Электрофорез в растворах мочевины

Не меньшей популярностью пользуется в настоящее время и метод электрофореза в полиакриламидном геле. Добавляя к раствору акриламида, налитому в стеклянные трубки, различные количества мономеров (например, метиленбисакриламид, этилендиакрилат), образующих в процессе полимеризации поперечные сшивки, можно получить гели с различной степенью связанности [137, 404]. Устойчивость к денатурирующим растворителям, например к 8 М раствору мочевины или 1 %-ному раствору додецилсульфата натрия, составляет еще одно важное преимущество этих гелей. При наложении разности потенциалов белки, пептиды, нуклеиновые кислоты и вирусы передвигаются в этих гелях на характерные расстояния, которые зависят главным образом от их молекулярного веса (или веса частицы), а также от степени связанности сшивок геля. Разделившиеся вещества образуют характерные полосы, которые можно выявить либо с помощью методов окрашивания или локального осаждения, либо (в случае разделения радиоактивных веществ) с помощью метода радиоавтографии (см. гл. XI, разд. Б). Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле такова, что с помощью этого метода можно обнаружить и идентифицировать приблизительно 37 видов рибосомных белков [508]. То, что разделение белка на многочисленные полосы происходит в силу действительного различия между белками, а не в результате каких-то артефактов, теперь уже не вызывает солшений. Однако известно, что разделяться на отдельные полосы могут не обязательно совершенно различные вещества, но и такие близкие между собой вещества, как, например, один и тот же белок, у которого часть молекул содержит одну лишнюю амидную (— СО — NH2 С00 ) группу, а другая часть — ацетильную (—NH+— NH — СОСН3) группу [136]. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле [c.61]

В этой работе.используют два прибора. В первом проводят электрофорез гемоглобина в геле, не содержащем мочевины. Соответственно в трубочки вносят раствор гемоглобина в 0,1 моль/л ЫаС. Во втором приборе [c.39]

Пептиды, образованные при частичном гидролизе, могут быть разделены с помощью целого ряда методов, среди которых наиболее широко применяются гель-фильтрация, ионообменная хроматография и электрофорез на бумаге (гл. 5). Обычно только-часть пептидов можно получить в чистом виде с помощью одного-из этих методов смеси пептидов, полученные при разделении одним из методов, должны быть подвергнуты дальнейшему разделению другим методом. Очистка больших гидрофобных пептидов часто вызывает затруднения, но в подобных случаях с успехом применялись такие методы, как гель-фильтрация в водных растворах кислот (например, в 50%-пой уксусной или муравьиной кислоте) или в растворах мочевины или гуанидингидрохлорида (от 2 дО 8 моль/л). Благоприятным обстоятельством является доступность различных молекулярных сит, широко применяемых на практике для очистки пептидов (табл. 5.6). [c.182]

Описанные в настоящей главе методы можно использовать для обнаружения, а в некоторых случаях и для количественного определения белков после их разделения с помощью электрофореза в средах, содержащих обычные буферные растворы. В присутствии высоких концентраций таких добавочных агентов, как ДСН или мочевина, следует уделять особое внимание правильной фиксации белков. Амфолиты-носители, применяемые при изоэлектрофокусировании, создают дополнительные трудности, так как образуют со многими белковыми красителями нерастворимые комплексы. Поэтому при наличии в растворах указанных добавок необходимо применять модифицированные методы окрашивания. Некоторые примеры окрашивания белков после электрофореза в присутствии ДСН или амфолитов-носителей приведены в главах, посвященных соответствующим методам разделения. [c.278]

Крахмал суспендируют в 270 мл буферного раствора, предназначенного для геля, в котором растворено 40,0 г мочевины. Все остальные процедуры проводят так же, как и при обычном горизонтальном электрофорезе в крахмальном геле (стр. 80). [c.83]

После окончания электрофореза полученные образцы окрашивают красителем, отмывают гель 7% Ным раствором уксусной кислоты от избытка красителя (см. работу 19) и сравнивают расположение полос белка в гелевых столбиках, полученных при добавлении в буфер мочевины и без добавления ее (рис. 10). [c.40]

Фракционирование рибосомных белков очень часто проводят также и методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН. Первое успешное применение этого метода описано Уорнером [1375]. Рибосомы, белки которых были помечены радиоактивными изотопами, растворяли в 0,1 М фосфатном буфере, содержавшем 0,5% ДСН и 0,5 М мочевину, и наносили на поверхность разделяющего геля. В состав этого геля входили 10%-ный акриламид и буфер, применявшийся для растворения рибосом. После электрофореза гели разрезали и по радиоактивности определяли положение белков. [c.311]

Все выше упомянутые фракции казеина можно получить и исследовать с помощью хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе с буферными растворами, содержащими мочевину [36—38]. Кроме того, было доказано, что наиболее ценным методом для разделения компонентов казеина является электрофорез на крахмальном геле с мочевиной [36, 39, 40] этот метод применим также для оценки гомогенности компонентов [35]. [c.42]

Для полного восстановления обычно необходимо использовать тиол и реагент, вызывающий разрыв водородных связей, а следовательно, и разделение пептидных цепей. Так, инсулин полностью восстанавливается только тногликолятом в присутствии 8 М раствора мочевины [202], а электрофорез на бумаге в 8 М растворе мочевины позволяет разделить две полипептидные цепи. В отсутствие мочевины цистин восстанавливается не более чем на з- Степень восстановления дисульфидных связей рибонуклеазы [282] также определяется концентрацией мочевины. Тиогликолят при pH 7 в отсутствие поверхностно-активного вещества [209] или гуанидина [171] восстанавливает только одну цистиновую связь из 17 связей, имеющихся в альбуминах человека и быка (мол. вес 65 000). В 0,2 М растворе натриевой соли децилсульфата при pH.7 в течение 1 час при комнатной температуре восстанавливаются все цистиновые связи. [c.172]

При электрофорезе в крахмальном геле гистоны разделяют в 0,01 н. НС1 [638] или в системе лактат —мочевина [1248]. В последнем случае гель содержит 0,02 М лактат алюминия (pH 3,4) и 4 М мочевину. Электродные буферные растворы готовят из продажного препарата лактата алюминия, взятого в концентрации 0,02 М и доведенного молочной кислотой до pH 3,1. [c.306]

Перед электрофорезом белки, экстрагированные одним из указанных способов, необходимо подвергнуть диализу против раствора, содержащего мочевину и буфер концентрирующего геля или какой-либо сходный с ним буфер. В случае разрушения рибосом рибонуклеазами А или Тг [1299] этот этап можно исключить. [c.311]

Диск-электрофорез в акриламидном геле, содержащем мочевину. Раствор А 8М раствор мочевины (24,0г перекристаллизован-ной мочевины растворяют в 50 мл деионизованной воды и муравьиной кислотой доводят pH до 3,2). Раствор Б 30%-ный цианогум. Раствор В 0,12 мл N, N, N, N -тетраметилэтилендиамина (ТЕМЭД) в 25 мл раствора А. Раствор Г насыщенный раствор персульфата калия. [c.92]

Электрофорез проводился в 4%-ном полиакриламидном геле в присутствии 8 моль/л раствора мочевины. Над дорожками, в которых проводилось разделение 32р меченного фрагмента после селективного расщепления по гетероциклам, указано, по каким нуклеотидам проводилось расщепление [c.281]

Почему при электрофорезе в полиакриламидном геле раствора гемоглобина в 8 моль/л растворе мочевины на фореграмме получаются две белковые полосы [c.43]

В опытах по регенерации инсулина первостепенное значение имеет предварительное выделение обеих цепей в форме, свободной от взаимного загрязнения. Глицильную цепь очищают методом зонального электрофореза в целлюлозном порошке. Последний сперва промывают 0,1 М лимонной кислотой в 8 7И растворе мочевины, а затем во влажном состоянии выкладывают в виде пластины [c.110]

В гл. 4 и 9 приведены ссылки на некоторые методики хроматографии, где с успехом применяют концентрированные растворы мочевины интересно отметить, что электрофорез в крахмальном геле также проводят в присутствии высоких концентраций мочевины. Пулик [24] недавно опубликовал убедительные результаты фракционирования продуктов, полученных при восстановительном расщеплении з-макроглобулина с применением геля, приготовленного следующим образом. Гидролизованный крахмал (60—65 г) смешивали с 250 г мочевины и смесь добавляли маленькими порциями к 300 мл буфера при энергичном перемешивании. Затем вязкий раствор нагревали при 70° в течение 10 мин, удаляли пузырьки воздуха и гель выливали в лоток для электрофореза. [c.257]

Электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН по методу Вебера и Осборна [1379]. Белки инкубируют в течение 2 ч при 37 °С в растворе, содержащем 0,01 М натрий-фосфатный буфер (pH 7,0), 1,% ДСН и 1% 2-меркаптоэтанола если белки проявляют склонность к образованию агрегатов, то к ним добавляют 8 М мочевину. После инкубации белки диализуют в течение нескольких часов при комнатной температуре против 0,01М нат-рий-фосфатного буфера (pH 7,0), содержащего 0,1% ДСН и 0,1% 2-меркаптоэтанола. Электродный буфер 0,1 М натрий-фосфатный буфер (pH 7,0), содержащий 0,1% ДСН. Состав геля 10 /о Т, 2,65% С 0,1 М натрий-фосфатный буфер (pH 7,0) 0,1% ДСН 92 мг /о персульфата аммония, 0,15 мл ТЕМЭД на 100 мл раствора. К каждой пробе добавляют 3 мкл 0,05%-ного раствора бромфенолового синего, 1 каплю глицерина и 5 мкл 2-меркаптоэтанола. [c.226]

Электрофорез двух фракций легких цепей свиного иммуноглобулина был проведен с помощью горизонтального метода по Франеку. На рисунке старт указан неясной линией около катода. Слой крахмального геля толщиной 2 мм содержит 0,035 М глициновый буферный раствор с pH 8,8 в 3. 4 мочевине (по данным Коэна и Портера [133). В электродных камерах находится раствор с pH 8.2, 0,3 М по борной кислоте и 0,06 М по ЫаОН. [c.339]

Предфокусированне для очистки геля от радикалов проводили в три этапа 15 мин при напряжении 200 В, затем по 30 мин при 300 и 400 В. После этого католит сливали. Препарат, содержавший 10—20 мкг белка лизата Е. соИ, после обработки ДНКазой вносили на гель в объеме 25 мкл раствора, содержащего 9,5 М мочевины, 2% NP-40 и 5% -меркаптоэтанола (буфер лизиса клеток). В этом растворе все белковые агрегаты диссоциируют, а сами белки денатурируют. На препарат наслаивали 10 мкл 9 М раствора мочевины, содержавшего 1% смеси амфолинов в той же пропорции (4 1). Вместо сахарозы высокую плотность здесь создает мочевина. Затем трубку осторожно дополняли доверху католнтом (0,02 М NaOH). ИЭФ при напряжении 400 В занимало 12 ч еще на 1 ч напряжение увеличивали до 800 В. По окончании ИЭФ гель выдавливали из трубки и для подготовки его к электрофорезу вымачивали 2 ч при комнатной температуре со встряхиванием в 5 мл 0,5 М Трис-НС1 (pH 6,8), содержащего 0,4% ДДС-Na. [c.46]

Ашаффенбург [97] при электрофорезе на бумаге коровьего молока [4°, буферный раствор (pH 7,15), содержащий 6 М мочевину] впервые наблюдал две полосы у-казеина, интенсивность которых заметно варьирует в зависимости от пробы молока. При электрофорезе некоторых проб молока полосы совершенно отсутствуют. Генетическая основа этих особенностей была доказана с помощью следующего наблюдения. При электрофорезе молока от восемнадцати пар однояйцевых близнецов обнаружено, что молоко каждой пары дает полосы у-казеина, идентичные по положению и интенсивности. Различия наблюдались в данных по электрофорезу молока разных пар в исследованном ряду. Сходные генетически обусловленные варианты Р-казеина наблюдались в пробах молока от однояйцевых близнецов различ- [c.45]

Для электрофореза гистонов в формирующемся градиенте pH первого направления авторы отдают предпочтение амфоли-нам диапазона pH 6—8. Хорошо заряженные гистоны мигрируют быстро, и все фракционирование заканчивается за 2 ч. На 20 мкл исходного препарата в трубке диаметром 2,4 мм из-за наличия в нем 0,2% ДДС-Na наслаивали 10 мкл 8 М раствора мочевины, содержащего 5% NP-40, 0,8% амфолинов pH 5—7 и 0,2% амфолинов pH 3,5—10. На пластине второго направления одновременно с гистонами было выявлено около 130 белков основного характера. [c.55]

Данно показал, что при проведении ИЭФ в геле, содержащем 8 М мочевину, ДДС-Na постепенно снимается с белка н под действием электрического поля быстро уходит к аноду [Danno, 1977]. Освободившийся белок может нормально фокусироваться в соответствии с характерным для него значением р1. Он проводил разделение окрашенных флюоресцамином белком в цилиндрическом геле первого направления по классической схеме электрофореза в присутствии ДДС-Na [Остерман, 1981], затем вырезал окрашенные белковые зоны и встряхивал их в течение 15 мнн при комнатной температуре в 8 М растворе мочевины с 2% амфолинов диапазона pH 3,5—10 (для зон толщиной менее [c.58]

