Гибридомы их антитела

Рис. 163. Схема получения моноклональных антител с помощью габридом-ной техники АС — агент слияния клеток, 1 —В-клетки из селезенки иммунной мыши, 2 — культура миеломных клеток мыши, 3 — гибридизация, 4 — гибридомы, 5 — селекция и клонирование гибридом, 6 — гибридомы, образующие моноклональные антитела, 7 —- введение гибридом, образующих моноклональные антитела, в организм сингенной мыши, 8 — клетки гибридомы, образующие моноклональные антитела, культивируемые в виде культуры ткани, 9 — выращивание гибридомных клеток, образующих моноклональные антитела, в ферментаторе, 1дкж — иммуноглобулины в культуральной жидкости, 1дас — иммуноглобулины в асцитической жидкости, 10 — высаливание 1д-ов аммония сульфатом, 11 — стандартизация 1д-ов, 12 — лиофили-зация 1д-ов.

В иммуноферментном анализе используются поли- и моноклональные антитела как по отдельности, так и вместе. Относительная легкость получения поликлональных антител из антисывороток иммунизированных животных в ряде случаев дает возможность пренебречь их гетерогенностью. Однако разработка метода получения моноклональных антител — продуктов гибридных клеток — дала им огромные преимущества в иммунохимическом анализе в связи с уникальными свойствами, выгодно отличающими их от антисывороток. Использование моноклональных антител в иммуноферментном анализе дает возможность работать с практически неограниченным источником антител, однородных по молекулярным и иммунологическим свойствам. С их появлением открылись новые возможности для структурного изучения антигенов. Это связано с тем, что моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами, связываются со специфическим участком на поверхности белковой молекулы — антигенной детерминантой и могут быть использованы в качестве селективных зондов на определенные структурные участки. [c.306]

Рис. 9.2. Скрининг клеток, вырабатывающих моноклональные антитела. Вьщеляют клетки селезенки мыши, иммунизированной специфическим антигеном, и проводят их слияние с клетками миеломы, не вырабатывающими антитела. Слившиеся клетки отбирают по способности к росту на среде ГАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). Клетки, вырабатывающие специфические антитела к иммунизирующему антигену (клетки гибридомы), идентифицируют иммунологическими методами и субкультиви-руют, чтобы получить отдельные клоны. Из гибридомы, растущей в культуре и секрсти-рующей единственный тип молекул антител, получают моноклональные антитела.

Определение классов и подкласс ов антител важно для выбора способа их очистки. Классы и подклассы моноклональных иммуноглобулинов, секретируемых специфическими гибридомами, определяют прямым методом ИФА (рис. 41). [c.322]

Гибридомы, продуцирующие антитела, могут выращиваться в больших масштабах в культиваторах или специальных аппаратах. Поскольку образующиеся гибридомой антитела произошли от одной родоначальной клетки (В-лимфоцита), то они называются моноклональными антителами. Моноклональные антитела широко используются для создания диагностических препаратов, а также в некоторых случаях применяются с лечебной целью (в онкологии). [c.105]

Еще с прошлого столетия известно, что моча больных, страдающих этим заболеванием, часто содержит необычные белки, названные белками Бенс-Джонса по имени английского врача, который их впервые описал. Однако только в 1950-х годах выяснилось, что эти белки представляют собой свободные L-цепи иммуноглобулина. Первоначально детальная структура антитела была определена путем изучения миеломных белков из мочи или крови больных или же белков от мышей, у которых были целенаправленно индуцированы аналогичные формы рака. Впоследствии появилась возможность делать В-клетки, секретирующие антитела, бессмертными путем их слияния с клетками миеломы, не секретирующими антитела. Образующиеся гибридомы стали удобным источником моноклональных антител, которые можно получить против любого желаемого антигена в неограниченном количестве (разд. 4.5.4). [c.238]

Чтобы решить эту задачу, мышиные гены Н-и к-цепей были заменены ( нокаутированы ) небольшим участком кластера генов Н-цепи человека (который включал 4 Уд-домена, 16 Од-доменов, 6 Тд-доменов, Су и Сц) и кластера генов к-цепи человека (содержащего 4 Ук-домена, 5 jK-доменов и Ск). Трансгенные мыши с таким набором генов антител человека синтезировали человеческие антитела к некоторым антигенам кроме того, бьши созданы гибридомы, продуцирующие человеческие моноклональные антитела. Однако разнообразие человеческих антител, продуцируемых такими трансгенными мышами, было невелико вследствие ограниченности набора вариабельных сегментов Н- и к-цепей. Чтобы решить эту проблему, создали YA с большим числом генов вариабельных участков Н- и к-цепей гемоглобина человека. [c.429]

Один из результатов использования метода слияния клеток млекопитающих чрезвычайно быстро нашел применение в биотехнологии это линии клеток, полученных при гибридизации с участием клеток миеломы (так называемые гибридомы ), с помощью которых могут вырабатываться моноклональные антитела. Этот метод, разработанный в Кембридже Мильштейном и его сотр., основан на создании бессмертных клеток, производящих антитела, за счет слияния их с клетками миеломы. [c.313]

Рис. 12.14. А. Сосуд со стартовой культурой клеток млекопитающих, используемой для производства моноклональных антител. В сосуде культивируют клетки гибридомы, которые затем используют для размножения в ферментере, чтобы получить антитела. Б. Опытная установка для коммерческой ферментации в биотехнологической лаборатории.

Один из подходов получил название метода гибридных антител . Ферментативным гидролизом получают РаЬ-фрагменты молекул антител против определяемого антигена и используемого фермента. Затем смесь продуктов гидролиза подвергают восстановлению меркаптоэтанолом при этом РаЬ-фрагменты обратимо диссоциируют на симметричные части. После удаления восстанавливающего агента молекулы снова ассоциируют, образуя гибридные молекулы антител, специфичные к определяемому антигену и ферменту. При добавлении фермента образуется комплекс антитело—фермент (рис. 19, а). Гибридомная технология открывает принципиально новый путь получения гибридных антител, который заключается в том, что сливаются моноклональные клеткн, специфичные против данного антигена и фермента-маркера, в результате чего образуются гибридомы второго поколения, синтезирующие антитела, с двумя специфичностями (рис. 19. б). [c.112]

Получение гибридомы, синтезирующей моноклональные антитела к инсулину. Материалы. [c.167]

Хотя сам процесс получения гибридом достаточно трудоемок и дорог, тем не менее, после того как гибридома получена, крупномасштабное производство моноклональных антител стоит довольно дешево и все затраты на получение гибридом себя оправдывают. В качестве недостатка моноклональных антител часто указывают на нестабильность гибридом и возможную потерю ими продукции. Однако большинство гибридом достаточно стабильно, если их ре-клонировать 1—2 раза в год. [c.169]

Наиболее простым способом оценки специфичности моноклональных антител в процессе клонирования гибридом является метод непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с применением Т8Р-планшетов. ТЗР-планшеты представляют собой полисти-рольные стерильные крышки к 96-луночным культуральным платам, имеющие выступы, опускающиеся в лунки. Поверхность выступов ТЗР-планшетов может быть покрыта в стерильных условиях антигеном. Планшетом накрывают плату, в которой выращивают гибридомы таким образом, чтобы покрытые антигеном выступы опустились в среду культивирования гибридом. Выдерживают 1 ч и заменяют на новый планшет, выступы которого покрыты перекрестно реагирующим антигеном. Дальнейшую обработку ТЗР-крышек проводят в соответствии со стандартной методикой для непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Используя этот метод, можно в течение одного дня провести оценку способности моноклональных антител взаимодействовать с перекрестно реагирующими антигенами. Это дает возможность уже через 12—15 дней отобрать и клонировать только те гибридомы, которые обладают нужной исследователю специфичностью. [c.172]

Для выявления образуемых гибридомами антител, специфичных к антигенам клеточной поверхности, чаще всего исполь зуют радноиммунный метод (РИМ) (Goldstein et al., 1973). [c.44]

Накануне готовят 96-луночные микропланшеты с питающими клетками из расчета одна гибридома на один микропланшет. Микропланшеты ставят во влажный СОг-инкубатор с 5% СО2 при 37 °С. На следующий день готовят две суспензии гибридомных клеток в холодной среде из расчета 1 клетка в 100 мкл и 0,5 клетки в 100 мкл. Каждый 96-луночный планшет делят на две части и в каждые 48 лунок распределяют одну и другую клеточные суспензии одного клона гибридомы. Помещают микропланшеты в СОг-инкубатор. Через 10— 14 дней проверяют рост колоний в микропланшетах и отбирают те, в которых колонии выросли в менее 30%) лунок. Культуральные жидкости из этих лунок тестируют методом ИФА (с. 320) на присутствие специфических антител. Клетки из лунок, давших положительные реакции, последовательно наращивают в 96-, 24-луночных чашках и культуральных матрасах. Часть наросших клеток замораживают для сохранения и дальнейшего использования [c.313]

Моноклональные антитела. Гибридомы новый уровень биологического анализа/ /Под ред. Р. Г. Кеннета, Дж. Мак-Керна, К. Б. Бехтола. М., 1983. [c.327]

Моноклональные антитела грызунов, сходные с антителами человека, можно получить, выделив кДНК L- и Н-цепей из клеточной линии гибридомы грызунов и амплифицировав их вариабельные области с помощью ПЦР. В качестве праймеров для амплификации можно использовать олигонуклеотиды, комплементарные высококонсервативным сегментам ДНК, фланкирующим с 5 - и 3 -концов последовательность, кодирующую вариабельную область. Зная нуклеотидные последовательности кДНК вариабельных областей легкой и тяжелой цепей (V и Vjj), легко определить границы DR, основываясь на том, что соответствующие им последовательности гипервариабельны, в то время как каркасные области относительно консервативны. Исходя из данных о нуклеотидных последовательностях ДНК, кодирующих DR грызунов, синтезировали шесть пар олигонуклеотидных праймеров. Каждая пара инициировала синтез ДНК, кодирующей одну из шести DR грызунов три, локализованных на L-цепи, и три - на Н-цепи. Кроме того, на 5 -конце каждого праймера находилось 12 дополнительных нуклеоти- [c.217]

Высокая специфичность моноклональных антител позволяет создать иммуноферментные диагностику мы для определения антигенов, которые имеются в ограниченных количествах или же недоступны в очищенном состоянии. В таких случаях для иммунизации животных и получения гибридом может быть использован препарат, содержащий около 1 % антигена. Высокоочищенный антиген необходим на стадии тестирования гибридом однако при наличии высокочувствительного метода определения нужные количества антигена исчисляются несколькими микрограммами. После получения гибридомы антиген может быть выделен методом аффинной хроматографии на моноклональных антителах. Полученный в вы-сокоочищенном состоянии в значительных количествах антиген в дальнейшем может быть использован в составе иммуноферментных диагностикумов. [c.170]

Гибридомы, подобно большинству других клеточных культур животных, растут относительно медленно, не достигают высокой плотности и требуют сложных и дорогих сред. Получаемые таким образом моноклональные антитела очень дороги, что не позволяет широко использовать их в клинике. Чтобы решить эту проблему, были предприняты попытки создания своего рода биореакторов на основе генетически модифицированных бактерий, растений и животных. Для эффективной доставки и функционирования некоторых иммунотерапевтических средств зачастую достаточно одной антигенсвязывающей области антитела (Fab- или Fv-фрагмента), т. е. присутствие F -фрагмента антитела необязательно. [c.218]

Гибридома (Hybridoma) Гибридная клеточная линия, полученная при слиянии нормальных антителообразующих клеток (лимфоцитов) и миеломных клеток. Обладает способностью к неограниченному росту и синтезу моноклональных антител. [c.547]

Моноклональные антитела (Mono lonal antibodies) Однотипные антитела, строго специфичные в отношении одного эпитопа (антигенной детерминанты). Синтезируются гибридомами - клеточными гибридами, полученными при слиянии нормальных антителообразующих клеток с миеломной опухолевой клеткой, способной к неограниченному росту. Некоторые мие- [c.553]

Антитела составляют фракцию гамма-глобулинов сыворотки крови, называемую еще иммуноглобулинами. Известно 5 типов иммуноглобулинов. Получение чистых антител из иммуноглобулиновой фракции до недавнего времени было труднодоступно. Однако в 1975 г. Мнльштейн и Коллер сделали важное открытие, установив, что В-клетки, продуцирующие только один вид антител, могут сливаться с клетками миеломы. В то время как В-клетки не могут быть выращены в виде культуры, клетки миеломы в культуре растут и размножаются. Среди образующихся в результате слияния гибридных клеток, называемых гибридомами, обнаруживаются клетки, сохранившие способность образовывать те же самые антитела, что и В-клетки, использовавшиеся для получения гибридом. В то же время эти гибрид омы сохраняют бессмертный характер миеломных клеток. Таким образом, было осуществлено клонирование гибридомных клеток, полученных на основе В-клеток, способных синтезировать определенный вид антител, что дало возможность получать неограниченное количество таких антител. [c.315]

Первые успехи в изучении строения иммуноглобулинов были связаны с изучением иммуноглобулинов, полученных от больных миеломой (см. 1.4). Как уже говорилось, у таких больных в результате присутствия одного злокачественно разросшегося клона В-лимфоцитов вырабатывается огромное количество индивидуального иммуноглобулина, который сравнительно леп о отделить от всех остальных. Дальнейшие успехи в получении индивидуальных антител связаны с достижениями клеточной биологии, позволившими осуществлять слияние клеток миеломы как носителей способности к неограниченному размножению с нормальными В-лимфоцитами как носителями программы для выработки антител определенной, задаваемой экспериментатором специфичности. Получающиеся клетки, гибридоми сохраняют способность к неограниченному размножению и вырабатывают индивидуальные антитела. Так как в этом случае гибридомы происходят от одной исходной слитной клетки, то они представляют собой единый клон получающиеся из них антитела называют поэтому моноклональными антителами. [c.39]

Одним из перспективных методов получения целевых продуктов из животных клеток является их гибридизация. Примером может служить образование гибридом путем слияния нормальных и трансформированных злокачественных клеток. Г. Мильстейн и соавторы разработали метод получения моноклональных антител (мкАТ) в результате слияния клеток селезенки и миеломы. Образовавшиеся гибридомы от селезенки унаследовали способность к синтезу и секреции антител, а от миеломы — неограниченный рост и деление. [c.494]

Микроорганизмы, как и высшие организмы, способны собирать и перераспределять уже имеющуюся информацию между родственными, но генотипически неоднородными клетками Это происходит при трансформации, трансдукции и конъюгации у бактерий, при половой и соматической гибридизации у растений и животных Яркий пример здесь с гибридомами, продуцирующими моноклональные антитела (см ) [c.228]

Первой стадией при создании гибридных моноклональных антител является получение обычной гибридомы, синтезирующей моноклональные антитела желаемой специфичности к одному из двух антигенов. Затем гибридому адаптируют к росту в присутствии 8-азогуанина и отбирают те клетки, которые способны размножаться на НАТ-среде. Эти первичные гибридомы, выступающие в роли миеломного партнера, подвергают слиянию с иммунными лимфоцитами мышей, иммунизированных вторым антигеном. В результате слияния и отбора получают дочерние (вторичные) гибридомы, способные синтезировать антитела двойной специфичности. Таким способом были получены гибридные моноклональные антитела, которые одновременно связывались с кислой фосфатазой простаты человека и поверхностным антигеном гепатита В. Гибридные антитела оказались стабильными в процессе хранения, не изменяли своей двойственной специфичности и обладали достаточно высокими константами связывания по отношению к обоим антигенам. Гибридные антитела, взаимодействующие с пероксидазой и соматотропи-ном, были успешно использованы для изучения локализации сома-тотропина в клетке. [c.166]

На получении клеточных гибридов, которые могут производиться антителами in vitro, основан способ биотехнологии иммунных препаратов — антител, интерферона и др. В организм животного вводят соответствую-ш,ее белковое вещество или заражают его вирусом (для производства интерферона), затем берут из него клетки селезенки, получают клеточные гибриды (гибридомы) и соответствующие иммунопрепараты. В настоящее время многие фармацевтические фирмы производят иммунопрепараты подобным способом. [c.505]

После удачного слияния клеток необходимо провести быстрый и эффективный скрининг гибридом. В большинстве случаев дл-ч слияния требуются три этапа скрининга, и поскольку для каждого эксперимента используется свыше 500—1000 лунок, это означает, что для выявления наличия специфических антител нужно проанализировать до 3000 проб. Кроме того, кинетика роста гибридных клеток такова, что результаты скрининга должны быть известны в течение первых 48 ч после отбора проб. Единственный реальный способ обработать такое количество проб — использование метода, который позволяет провести скрининг, дающий визуальные результаты, на планшетах с лунками маленького объема. Скрининг не обязательно дает абсолютно однозначные результаты и допускается выявление некоторого количества ложных положительных клонов. Затем его можно повторить и получить более определенный ответ, работая только с относительно небольшим количеством проб, давших положительный ответ при первом скрининге. Один из наиболее удобных методов скрининга — твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA), при котором антиген наносится на дно лунок пластикового планшета он связывает антитела, продуцируемые гибридомой, а наличие этого комплекса обнаруживается с помощью антител к иммуноглобулинам, конъюгированных с определенным ферментом. Описание иммуноферментного анализа (ИФА) приведено в табл. 6.6. [c.185]

Карты триптических пептидов (растворимых при pH 6.5) из S-карбокси-метилированпого НА1 вируса Мет/71 дикого типа и одного из четырех вариантов, отобранных с продуцируемым гибридомой моноклональным антителом Н14/А2. [c.134]

Иногда для получения гибридов приходится прибегать к очень массированным схемам иммунизации. В качестве примера можно привести схему, предложенную Стели и сотр. (1980). Авторам не удавалось получить гибридомы против хорионного гонадотропина человека, применяя обычную схему иммунизации, несмотря на то что титр антител в сыворотках животных был высоким. Тогда авторы предположили, что для гибридизации важно, чтобы клетки находились в стадии активной бласттрансформации под действием антигена. Ими была выявлена высокая степень корреляции между числом больших бластных клеток в популяции клеток селезенки и образованием специфических антителообразующих гибридов. Максимальный выход гибридов получался при схеме иммунизации, представленной в табл.. 9. [c.101]

Гибридомы человека секретируют очень низкий уровень антител (50 НГ — 10 мкг/мл) в основном IgM класса. Это может быть связано с особенностями родительских миеломных линий человека, выбранных для слияния. Имеющиеся в настоящее время линии человека не являются истинными плазматическими клетками, как в случае миелом мыши, а принадлежат скорее всего к менее дифференцированным лимфобластоидным клеткам. [c.120]

Гкбридома — гибридная клеточная линия, полученная в результате слияния антителопродуцирующей клетки с миеломной, активно пролиферирующей клеткой, у которой отсутствует собственный синтез иммуноглобулинов гибридома образует высокоаффинные антитела узкой специфичности. [c.460]

Розеточные методы [4—8] фиксация антимышиных иммуноглобулинов на эритроцитах быка (с помощью хлорида хрома) и обработка в розетках выделяемыми клетками, предварительно покрытыми специфическими моноклональными антителами (продуцируемыми мышиной гибридомой) выделение связавшихся клеток достигается селективным лизисом эритроцитов. [c.247]

Далеко не все клетки, растущие на НАТ-среде, являются гибри-домами — продуцентами специфических антител. Это связано с тем, что часть лимфоцитов селезенки синтезирует иммуноглобулины неизвестной исследователю специфичности. Кроме того, на первых этапах роста после слияния гибридомы теряют некоторые хромосомы, а вместе с ними и способность к синтезу специфических антител. Поэтому важнейшим этапом получения гибридом является отбор клеток, стабильно синтезирующих антитела к антигену. Тестирование гибридом должно осуществляться на самых ранних стадиях После слияния и предполагает использование таких высокочувствительных методов, как иммуноферментный анализ. Содержание антител в культуральной жидкости на этих стадиях роста клеток составляет 10—100 нг/мл. [c.165]

Гибридомы, выращиваемые в сосудах для культивирования, синтезируют 5—10 мкг антител на 1 мл среды. При использовании специальных микроносителей типа Биосилон , выпускаемых фирмой Нунк, количество антител увеличивается до 100 мкг/мл. [c.166]

В настоящее время в основном получают гибридомы, синтезирующие моноклональные антитела мышиных или крысиных изотипов. Выбор животных определяется наличием соответствующих миеломных линий. Однако мышиные моноклональные антитела не всегда можно применять в медицинских целях. Для получения изотипов человека были сделаны попытки гибридизации крысиных миелом с [c.166]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология