Анализ, методы общие, определение белка

Анализ белков. — Белки обычно гидролизуют кипячением с 20,%-ной соляной кислотой или 35%-ной серной кислотой. Щелочной гидролиз сопровождается глубокой рацемизацией и применяется толыко лри определении триптофана и тирозина, чувствительных к минеральным кислотам. Ферментативный гидролиз протекает медленно и, вероятно, не полностью, однако он не осложняется деструкцией лабильных продуктов, образующихся ири гидролизе. Если аспарагиновая и глутаминовая кислоты присутствуют в белке в виде амидов,, то кислотный гидролиз превра1цает амидный азот в соответствующие аммонийные соли. Методом Кьельдаля определяют количество общего- [c.654]

Интенсивное изучение пространственного строения синтетических полипептидов продолжалось в течение 1950-х и первой половины 1960-х годов. Были привлечены практически все известные физические и физикохимические методы, позволяющие получать информацию о строении молекул в твердом состоянии и в растворах. Наибольшее количество данных было получено с помощью рентгеноструктурного анализа, методов рассеяния рентгеновских лучей под малыми углами, дисперсии оптического вращения, кругового дихроизма и дейтерообмена, с помощью обычных и поляризованных инфракрасных спектров. Из полученного при исследовании синтетических полипептидов огромного экспериментального материала, однако, не удалось сделать обобщающих заключений о причинах стабильности регулярных структур и сказать что-либо определенное на этой основе о принципах структурной организации белков. И тем не менее, результаты исследования повсеместно были восприняты как подтверждающие ставшее общепринятым представление о том, что пространственное строение белковой глобулы представляет собой ансамбль унифицированных регулярных блоков вторичных структур, прямую информацию о геометрии которых дают высокомолекулярные синтетические пептиды. а-Спиральная концепция Полинга не только не была поставлена под сомнение, но еще более утвердилась. В 1967 г. Г. Фасман писал "Общепризнано, что лишь несколько конформаций, благодаря своей внутренней термодинамической стабильности, будут встречаться наиболее часто и, по-видимому, именно они составляют общую основу белковой структуры" [5. С. 255]. Между тем, в то время уже были известны факты, настораживающие от безусловного принятия а-спиральной концепции Полинга. Но они выпадали из множества других фактов, согласующихся с традиционным представлением, казавшимся логичным и правдоподобным, к тому же не имевшим альтернативы. Поэтому на данные, противоречащие концепции Полинга, долгое время не обращали внимания. [c.72]

Анализ белков.— Белки обычно гидролизуют кипячением с 20%-ной соляной кислотой или 35%-иой серной кислотой. Щелочной гидролиз сопровождается глубокой рацемизацией и применяется только при определении триптофана и тирозина, чувствительных к минеральным кислотам. Ферментативный гидролиз протекает медленно и, вероятно, не полностью, однако он не осложняется деструкцией лабильных продуктов, образующихся при гидролизе. Если аспарагиновая и глутаминовая кислоты присутствуют в белке в виде амидов, то кислотный гидролиз превращает амидный азот в соответствующие аммонийные соли. Методом Кьельдаля определяют количество общего азота содержание амидного азота устанавливают подщелачиванием аликвотной порции и отгонкой аммиака в отмеренный объем титрованной кислоты. В этом случае количество аммиака соответствует количеству присутствующих в белке амидов дикарбоновых аминокислот. [c.640]

Количественное определение белков производят, как правило, определением общего азота по Кьельдалю. Исходным веществом в этом анализе могут служить осадки белков, полученные при номощи описанных выше осаждающих реактивов. Свободные ННа-группы белка определяются методом Ван-Слейка (см. Аминокислоты ). [c.442]

Важнейшей областью применения электрофореза является анализ биоколлоидов, например анализ смесей белков в клиническом анализе. Белки, как амфотерные полиэлектролиты, обладают собственными зарядами, зависящим от pH среды. Регулируя значение pH, можно в широких пределах менять их подвижность и даже изменить направление движения в процессе электрофореза. Для каждого белка при определенном значении pH общее число положительных зарядов равно общему числу отрицательных зарядов. Эта изоэлектрическая точка, при которой отсутствует движение частиц, является характерной величиной для определенного белка. Растворимость белка в этой точке минимальна. Подбирая соответствующие буферные растворы для установления определенной скорости движения и растворимости веществ, можно приспособить процессы электрофореза для решения разных проблем разделения веществ. Таким образом, электрофорез превосходит метод бумажной хроматографии. Кроме того, при помощи электрофореза, особенно при высоком напряжении, можно проводить разделение неионогенных веществ (например, сахар в виде боратного комплекса) [79]. Методом электрофореза можно также определять изоэлектрические точки амфотерных веществ или заряды коллоидных частиц (по направлению движения). [c.387]

Основные положения предложенной мною конформационной теории белков были сформулированы в общем виде и имели вначале чисто эвристический характер [40, 41]. Создание расчетного метода требовало их детализации и тщательной проверки. Достоинство теории даже в ее первоначальной, быть мо жет, несовершенной форме заключалось в том, что она позволяла всю необходимую работу с первой и до завершающей стадии заранее представить в виде строго последовательного ряда логически связанных между собой шагов, где каждое продвижение вперед опиралось на результаты предшествующих исследований и предваряло последующее. Иными словами, теория, отражавшая вначале чисто субъективное представление автора о структурной организации белка, в то же время представляла собой достаточно четко ориентированную рабочую программу исследования. Одно из положений теории, а именно предположение о согласованности в белковой глобуле всех внутри- и межостаточных взаимодействий, давало возможность разделить задачу на три большие взаимосвязанные части. Цель первой заключалась в кон-формационном анализе свободных остатков стандартных аминокислот, т.е. в оценке ближних взаимодействий валентно-несвязанных атомов. Идеальными моделями для изучения ближних взаимодействий явились молекулы метиламидов М-ацетил-а-аминокислот (СНз-СОМН-С НК-СОЫН-СНз). Вторая часть общей задачи состояла в выяснении влияния средних взаимодействий, т.е. взаимодействий между соседними по цепи остатками. Объектами исследования здесь могли служить любые природные олигопептиды. Цель третьей, завершающей части - изучение роли контактов между удаленными по цепи, но пространственно сближенными в глобуле остатками и априорный расчет трехмерной структуры белка. В дефинициях нелинейной неравновесной термодинамики эти цели могут быть сформулированы следующим образом. Во-первых, определение возможных конформационных флуктуаций у свободных аминокислотных остатков и выявление энергетически наиболее предпочтительных. Во-вторых, нахождение возможных конформационных флуктуаций локальных участков полипептидной цепи и установление среди них бифуркационных флуктуаций, ведущих к структурированию фрагментов за счет средних невалентных взаимодействий. В-третьих, анализ возможных флуктуаций лабильных по средним взаимодействиям участков полипептидной цепи и идентификация бифуркационных флуктуаций, обусловливающих комплементарные взаимодействия конформационно жестких нуклеаций, стабилизацию лабильных участков и, в конечном счете, образование нативной трехмерной структуры молекулы белка. [c.109]

Метод электрофореза широко применяют в клинике для анализа белков плазмы и сыворотки крови. Концентрация белков плазмы составляет 60—80 г/л. Сыворотка крови представляет собой плазму, лишенную фибриногена. При заболеваниях может изменяться как общее количество белков плазмы, так и содержание отдельных белков или белковых фракций без изменения общего количества белка. При некоторых заболеваниях, например при воспалении почек, циррозе печени и др., наблюдается уменьшение содержания белков плазмы (за счет снижения количества альбуминов). Напротив, острые инфекционные заболевания, возникновение некоторых злокачественных новообразований сопровождаются повышенным содержанием белков в крови, чаще всего глобулиновой фракции. Поэтому анализ белков сыворотки крови имеет большое диагностическое значение и позволяет наблюдать за ходом лечения. Суммарный заряд белковой молекулы изменяется в зависимости от pH и при определенном значении pH (изоэлектриче-ская точка) равен нулю. Белок в изоэлектрическом состоянии при электрофорезе не передвигается ни к катоду, ни к аноду, наименее устойчив в растворе и при стоянии выпадает в осадок. [c.31]

Общая стратегия определения первичной структуры белка включает несколько этапов. Необходимо (а) провести количественный анализ гидролизата для того, чтобы определить мольное соотнощение имеющихся аминокислот (см. разд. 23.3.2) (б) определить молекулярную массу с помощью подходящего физического метода для того, чтобы вычислить количество всех присутствующих аминокислотных остатков [I—3] (в) определить количество входящих в молекулу полипептидных цепей либо с помощью хроматографического или электрофоретического разделения, либо посредством количественного анализа остатков, содержащих аминогруппу (JV-конец) и карбоксильную группу (С-конец) (см. разд. 23.3.4) [c.256]

В табл. 5.9 сопоставлены значения Ха для ряда белков, определенные различными методами. Эти данные находятся, в общем, в разумном согласии с результатами рентгеноструктурного анализа для белков, отмеченных звездочками. [c.319]

Впервые общий метод определения аминокислот в гидролизатах белков был предложен Э. Фишером. В настоящее время разработаны весьма совершенные методы анализа продуктов гидролиза белка, позволяющие с большой точностью определять качественно и количественно содержание отдельных аминокислот в тех или иных белковых веществах после их гидролиза. Эти методы основаны главным образом или на осаждении отдельных аминокислот специфическими реактивами, или на образовании с последними характерной окраски. [c.33]

Метод рентгеноструктурного анализа — один из наиболее эффективных общих методов определения молекулярных структур. С его помощью были успешно расшифрованы структуры многих сложных химических соединений (сошлемся в качестве примера на витамин Bia)- В своем классическом виде рентгеноструктурный анализ применялся для изучения молекул, значительно менее сложных, чем даже самые простые белки. Однако Перутц и Кендрью своими блестящими опытами убедительно показали, что, по крайней мере в некоторых случаях, этот метод может быть с успехом применен также и для исследования структуры белковых молекул. [c.104]

Организм человека и животного способен адаптироваться к изменению режима питания и его белковой части. Но иногда механизмы ферментативной адаптации оказываются недейственными и утилизация белка нарушаете. . Это может наблюдаться при наличии или при образовании особых свойств пищевых белков в результате жесткой или необычной обработки при приготовлении пищи. В подобных случаях возникает несоответствие между данными, полученными химическими методами, и фактическими результатами утилизации аминокислот в эксперименте на животных. Так, из общего количества аминокислот, находящихся в белке, определенного химическим анализом после кислотного гидролиза, организмом усваивается лишь определенная доля. Об остальных аминокислотах говорят как о недоступных . Это расхождение между общим количеством аминокислот и действительно утилизированным их количеством трудно предвидеть, что ведет к различным ошибкам в определении качества белка пищи. [c.7]

Монография немецкого ученого К- Бауера Анализ органических соединений является новейшей и наиболее полной из всех зарубежных книг, посвященных данной области органической химии. В книге содержится описание методов открытия, идентификации и количественного определения важнейших групп и отдельных представителей органических соединений, включая углеводороды, галоидопроизводные, спирты, фенолы, простые и сложные эфиры, хиноны, нитропроизводные, амины, альдегиды, кетоны, одноосновные и многоосновные кислоты, окси- и аминокислоты, ангидриды, сернистые соединения, углеводы, жиры, белки, алкалоиды, витамины, стерины и др. По каждому классу дан обзор общих групповых реакций и описаны специфические методы открытия и количественного определения важнейших представителей класса. [c.3]

Этот метод может быть, наиример, использован для определения истинного выхода химической реакции в том случае, если выделение веществ затруднительно. Он применим к химическому анализу всех видов—это по существу наиболее известный общий метод,—но особенно хорош он для исследования смесей веществ, близких по своим свойствам. Смесь аминокислот, полученная при гидролизе белка, в течение многих лет не поддавалась количественному анализу. Однако эту проблему можно разрешить методом изотопного разбавления, который в современной химии белка применяли бы еще чаще, если бы хроматография и микробиология, достигшие столь эффективных успехов, не дали нам других методов анализа. Как часто бывает при развитии науки, один непреодолимый барьер был пробит сразу в нескольких местах. [c.264]

В случае преобладания углеводных компонентов разложение аминокислот нри гидролизе происходит в большей степени. Некоторые группоспецифические гликопептиды крови, содержащие 7—15% белка, были гидролизованы перед аминокислотным анализом в кипящей 6 н. соляной кислоте при не указанном, но, вероятно, низком разбавлении [73]. Расчет выхода азота показал, что только 69—91% азота, определенного по методу Кьельдаля, обнаруживается в аминокислотах и гексозаминах. Амидный азот не определяли, но даже если принять, что все кислотные группировки боковых аминокислотных цепей существуют в виде амидных групп, выход общего азота был бы лишь немного больше (71—94%). Хотя не исключено, что в веществах присутствовали неизвестные азотистые составляющие (сиаловые кислоты не обнару кены), весьма вероятно, что в условиях гидролиза произошло значительное разложение аминокислот. [c.134]

Все методы, применяемые для наблюдения за процессом выделения белков и фракционирования смесей, в которых содержатся белки, можно подразделить на три группы. В первую группу входят главным образом методы определения общего содержания белка. Сюда могут быть также отнесены методы анализа других классов веществ, с которыми соединяются белки, например липи-дов, углеводов и нуклеиновых кислот. Вторая группа охватывает специфические (химические или биологические) методы определения индивидуальных составных частей смеси. Каждая предполагаемая составная часть должна быть определена в отдельном опыте с помощью другого метода. Эти методы, особенно некоторые биологические способы анализа, различаются по своей чувствительности и специфичности. К третьей группе относятся методы (преимущественно физико-химические) оценки гомогенности белковых препаратов. В пределах применимости используемых методов при каждом из таких определений учитывается все количество белка. [c.16]

Поглощение ультрафиолетового излучения. Большинство белков поглощает ультрафиолетовое излучение с длиной волны около 280 тр. Было показано1 [91—94], что это поглощение обусловлено тирозином, триптофаном и (в меньшей степени) фенилаланином. Таким образом, величина поглощения зависит от содержания этих аминокислот в белке. Измерение оптической плотности белкового раствора при 280 пу служит удобным и точным методом определения концентрации белка [95], если известен коэффициент экстинкции и в растворе нет других веществ, поглощающих свет с этой длиной волны. Рассматриваемый метод можно также применять для приближенного измерения общего содержания белков в смеси в тех случаях, когда допустимо использование среднего коэффициента экстинкции. Метод имеет то преимущество, что на поглощение света не влияют растворенные соли и многие другие вещества и что, следовательно, определение можно производить на образцах белковых фракций без всякой специальной их подготовки, Анализ производится быстро, причем требуются всего лишь доли миллиграмма белка. [c.20]

Методы, основанные на анализе составных частей молекул белка, включают определение элементов азота и углерода, некоторых аминокислот, например тирозина, биуретовой и фор1-мольной группировок. Отдельные белки могут быть иногда определены по специальным группам, например по железу в гемоглобине [2, 3] или иоду в тиро-глобулине. Все эти методы требуют, чтобы определяемая составная часть находилась в испытуемом образце исключительно в белковой части. Поэтому белок должен быть отделен от всех других органических веществ и карбонатов, если он определяется по углеродному составу, и от всех других азотсодержащих составных частей, если основой анализа является метод Кьельдаля. Обычная практика анализа кормов и овощей на белки на основании определения общего азота в этом отношении всегда внушает сомнения. Наличие алкалоидов, аминокислот или других азотсодержащих веществ в таких веществах достаточно вероятно, хотя, как правило, их количества малы по сравнению с содержанием белка. Вследствие изменчивости свойств различных белков нет общих методов их выделения из сложных смесей. В хорошо изученных системах могут применяться специальные методы выделения. [c.15]

Кроме вариабельности в содержании непосредственно белков, что в той или иной степени отражается на содержании аминокислот, имеет большое значение видовая или сортовая вариабельность аминокислот одного и того же продукта. Кроме того, в отличие от метода определения белков метод определения аминокислот дает значительно большой вклад в общую вариабельность аминокислотного состава. Выше бьши подробно рассмотрены причины расхождений в аминокислотном анализе, в том числе проведение одного гидролиза вместо пяти, отсутствие анализа стандартных образцов продукта и внешнего стандарта и т. д. В результате в высокобелковых продуктах (мясо, рыба, птица, зерно и зернобобовые) при определении лизина, лейцина, изолейцина, треонина, валина, аргинина, глицина, пролина, серина, гистидина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, фенилаланина, аланина, тирозина, общий коэффициент вариации (относительное среднеквадратичное отклонение) равен 10%, при определении метионина — 15 %, триптофана и цистина — 25% [12]. Для низкобелковых (овощи и фрукты) вариабельность значительно выше — 20, 25 и 30% соответственно [12]. Эти расчеты хорошо совпадают с прямыми экспериментальными данными по межлабораторному испытанию определения состава аминокислот ряда высокобелковых продуктов (казеин, белок яиц, соя, [c.287]

Быстрое развитие иммунологии нашло свое отражение в данной, третьей книге из серии Иммунологические методы , которая включает изложение экспериментального опыта, накопленного в Базельском институте иммунологии. В нее входят пять глав, посвященных применению рекомбинантных ДНК в иммунологии в двух главах описано использование высокоэффективной жидкостной хроматографии для разделения белков отдельные главы касаются следующих вопросов применение моноклональных антител для идентификации мембранных антигенов лимфоцитов, типирование антигенов гистосовместимости, новые методы анализа белков с помощью двумерного электрофореза, лимфокины, поддерживающие рост В-клеток. В четырех главах описано получение и ведение линий клонированных В- и Т-кле-ток и гибридом, а еще в четырех обсуждаются новые методы детектирования клеток, продуцирующих ревматоидный фактор. Две главы посвящены таким общим иммунологическим методам, как флуоресцентный сортинг клеток и анализ методом лимитирующих разведений, и наконец, четыре последние главы касаются сложных методов, используемых при работе с определенными видами животных (птицами, овцами и амфибиями) для изучения специальных иммунологических вопросов. [c.7]

Выявление связывающей способности белков по отношению к углеводородам различной природы представляет интерес и с точки зрения изучения общих закономерностей образования комплексов белок—лиганд. Вишниа и Пиндер [165, 166, 183] дали подробный анализ предлагаемых в литературе механизмов связывания углеводородов белковыми молекулами и также пришли к выводу, что в структуре глобулярных белков имеются гидрофобные области (объемы), где и локализуются молекз лы углеводородов. Хорошо известно, что для определения локализации и роли отдельных функциональных групп белка имеются подробно разработанные методики. Одцако не существует удовлетворительных методов [c.38]

ТОД широко применяют для обнаружения в элюатах белков и крупных пептидов, но он недостаточно универсален. Более общим методом анализа, не зависящим от аминокислотного состава пептидов, является измерение поглощения в области 180— 220 нм, где пептиды и белки характеризуются высокими коэффициентами поглощения [1] (например, поглощение при 210 нм в 10—20 раз выше, чем при 280 нм). Однако здесь имеются определенные технические трудности. Кроме того, в этой области интенсивным поглощением обладают почти все известные буферные растворы исключение составляют нелетучие буферы на основе неорганических солей. Можно также вести анализ по флуоресценции ароматических группировок. Этот метод обладает более высокой чувствительностью по сравнению со спек-трофотометрией при 280 нм, но область его применения также ограниченна. [c.391]

Второй метод определения азота разработан в 1883 г. Кьельдалем-, Навеску вещества нагревают с концентрированной серной кислотоГ , обычно с добавкой какого-либо окислителя (КМПО4, НСЮ4), в результате чего вещество разлагается, а содержащийся в нем азот превращается в аммиак и образует сульфат аммония. Раствор разбавляют п после прибавления избытка ш,елочи аммиак отгоняют с водяным паром, пропуская его в титрованный раствор серной кислоты. Титрованием непрореагировавшей кислоты можно определить количество образовавшегося аммиака. Метод Кьельдаля, будучи менее общим, чем метод Дюма, применяется для быстрого анализа веществ с низким содержанием азота, например белков. [c.22]

Было предположено компенсировать тормозящее действие аммиака и других веществ вычерчиванием кривой кажущегося содержания аргинина во взятом для анализа количестве белка [127]. Полагают, что при экстраполяции кривой до нулевой концентрации белка можно получить истинное значение аргинина. Такой общий метод был применен ранее Краусом и Ра-гинсом для триптофана и Бёшиллом, Лемпитом и Бекером для определения цистина. [c.53]

Опыт показал, что исходный гидролиз белков до аминокислот является одним из серьезных препятствий при проведении анализа. За исключением спектрографических методов для ароматических а.минокислот (см. гл. 1J) и некоторых реакций на цистин (см. гл. III), имеется лишь один общий принцип исследования белков без предварительного гидролиза, при помощи которого можно будет достигнуть достаточной точности. Это наблюдение Видла и Татума Г60], нашедших, что под влиянием рентгеновских лучей возможно вывести определенные штаммы neurospora, которые нормально развиваются на полноценной питательной среде, но почти не растут, если в среде нехва ает одного ингредиента. Удалось среди 2000 выведенных штаммов выбрать три таких. мутанта. Один из них не обладал способностью синтезировать пиридоксин, другой — тиамин, а третий не был в состоянии обойтись без добавления л-аминобензойной кислоты. Если бы удалось вывести подобные штаммы из этого или другого вида микроорганизмов, которые реагировали бы таким же образом на определенные аминокислоты в неизмененной белковой молекуле, то открылся бы путь для создания нового метода анализа. [c.350]

Большой отрезок времени в истории науки о белке занимают поиски принципиальных общих черт строения молекулы белка. Этому периоду А. Н. Шамин и уделяет главное внимание. Читая книгу, невольно увлекаешься борьбой идей, логикой развития структурных представлений, видишь, как этап за этапом, непрерывно обогащаясь экспериментальными фактами, представления о строении белка постепенно переходят от смутных, неопределенных, грубых моделей в более четкие, конкретные, изощренные и, наконец, достигают вершины сегодняшнего дня — установления трехмерной структуры белка. Эта последняя часть выполнена или вернее выполняется сейчас не химическими методами, а методами рентгеноструктурного анализа. Тем не менее, результаты этих поисков основываются на прочной базе структурных представлений органической химии и их следует рассматривать как плод почти двухвековой напряженной работы человеческой мысли. Можно только удивляться, что человек, никогда не видя атомов, сумел разглядеть строение молекулы белка, состоящего из тысяч атомов, для каждого из которых уготовано свое определенное место. [c.4]

Определение сахаров в гликонротеине нуждается в подходе, несколько отличающемся от того, который используется при анализе аминокислотного состава белков. Во-первых, все методики количественного определения данного сахара требуют освобонедения моносахарида из его глпкозида либо в отдельной предварительной стадии, либо в общей части используемой аналитической процедуры. Это объясняется тем фактом, что, вообще говоря, единственными функциональными группами, присутствующими в углеводной части гликопротеинов и обнаруживаемыми физическими или химическими методами до гидролиза, являются гидроксильные группы, общие для всех типов сахаров. Конечно, имеются также карбоксильные группы сиаловых кислот, обусловливающие сильно кислотный характер гликопротеинов, содержащих остатки сиаловых кислот. С другой стороны, боковые цепи аминокислотных остатков обычно свободны, сильно отличаются по структуре и реакционной способности и многие из них могут быть обнаружены и определены количественно физическими или химическими методами. Так, измерение поглощения в ультрафиолете применяется для определения тирозина и триптофана с помощью специальных методик можно отличить цистеин от цистина, а аргинин и гистидин можно определить колориметрическими методами, причем все это выполняется на интактном белке. [c.195]

К числу прямых методов, используемых для идентификации атомов или боковых цепей, к которым присоединяются ионы металлов, относятся рентгеноструктурный анализ (см. исследование миоглобина) и ядерный магнитный резонанс (см. изучение ион металла — РНаза, разд. 4.6). Кроме того, для этой цели используются различные непрямые методы. К числу последних относятся исследование влияния модификации боковой цепи специфического бел-ка на связывание с металлом, титриметрические определения значений рКа. участвующих в координации лигандных групп (разд. 3), и, по мере щозможности, корреляция спектров комплекса иона металла с белками со спектрами подходящих модельных систем. Хотя в случае металлопротеинов это последнее и рискованно, оно оказалось особенно плодотворным для изучения неспецифических комплексов ионов металлов с белками. Исследование влияния модификации белка на связывание с металлом несомненно играет полезную роль, однако при этом необходимо учитывать возможность того, что модификация боковой цепи, которая ранее не участвовала в связывании, может повлиять на него 1В результате изменения либо общего заряда на белке, либо его конформации. [c.276]

Задача определения азота, входящего в состав амидов, содержащихся в физиологических жидкостях (и тканях), отличается от задачи определения содержания амидного азота в молекуле белка. В физиологических жидкостях, вследствие присутствия мочевины, а также других соединений, содержащих азот, метод полного гидролиза исследуемых соединений использован быть не может. Поэтому анализируемый образец подвергают гидролизу в мягких условиях, в результате которого только амиды, входящие в состав образца, превращаются в аммиак. При анализе некоторых жидкостей, например мочи, серьезной помехой является аммиак, поскольку он присутствует в количествах, значительно превосходящих количество амидов, и определяется с помощью любого метода, который может быть использован для определения аммиака, образующегося в результате гидролиза амидов. Борсук и Дубноф [5] в общих чертах описали ультрамикрометод определения амидов. Однако они не привели никаких данных относительно пределов применения этого метода, его надежности, а также воспроизводимости получаемых с его помощью результатов. Исследования этого метода в лаборатории автора показали, что при анализе таких веществ, как аспарагин, глутамин и ацетамид, он дает несколько заниженные и плохо воспроизводимые результаты. [c.209]

Ввиду неопределенности критериев и трудности определения чистоты белка целесообразно выбрать другой путь исследования, а именно сравнительный анализ. Этот метод позволяет обнаружить, какие группы определяют функцию одинаковых белков (например, инсулина) различных биологических видов. Такой метод исследования имеет большое преимущество, если его сочетать с изучением ингибирующего действия. Еще одним путем исследования может быть анализ белков, близких по выполняемым функциям. Например, вое ферменты гликолитического цикла являются более или менее исследованными для каждого последующего фермента субстратом является продукт, образующийся в результате действия предыдущей системы ферментов. Сравнение тех ферментов гликолитического цикла, которые катализируют перенос атомов водорода (например, изомераза) или фосфатных групп (например, гексокиназа, фосфогексокиназа и дифосфогли-церофосфокиназа), представляло бы особый интерес, потому что каждая такая группа ферментов может иметь много общих структурных особенностей. С этой точки зрения можно рассматривать также соответствующие ферменты гликолитического цикла в дрожжах и мышцах. [c.251]

Работа 5. Определение концентрации общего белка в сыворотке (плазме) крови биуретовым методом (набор НТК Анализ-Х ) (УИРС) [c.41]

Доступность синтетических полипептидов сыграла большую роль в уточнении условий, определяющих устойчивость вторичной структуры, однако установление третичной структуры значительно сложнее. Это было наглядно показано путем определения конформаций миоглобина [32] и гемоглобина [34] методом рентгеновского кристаллографического анализа. Белок миоглобина состоит из единственной полипептидной цепи с восемью сегментами правой а-спирали. В спираль входит 7—24 аминокислотных остатка, а их общая длина составляет примерно 78% полипептидной цепи. Два остатка образуют острые углы, а другие спиральные сегменты отделяются за счет изменения длины цепи при переходе к нерегулярной конформации. Кендрью [376] обсудил некоторые особенности структуры белков, которая чрезвычайно компактна и имеет внутри не более пяти изолированных молекул воды. За очень редким исключением, все полярные группы располагаются снаружи молекулы, и, следовательно, боковые цени, находящиеся в контакте друг с другом внутри молекулярной структуры, как правило, имеют гидрофобный характер. Таким образом, создается впечатление, что гидрофобное взаимодействие должно быть основным фактором, стабилизующим конформацию. Однако остается спорным вопрос о том, что же определяет точки, в которых происходит нарушение конформации. Известно, что остаток пролина может и не размещаться в а-спирали однако это ограничение не может служить объяснением всех неспиральпых последовательностей в молекуле миоглобина. Состав неспиральных участков не имеет также никакого отношения к классификации синтетических полипептидов в соответствии с их тенденцией к существованию в спиральной форме [377]. Интересно, что конформации миоглобина и четырех субъединиц, составляющих молекулу гемоглобина, несмотря на различную последовательность Б них аминокислот, должны быть весьма сходны между собой [378, 379]. В таком случае третичная структура будет, по-видимому, определяться сложными соотношениями, которые детально не исследованы. [c.135]

Возможно, наиболее важный результат исследований Шлезингера состоял в следующем. С помощью дифференциального центрифугирования неочищенных фаговых суспензий и пропускания их через фильтры с градуированным диаметром пор ему удалось выделить фаговые частицы в количествах, достаточных для определения их массы затем с помощью прямого химического анализа очищенного фага он показал, что фаг состоит в основном из примерно одинаковых количеств белка и дезоксирибонуклеиновой кислоты. Хотя фаговые частицы невозможно видеть под обычным микроскопом, Шлезингеру удалось непосредственно определить общее число фаговых частиц в очищенном препарате, подсчитав число светящихся точек в темном поле микроскопа. Таким путем он установил, что число фаговых частиц в препарате приблизительно равно инфекционному титру, определенному методом Д Эрреля. [c.253]

Сравнение кинетики сворачивания родственных блоков, полученных методом генной инженерии и отличающихся между собой аминокислотным составом боковых цепей, позволяет подойти к определению структуры промежуточных состояний при сворачивании. Незначительные изменения в боковых цепях белка мутантов не нарушают общей картины сворачивания, но выявляют роль определенных взаимодействий в этом процессе. Анализ более 120 мутантов, включающих изменение более половины боковых цепей барназы (РНК-аза белок со 110-ю остатками), подтвердил определяюшую роль гидрофобных взаимодействий в стабилизации зародышей вторичной и третичной структуры (Фершт, 1993). По-видимому сворачивание в барназе начинается на N-кoнцe, образующем а-спирали, и центральной -шпильке, которые затем притягиваются и стабилизируются гидрофобным взаимодействием. При сохранении общего направления сворачивания основной последовательности возможны небольшие различия в структуре интермедиатов, отражающие роль боковых цепей. В целом становится ясным, что в белках вторичная структура служит блоком при формировании третичной структуры и должна поэтому быстро образовываться и быть относительно стабильной, чтобы прожить достаточно долго. Начало формирования третичной структуры связано с образованием инициирующей шпильки из соседних по цепи сегментов. Это требует фиксации структуры двух структурных сегментов и большой затраты энергии и поэтому невыгодно с энергетической точки зрения. [c.214]

Точное вычисление результатов анализа и их выражение в подходящих единицах не менее важны, чем тщательный выбор и выполнение самого экспериментального метода. Контроль полноты возврата общего азота, исходя из известного содержания азота в разных компонентах (см. стр. 133), как описано в классической работе Чибнелла [115], все еще остается лучшей гарантией правильности выполнения анализа белка в целом [6]. Несмотря на это, результаты определения отдельных аминокислот, выраженные в единицах азота, весьма неудобны и могут вводить в заблуждение в случае основных аминокислот. [c.150]

Данные различных исследователей по одному и тому же белку легче всего сравнивать, когда они выражены в виде числа остатков каждой аминокислоты, приходящихся па тысячу (или другое удобное число) общих остатков [117]. При этом методе сравнения уменьшаются небольшие различия между отдельными данными за счет ошибок во взвешивании, колориметрии и определении азота. Существенно, однако, чтобы данные были полными и возможно более точными, так как иначе метод теряет свою ценность и может привести к ошибочным выводам. Обзор других методов, использованных для выражения результатов аминокислотных анализов, опубликован Истоу [38]. [c.150]

В связи с тем, что существуют группы белков с преимущественным содержанием а-спиралей и -структур, можно изучать их пространственную организацию, или вовсе не предсказывая конформационных состояний отдельных остатков, что не удается делать правильно, а беря вторичные структуры прямо из опыта, или оценивая брутто содержание последних с помощью известных статистических методов, что автоматически увеличивает точность предсказания на несколько десятков процентов, поскольку в этом случае приходится идентифицировать состояния не 20 аминокислотных остатков, а лишь трех-четырех структурных групп Левитта и Чотиа. При изменении постановки задачи и неизбежном снижении требований к ожидаемой информации появляется возможность решения других вопросов, правда, менее важных. Например, можно сфокусировать внимание на определении общего процентного содержания аминокислотных остатков в последовательности, находящихся в а- и -областях, и полученные результаты сравнивать с аналогичными данными спектральных методов. Можно поставить вопрос о том, каков порядок взаимодействий вторичных структур друг с другом и какие в принципе возможны способы укладки а-спиралей относительно -структур и последних друг относительно друга, и о частоте их встречаемости в белках. Можно, наконец, разрабатывать новые предсказательные алгоритмы, классифицирующие белки по группам (а), ( ), (а + ) и (a/ ). Подобные вопросы, до работы Левитта и Чотиа, представлялись частными случаями. Теперь же анализ укладки, например, полипептидной цепи апомиоглобина — это уже исследование белка, не случайно взятого из множества других, а планомер-316 [c.316]