В некоторых случаях бывает необходимо при электрофорезе сохранить ферментативную активность белка — либо для последующей его элюции и использования, либо для обнаружения с помощью биологического теста, т. е. по превращению субстрата ферментативной реакции (см. ниже). Использование в этом случае концентрированного раствора мочевины является нежелательным, и уменьшать опасность агрегации приходится за счет снижения загрузки геля. Чувствительность биологичесжих тестов зачастую позволяет это сделать. Необходимо точно проверить устойчивость фермента при выбранной величине pH рабочего буфера. При этом следует иметь в виду, что истинная величина pH в геле примерно на 0,5 ед. больше, чем у используемого щелочного буфера, и на 0,5 меньше, чем у кислого [Shuster, 1971]. [c.52]

Растворы белков (0,2—0,6 мг/мл) инкубируют при 37 °С в течение 2 ч в 0,01 М натрий-фосфатном буфере, pH 7,0, содержащем 1% ДСН и 1% р-меркаптоэтанола. Для полного развертывания полипептидных цепей и диссоциации белковых субъединиц иногда необходимо прокипятить раствор, добавить к нему мочевину до концентрации 8 М и (или) восстановить и карбоксиметилиро-вать тиоловые группы [70]. Во многих случаях раствор можно использовать непосредственно без всякой обработки, но, если проведению электрофореза мешают соли, образец диализуют в течение нескольких часов при комнатной температуре против 500 мл 0,01 М натрийфосфатного буфера, pH 7,0, содержащего 0,1% ДСН и [c.273]

Для приготовления геля берут 57 г акриламида (особо чистого для электрофореза), 3 г бис-акриламида, 460 г мочевины и растворяют примерно в 900 мл воды. Для более быстрого растворения можно подогреть раствор. После. растворения перечисленных компонентов добавьте примерно 20 г бифункциональной ионообменной смолы фирмы Biorad и для деионизации встряхивайте около 30 мин. Не увеличивайте слишком сильно время деионизации. Профильтруйте через нитроцеллюлоз-ный фильтр с диаметром пор 0,45 мк.м. Добавьте 50 мл 20XТБЭ и доведите объем до 1 л. [c.32]

Электрофорез по Боннеру и др. [14S. Разделяющий гель 15,1% Т и 0,66% С или 7,7% Т и 2,6% С 0,375 М ацетат калия (pH 4,3), 0,5% ТЕМЭД, 0,125% персульфата аммония, 6,25 М мочевина. Электродный буфер 0,35 М р-аланин — 0,14 М ук-сусная кислота. Образцы растворяют в 10 М мочевине и наслаивают на гель. [c.307]

Во второй группе методов двухмерного электрофореза разделение рибосомных белков проводят в буферной системе, аналогичной системе Рейсфелда и др. [1072]. Далее гели помещают в раствор, содержащий ДСН, меркаптоэтанол, фосфатный буфер и 5—6 М мочевину, и инкубируют не менее 30 мин при осторожном покачивании. Затем проводят электрофорез во втором направлении на пластине геля, содержащего ДСН. Концентрация акриламида в этом геле обычно выше, чем в геле первого направления. Описано несколько вариантов метода, основанного на таком принципе [506,, 596, 827, 943]. [c.313]

Все формы ЛДГ независимо от того, какая ткань является ее источником, представляют собой полимеры, состоящие из четырех полипептидных субъединиц. В водном растворе удается диссоциировать очищенный фермент на субъединицы, обрабатывая его мочевиной низкой концентрации или несколько раз замораживая и оттаивая. Субъединицы представлены двумя разными типами — А и В. Обе они имеют одинаковый размер и молекулярный вес около 35 000 дальтон, однако несколько отличаются по составу аминокислот и в электрическом поле мигрируют на разное расстояние. Как видно из рис. 4-14, при проведении электрофореза в крахмале субъединицы А почти не перемещаются, а субъедини- [c.63]

Смотреть страницы где упоминается термин Электрофорез в растворах мочевины: [c.499] [c.111] [c.104] [c.110] [c.136] [c.468] [c.102] [c.328] [c.54] [c.55] [c.135] [c.54] [c.411] [c.22] [c.111] [c.30] [c.103] [c.274] [c.313] [c.327] [c.78] [c.190]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология