалентными лигандами меченого лиганда (с. 251) (Blondeau et al., 1978). В присутствии неспецифичеокого связывания (практически ненасыщаемого) имеем [c.298]

Основой метода послужило наблюдение Ландштейнера [113 , показавшего, что вещества простого строения, сходные или идентичные детерминантной иммунологической группе антигена, могут образовывать комплекс с антителом и тем самым конкурентно тормозить реакцию между антигеном и антителом. Предполах ают, что чем ниже концентрация вещества, способная вызывать торможение реакции преципитации, тем ближе сродство между ним и детерминантной группой антигена. При изучении групповых веществ крови можно применять как метод, основанный на торможении реакции гемагглютинации под действием специфической антисыворотки, так и метод, основанный на торможении преципитации растворимых в воде групповых веществ специфической преципитирующей антисывороткой. Если о степени торможения преципитации судить по количеству азота антител [114, 115]. то можно достичь более высокой точности, чем при использовании реакции торможения гемагглютинации с применением серии разведений ингибитора. Оба метода дают ценную информацию о структуре групповых веществ, однако метод торможения гемагглютинации требует меньшего количества групповых веществ, чем метод с использованием реакции торможения преципитации. Эти два метода определения структуры детерминантных групп групповых веществ крови обсуждаются Кабатом [116[ и Уоткинс и Морганом [117]. [c.179]

Сульфат эстрона. Сульфат эстрона (Oej-3-S) представляет собой сульфопроизводное стероида он секретируется в относительно большом количестве фетоплацентой. Концентрация этого соединения в крови или молоке коров и свиней является надежным показателем фертильности. Определение концентрации Oe -3-S дополняет результаты определения прогестерона у элитных животных. Разработано несколько методик ИФА для определения Oej-3-S в молоке [5] и сыворотке коров [6]. Так как молекулярная масса Oej-3-S невелика (349), его иммунохимическое определение возможно только с помощью конкурентных методов иммуноанализа. В настоящее время наборы для определения Oej-3-S промышленностью не производятся. [c.107]

Определение гормонов методом конкурентного иммуноанализа. Сообщалось о применении конкурентного метода DELFIA для определения кортизола [31 ] и дигоксина [32]. В этом методе определяемое вещество и определенное количество конъюгата гаптен-белок, иммобилизованного на твердой фазе, конку1 1-руют за ограниченное число центров связывания антител, меченных Ей. На этом же принципе основаны разработанные нами методики анализа DELFIA для прямого (без экстракции) определе- [c.159]

Схема непрямого конкурентного анализа. Вариант ИФА,. предложенный в работе (Yorde et al., 1976), представляет собой непрямой конкурентный метод количественной оценки содержания антигена. Согласно определению непрямого конкурентного метода (Yorde et al., 1976), он основан на количественном измерении избытка свободных антител, остающихся в системе после добавления образца, содержащего неизвестное количество антигена, и этим отличается от прямых методов, которые основаны на непосредственном измерении содержания антигена (Engvall et al., 1971). Непрямые методы анализа выгодно использовать, когда а) антигены одновалентны, как в случае гаптенов, и не удается применить обычный сэндвич-анализ,, [c.241]

ВХОДИТ несколько молекул моновалентных антител, неизбежно ограничивает чувствительность определения до значений, характерных для конкурентных методов. Это обусловлено невозможностью отделения полностью свободных антител от би- или поливалентных антител, у которых хотя бы один из центров связывания остался свободным —и те, и другие будут связываться с сорбентом. В то же время в ряде случаев требования к чувствительности определения антигена таковы, что их вполне удается удовлетворить с использованием немономерных конъюгатов [фермент — моновалентные антитела], особенно при наличии антител с высоким сродством к антигену. В качестве примера можно отметить разработку на основе ИААК чувствительного (нижний предел обнаружения 0,2 нМ) и очень точного (коэффициент вариации меньше 3%) автоматизированного метода определения дигоксина (Leflar et al., 1984). В этом случае для детектирования использовали немономерный конъюгат типа [F(ab )s — р-галактозидаза]. [c.247]

До сих пор предполагалось, что с рецептором или рецепторами различных типов связывается один тип лигандов. Данное предположение верно лишь при ряде исследований, проводимых in vitro. Однако, как будет показано далее, оно нарушается при проведении радиорецепторных исследований и (или) при определении константы диссоциации конкурентными методами. Кроме того, in vivo в микроокружении рецепторов одного типа, как правило, существует достаточно большое количество разнообразных лигандов, отличающихся по степени сродства и специфичности к данному типу рецепторов. [c.404]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология