Электрофорез в мини-геле

Добавьте эндонуклеазу и инкубируйте в течение 10 мин при 37°С. Проведя электрофорез в геле, определите то количество фермента, которое дает полное расщепление. [c.95]

Если нуклеиновую кислоту фракционируют в отсутствие БЭ, окрашивание можно провести после электрофореза, поместив гель иа 30 мин в раствор, содержащий 5 мкг/мл БЭ. Для снижения фонового свечения, вызванного присутствием несвязавшегося БЭ, следует промыть гель в течение 30 мин в буфере для электрофореза или в дистиллированной воде. Примечание длительная промывка может привести к исчезновению слабых зон. [c.286]

Анализ вирусной ДНК электрофорезом в агарозном мини-геле [c.240]

Обработка агаровых пластинок. После окончания электрофореза ток выключают, предметные стекла с агаровым гелем тотчас извлекают из камеры и помещают на 30 мин в 5%-ный раствор СНзСООН. Каждую пластинку покрывают листочком фильтровальной бумаги, смоченным в 5%-ном растворе СНзСООН, для удаления воды и солей и высушивают при комнатной температуре в течение ночи. Для ускорения высушивания его проводят при температуре 37 °С или под струей теплого воздуха. Бумагу, приставшую к агаровой пленке, осторожно снимают, предварительно смочив ее водой. Перед окрашиванием агаровое поле должно быть совершенно сухим и прозрачным. Окрашивание белков на электрофореграммах проводят амидовым черным 10 Б в течение ночи. Не связавшийся с белком краситель отмывают 5%-ным раствором уксусной кислоты. Отмытые электрофореграммы высушивают при 37 °С. [c.93]

Для электрофоретического исследования используют гиалоплазму сердечной и скелетной мышц крысы в разведении 1 200. На гель наносят 50—100 мкл образца, утяжеленного равным объемом 40%-ной сахарозы. Камеру для электрофореза помещают в холодильник и проводят электрофорез при начальной силе тока 2 мА на гель в течение 10 мин, а затем при 4 мА на гель в течение 1,5—2 ч (свидетель бромфеноловый синий не доходит до конца геля на 0,3 см). [c.338]

Полученный гель выливают в горизонтальную ванну, прикрытую стеклянной пластинкой. Эта ванна входит в комплект прибора для электрофореза. Гель должен полностью закрывать обеспечивающие электрический контакт фитили. Подготовку ванны с крахмальным гелем необходимо закончить в течение 3—5 мин. Примерно через час после этого в гель можно вносить исследуемый образец, как это описано в п. 4 разд. 1. [c.81]

На эту пластинку кладут полоску геля с фракциями исследуемого белка и проводят электрофорез. Пластинку укрепляют в приборе так, чтобы миграция белковых фракций происходила под прямым углом к продольной оси наложенной полоски агарозного геля (фиг. 33). Электрофорез продолжается 30—90 мин при градиенте напряжения [c.156]

Стеклянные трубки для геля имеют длину 10 см и внутрен-, ний диаметр 6 мм, перед использованием их отмывают, споласкивают и высушивают. Для обычной серии опытов из 12 гелей берут 15 мл буфера для геля, деаэрируют и смешивают с 13,5 мл раствора акриламида. Вновь деаэрируют, добавляют 1,5 мл свежеприготовленного раствора персульфата аммония (15 мг/мл) и 0,045 мл Ы,М,М, М -тетраметилэтилендиамина. После смешивания всех растворов каждую трубку заполняют двумя миллилитрами смеси. Перед застыванием геля сверху раствора, в котором протекает полимеризация, наслаивают несколько капель воды. Четкая граница раздела, возникающая в этом месте через 10—20 мин, свидетельствует о застывании геля. При нормальном количестве поперечных сшивок гель остается прозрачным, при удвоенном количестве метиленбисакриламида — становится мутным. Непосредственно перед началом опыта слой воды над гелем отсасывают и трубочки с гелем помещают в аппарат для электрофореза. [c.422]

Гораздо более эффективным методом обесцвечивания является электродиализ. Этот метод используется для быстрого выявления зон с высокой концентрацией белка. Для проведения электролиза достаточно простого нестабилизованного источника постоянного напряжения. Требуемый ток зависит от направления электродиализа в геле. С помощью электродных сосудов и источника питания, аналогичных применяемым при дискретном электрофорезе, удается осуществить более длительный и более сложный продольный электродиализ. Гели, имеющие форму круглых столбиков, помещают в трубки, диаметр которых лишь немного больше диаметров столбиков. В нижней части трубки сужаются, так что гель образует затвор. Электродные камеры и трубки с гелем заполняют 7%-ной уксусной кислотой. После включения тока за процессом обесцвечивания можно наблюдать визуально. Наиболее быстрым методом обесцвечивания является электродиализ в направлении, перпендикулярном длинной оси геля. Для проведения обесцвечивания разработаны специальные приборы, выпускаемые рядом фирм. В маленьком приборе конструкции Прусика [78] обесцвечивание можно провести за 30—45 мин. Этот прибор (рис. 12.10) можно легко изготовить в любой лаборатории. [c.309]

После электрофореза гель замачивается в 20-кратном объеме диметилсульфоксида на 30 мин операция повторяется со свежей порцией диметилсульфоксида [c.147]

Модификация методов последнего типа была использована для определения константы диссоциации глюканфосфорилазы [1271]. После электрофореза полиакриламидные гели инкубируют в 2 М На-ацетатном буфере (pH 5,9), содержащем 0,5 мг/мл АМФ и 2,5 мг/мл глюкозо-1-фосфата гликоген добавляют либо перед полимеризацией геля, либо к инкубационной среде. После инкубации при 37 С в течение 5—10 мин (в завиг симости от количества присутствующего фермента) гели погружают в раствор Щ—Ь в 7%-ной уксусной кислоте. Появление фиолетовых полос указывает местонахождение фермента. Через [c.292]

Окрашивание ПАА-гелей в течение ночи кумасси R250 (0,2% масс./об.) в смеси 45%-ньтй метанол — 10%-ная уксусная кислота, обесцвечивание раствором Ю7о-ный метанол — 7%-ная уксусная кислота [317]. После электрофореза агарозные гели смачивались дистиллированной водой, обертывались фильтровальной бумагой и выдерживались 30 мин при 37 °С. Окраска проявлялась через 15 мин после обработки кумасси R250 (0,1%, масс./об.) в смеси 45%-ный этанол— 10%-ная уксусная кислота. Обесцвечивание той же смесью растворителей. [c.304]

Если же белковые полосы после электрофореза в геле можно обнаружить обычной окраской, а введение радиоактивного иода используется только для последующего пептидного анализа, то поступают более экономно. Белковые полосы из геля вырезают Один такой диск вымачивают в 0,3 мл 0,5 М Na-фосфатного бу фера, содержащего 0,5 мКн Na I, и добавляют туда 5 мкл рас твора Хлорамина Т, чтобы получить его концентрацию 0,1 мг/мл Через 2 мин при 25 добавляют еще одну такую же порцию Хлор амина Т, а через 1 мин — еще одну. Затем реакцию останавлива ют добавлением 0,1 мл насыщенного водного раствора тирозина Остальной 1 присоединяется к нему и может быть удален дна лизом. Меченный таким образом белок можно гидролизовать, например трипсином, прямо в геле, а затем элюировать из него радиоактивно меченные пептиды белка, содержащегося в выбранной полосе геля [Bryant et al., 1979]. [c.238]

Вы смешиваете два фрагмента в присутствии ДНК-лигазы и инкубируете смесь. Через 30 мин после начала инкубации и второй раз через 8 ч вы отбираете пробы и анализируете их методом электрофореза в геле. Вас удивляет, что вместо ожидаемой рекомбинантной молекулы размером 1,3 т.п.н. электрофоре-грамма содержит сложный набор фрагментов (рис. 5-40, А). Вы замечаете, что при более длительной инкубахщи интенсивность полос, соответствующих более мелким фрагментам, уменьшается, а интенсивность полос, соответствующих более крупным фрагментам, увеличивается. Если вы добавляете к смеси сшиваемых молекул BamHI, то вновь образуются исходные фрагменты (рис. 5-40, ). [c.43]

Скорость течения жидкости (скорость элюции) можно регулировать наклоном пластины (обычно в диапазоне 5—20°). Для проявления результатов фракционирования удобнее всего воспользоваться методом снятия реплики. На влажный гель на 1 мин кладут листок толстой фильтровальной бумаги ( Whatman 3 ММ ) и прижимают его стеклянной пластиной. За это время жидкость из пространства между гранулами переходит на бумагу, а вместе с ней — и макромолекулы, находившиеся в подвижной фазе каждой хроматографической зоны. Фильтровальную бумагу затем подсушивают и пятна на ней выявляют одним из многочисленных методов окраски белков или НК, путем регистрации ферментативной активности, радиоактивности, иммунными методами и т. д. Все эти методы выявления были подробно рассмотрены при описании электрофореза и иммуноэлектрофореза [Остерман, 1981, 1983]. [c.163]

После завершения электрофореза прибор отключают от источника тока, сливают буферный раствор, трубочки вынимают из прибора и с помощью стальной иглы (под слоем воды) или водой, вводимой шприцом между поверхностью геля и стенкой трубочки, выталкивают столбик геля в 7%-ный раствор уксусной кислоты. Столбики геля помещают в пробирки и добавляют раствор красителя амидового черного 10 Б. Время окрашивания 5—10 мин. В качестве красителя можно использовать кумасси R-250. В этом случае прокрашивают 1—2 ч при комнатной температуре. После окрашивания избыток красителя отмывают 7%-ным раствором уксусной кислоты, цилиндрики геля сохраняют в том же растворе кислоты. [c.96]

Приготовление геля. Для полимеризации 30 мл разделяющего геля (12,5%) смешивают 12,5 мл раствора акриламида, 7,5 мл буфера разделяющего геля и 10 мл воды. После деаэрирования (5—10 мин на водоструйном насосе) к смеси добавляют 16 мг персульфата аммония и 18 мкл ТЕМЕД. Полученный раствор заливают либо в гелевую ячейку для вертикального электрофореза в пластине (с. 97), либо в трубки (с. 95). На поверхность раствора наслаивают воду. После полимеризации удаляют воду шприцом или фитилем из фильтровальной бумаги. Готовят смесь для концентрирующего геля. Смешивают 4 мл раствора № 1 с 5 мл буфера концентрирующего геля и добавляют [c.122]

К насыщенному раствору (NH4)2S04 добавляют 2 н. NaOH и доводят pH до 7,8. При постоянном перемешивании медленно, по каплям к 50 мл сыворотки кролика добавляют 80 мл насыщенного раствора сульфата аммония (pH 7,8) и перемешивают в течение 2—3 ч. Центрифугируют суспензию при комнатной температуре 30 мин при 1500 g. Первый осадок содержит все -у-глобулины, другие глобулины и следы альбумина. Растворяют осадок в дистиллированной воде до начального объема сыворотки (50 мл). Очищают фракцию у-глобули-нов вторым и третьим осаждениями. После третьего осаждения растворяют осадок в боратном буфере (pH 8,45) до конечного объема 20— 25 мл. Удаляют сульфат аммония диализом при 4°С против боратного буфера в течение 2—3 дней со сменой буфера утром и вечером. Полученный после диализа препарат иммуноглобулинов обычно содержит небольшой осадок денатурированного белка и слегка опалесцирует. Центрифугируют при 4° С в течение 30 мин при 1400 s. В полученном препарате проверяют содержание белка и титров антител. Определяют белковый состав методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН (с. 119). Если полученный препарат у-глобулинов не отвечает требованиям эксперимента по стоте, проводят дальнейшую очистку с применением ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. [c.308]

Сукцинат убихинон-редуктаза (СУР) катализирует окисление сукцината убихиноном. По данным электрофореза, в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия фермент состоит из 3 —4 полипептидов. Субъединицы с молекулярными массами 70 000 и 28 000 Да представляют собой собственно сукцинатдегидрогеназу, в субстратсвязывающем центре которой происходит дегидрирование сукцината низкомолекулярные компоненты комплекса И (м. м. ок. 15 000 Да) придают сукцинатдегидрогеназе реактивность по отношению к убихинону, чувствительность к специфическим ингибиторам и, по-видимому, принимают участие в связывании фермента с мембраной. Выделение препарата СУР основано на экстракции фермента из мембраны с помощью неионного детергента тритона Х-100 и концентрировании препарата охлажденным ацетоном. Дальнейшее фракционирование сульфатом аммония и очистка на кальдий-фосфатном геле позволяют получить фермент в высокоочищенном состоянии с каталитической активностью около 25 мкмоль окисленного сукцината в 1 мин на [c.423]

В которую переходят из крахмала растворимые примеси, отбрасывают. Отмывание крахмала отстаиванием повторяют дважды, затем осадок переносят в воронку Бюхнера и 3—4 раза промывают буферным раствором. После этого делают пастоподобную смесь крахмала с буферным раствором и примерно 100 мл этой пасты переносят в коническую колбу емкостью 0,5 л. Постоянно размешивая, крахмальную пасту нагревают до получения абсолютно гомогенной массы, причем следует избегать кипения геля. Чтобы удалить пузырьки воздуха, в колбе, содер-жаш ей нагретый гомогенный крахмальный гель, с помош ью вакуумного насоса создают разрежение, и гель на 1—2 мин вскипает. После этого им заполняют ванну прибора для электрофореза избыток буферного раствора удаляют с помош ью толстой фильтровальной бумаги, а для того чтобы предотвратить испарение, поверхность геля заливают тонким слоем расплавленного парафина. [c.79]

Локализация белковых фракций. Закончив электрофорез, ъанну с крахмальным гелем извлекают из прибора и располагают горизонтально на столе. Пленку парафина, закрывающую гель, удаляют, и всю поверхность крахмала покрывают листом фильтровальной бумаги. Лист плотно прижимают к поверхности геля в течение 5 мин, затем снимают его, высушивают в сушильном шкафу при 100 С и окрашивают белковыми красителями (см. стр. 54). Этим способом удается установить локализацию фракций, не прибегая к окрашиванию самого крахмального геля (метод отпечатков), [c.80]

Реакция встречного иммуноэлектрофореза (РВИЭФ). Эта реакция основана на встречной диффузии в электрическом поле антигенов и антител и появлении внутри прозрачного геля видимого преципитата. В агаровом или агарозном геле делают лунки диаметром 2 — 3 мм, причем расстояние между лунками для сыворотки и АГ должно составлять 5 — 6 мм. Лунки располагают попарно (одна — для АГ, вторая — для сыворотки) или по три (одна — для АГ, вторая — для испытуемой сыворотки, третья — для контрольной сыворотки). Лунки для сыворотки располагают ближе к аноду, а для АГ — к катоду. Реакцию проводят с несколькими разведениями АГ, продолжительность электрофореза — 90 мин. Результаты реакции учитывают сразу же после окончания электрофореза, отмечая количество и локализацию линий преципитации при сравнении их с контрольной тест-системой. [c.69]

Клеточный материал гомогенизуют в стеклянном капилляре диаметром 400 мкм. Чистая вода растворяет 39% суммарного белка из образца нервных клеток (гиппокамп крысы). При использовании раствора грас-буфера, имеющего pH 7,4, содержащего 0,1% Тритона Х-100, экстрагируется 72% суммарного белка. Как показали радиометрические измерения, в результате электрофореза 92% этого белка переходит в полиакриламидный гель. Если кроме Тритона Х-100 к экстрагирующему раствору добавлять 0,1% натрийдодецилсульфат, то в раствор переходит 92% суммарного белка. Более 90% этого материала при электрофорезе переходит в гель. Образец гомогенизуют, вводя в раствор с клетками прикрепленную к отрезку тефлоновой трубки петлю из стальной проволоки толщиной 28—70 мкм. Эту мешалку прикрепляют к зубоврачебной бор-машине, вращающейся со скоростью Л2 ООО об/мин [18]. Гомогенизацию ведут 1—3 минуты, наблюдая за ее ходом в микроскоп. Раствор центрифугируют 5—10 мин в гематокритной центрифуге при скорости вращения 11 000 об/мин. При такой обработке получается прозрачная надосадочная жидкость. [c.281]

Перед каждым циклом электрофореза в капилляр осторожно вносят микропипеткой 5%-ный верхний гель высотой 2 мм. Этот гель полимеризуют под действием света в течение 5—10 мин. Перед тем как внести образец, излишнюю воду, скопившуюся на поверхности геля, отсасывают. Затем на несколько минут вносят небольшое количество раствора Б (см. разд. 7.2.1), разбавленного в отношении 1 8, и тоже отсасывают. Микропипеткой вносят 0,5—1,5 мкл образца. Таким образом, капиллярная трубка малого объема и диаметром 200 мкм содержит 0,5 мкл образца, 0,07 мкл верхнего геля и 0,5 мкл разделяющего геля. Капиллярная трубка диаметром 400 мкм содержит 1,7 мкл образца, 0,3 мкм верхнего геля и 2,5 мкл разделяющего геля. [c.282]

После разделения гель удаляют проволочкой, плотно прилегающей к стенкам капилляра. Проволочку вставляют в анодный конец капилляра. Гель выдавливают в 80%-ный этанол и окра-щивают в течение 5 мин 0,5%-ным раствором амидо-черного в 7,5%-ной СНзСООН. На схеме 1 приведен ход метода выделения, предложенного авторами этой главы, а на рис. 3 показаны результаты электрофореза на полиакриламидном геле в капиллярах диаметром 200 и 400 мкм. В таких условиях за 25 мин было разделено и окращено амидо-черным 10 г белка мозга. [c.286]

О появлении множества ложных зон при электрофокусировании гемоглобина в геле с персульфатом калия сообщает Ригли [4]. В этом случае появления артефактов не удается избежать даже предварительным электрофорезом в течение 80 мин. Этот факт говорит о том, что при наличии в геле персульфата предварительный электролиз, возможно, является недостаточной мерой. Поэтому рекомендуется всякий раз, когда это возможно, получать гель фотополимеризацией. [c.328]

Смотреть страницы где упоминается термин Электрофорез в мини-геле: [c.254] [c.275] [c.367] [c.196] [c.196] [c.22] [c.240] [c.242] [c.176] [c.40] [c.140] [c.170] [c.54] [c.151] [c.169] [c.81] [c.411] [c.260] [c.261] [c.328] [c.338] [c.98] [c.98]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология