Белки оптическая плотность

Определение белка. Для определения белка используют метод Лоури (с. 81). При спектрофотометрическом измерении определяют оптическую плотность при 280 нм и рассчитывают концентрацию с помощью коэффициента Л им =9,0. [c.217]

Среди высокомолекулярных соединений важное место занимают белки. Они играют основную роль во всех жизненных процессах, а продукты их переработки — в технике и производстве. Белки являются полимерными электролитами, так как их молекулы содержат ионогенные группы. Поэтому растворы белков имеют целый ряд особенностей по сравнению с растворами других полимеров. В состав молекул белков входят разнообразные а-аминокислоты, в общем виде формула их строения может быть записана в форме КНг — К — СООН. В водном растворе макромолекула представляет амфотерный ион КНз — К — СОО . Если числа диссоциированных амино- и карбоксильных групп одинаковы, то молекула белка в целом электронейтральна. Такое состояние бедка называют изоэлектрическим состоянием, а соответствующее ему значение pH раствора — изоэлектрической точкой (ИЭТ). Чаще всего белки — более сильные кислоты, чем основания, и для них ИЭТ лежит при pH < 7. При различных pH изменяется форма макромолекул в растворе. В ИЭТ макромолекулы свернуты в клубок вследствие взаимного притяжения разноименных зарядов. Б кислой и щелочной средах в макромолекуле преобладают заряды только одного знака, и вследствие их взаимного отталкивания молекулы распрямляются и существуют в растворе в виде длинных гибких цепочек. Поэтому практически все свойства растворов белков проходят через экстремальные значения в изоэлектрическом состоянии осмотическое давление и вязкость минимальны в ИЭТ и сильно возрастают в кислой и щелочной средах вследствие возрастания асимметрии молекул, минимальна также способность вещества к набуханию, оптическая плотность раствора в ИЭТ максимальна. Изучение всех этих свойств используется для определения изоэлектрической точки белков. [c.443]

Возможно прямое определение белка путем измерения оптической плотности (поглощения) при 280 нм, основанное иа присутствии в белке остатков тирозина и триптофана. Зная удельный коэффициент экстинкции е (оптическая плотность 1%-иого раствора белка при 280 им и длине оптического пути 1 см), можно, исходя из измеренной экстинкции раствора белка неизвестной концентрации, установить содержание белка (в мг/1 мл). [c.356]

Метод основан на способности ароматических аминокислот (триптофана, тирозина и в меньшей степени фенилаланина) поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом при 280 нм. Измеряя величину оптической плотности при этой длине волны, находят количество белка в растворе. Поскольку белки отличаются по содержанию ароматических аминокислот, их поглощение в ультрафиолетовой области спектра может сильно различаться. Условно считают, что при концентрации усредненного белка в растворе, равной 1 мг/мл, величина оптической плотности при 280 нм-равна 1,0 (при толщине слоя жидкости в 1 см). [c.83]

Отобранные фракции анализируют спектрофотометрическим методом (см. гл. 35), определяя оптическую плотность при длинах волн 254 нм (максимум поглощения белка) и 295 нм (максимум поглощения метиленового синего). [c.237]

Существует два метода контроля раствора на разных расстояниях от оси вращения. В одном из них скорость седиментации оценивают по изменению со временем градиента показателя преломления. В другом методе, называемом абсорбционным, концентрацию определяют по оптической плотности растворов. Если изучаются растворы белков, то оптическую плотность определяют в ультрафиолетовой [c.155]

Промывание колонки фосфатным буфером проводят до тех пор, пока в отбираемых на коллекторе фракциях не останется даже следов белка (оптическая плотность растворов при определениях на фотоэлектроколориметре будет не выше 0,02). После этого начинают элюирование белков. [c.63]

Определению белка данным методом мешает присутствие нуклеиновых кислот и нуклеотидов. Измеряя оптическую плотность раствора при 260 нм (для учета поглощения соединений нуклеотидной природы) и 280 нм, содержание белка рассчитывают с помощью номограммы (рис. 6) экспериментально полученные величины оптической плотности при 260 и 280 нм находят в соответствующих столбцах номограммы и соединяют их прямой линией точка пересечения этой прямой со шкалой, на которой дана концентрация белка, определяет содержание белка в исследуемом растворе. [c.83]

Имеется возможность, например, по окончании хроматографического процесса получить на дисплее или на ленте самописца в изометрической проекции трехмерную картину элюции в координатах оптической плотности, времени и длины волны. Более подробные сведения об устройстве и перспективах использования таких детекторов для целей хроматографии можно найти в обзорной статье IFell et al.— J. liromatogr., 1983, 273, p. 3—17]. При исследовании белков II нуклеиновых кислот с их простыми, лишенными индивидуальных особенностей УФ-сиектрами поглощения особой нужды в этих сложных п дорогостоящих приборах, по-впдимому, нет. [c.101]

Подготовка и нанесение исследуемого материала. Сыворотку крови (получение см. на с. 90) для удаления солей диализируют против исходного буферного раствора в течение суток. В диализированном растворе определяют содержание белка и в количестве 70—100 мг наносят его на колонку. Колонку промывают исходным буферным раствором до тех пор, пока оптическая плотность элюата не станет равна 0,02. [c.113]

М ротенона, и содержимое хорошо размешивают. В кювету добавляют 0,2 мл суспензии митохондрий (2 мг белка) и после перемешивания измеряют оптическую плотность при 520 нм через 1, 2 и 3 мин после добавления митохондрий. [c.446]

Калибровочный график строят в пределах концентраций от О, до 2 мг стандартного образца белка, измеряя оптическую плотность раствора при 330 нм. [c.30]

Калибровочный график стро т в пределах концентраций от 0,025 до 0,250 мг стандартного образца белка, измеряя оптическую плотность растворов при 750 нм. [c.31]

Специфичность методов аффинной хроматографии наряду с избирательной сорбцией кетоаминной фракции НЬ Ale на ПААГ определяется спектрофотометрической детекцией гема, имеющего максимальную величину оптической плотности при длине волны 415 нм. Это обстоятельство позволяет избежать искажения результатов анализа за счет присутствия других гликолизированных белков эритроцитов или плазмы крови. [c.67]

По своим задачам хроматография разделяется на аналитическую и препаративную. Аналитическая хроматография преследует цель констатировать наличие нескольких компонентов в анализируемой смеси, идентифицировать эти компоненты (или убедиться, что какие-то из них не соответствуют никакому из ранее исследованных химических соединений) и количественно определить содержание каждого из них. При аналитической хроматографии можно для обнаружения веществ на выходе из колонки, в тонком слое или на бумаге превратить их в какие-либо другие, легче обнаруживаемые вещества. Например, при анализе аминокислотного состава белков на выходе из колонки к бесцветному раствору, вытекающему из колонки, добавляют специальное вещество — нингидрин, которое превращет аминокислоты в синий краситель. В результате этого зоны, содержащие разделенные аминокислоты, выходят в виде окрашенного раствора, измерение оптической плотности которого позволяет определить содержание красителя, а значит, и исходное содержание аминокислоты в каждой зоне. [c.343]

Химический гидролиз по остаткам тирозина можно осущ,ествить действием на белок N-бромсукцинимида. Например, 3 мг белка растворяют в 3,3 мл 50%-ной СНдСООН и добавляют при комнатной температуре порциями по 10 мкл раствор N-бромсукцинимида в такой же кислоте (22 мг/мл) до прекращения увеличения оптической плотности раствора при 260 нм ( ово)- Затем его можно разбавить водой и лиофизировать [Van Helden et al., 1979]. [c.297]

Содержание белка можно найти по формуле Калькара на основе данных определения оптической плотности при 280 и 260 нм [c.83]

В спектрофотометрическую кювету с длиной оптического пути 1 см вносят 0,1 мл суспензии иммобилизованного на сефарозе белка, добавляют 2 мл раствора кумасси, перемешивают при комнатной температуре 2—3 мин и быстро измеряют оптическую плотность смеси при 595 нм, используя в качестве контроля кювету, содержащую 0,1 мл суспензии неактивированной сефарозы и 2 мл красителя. Для построения калибровочного графика к 0,1 мл суспензии неактивированной се-<фарозЫ добавляют от 2 до 20 мкг исходного препарата белка и 2 мл раствора красителя, а затем измеряют оптическую плотность. С помощью данного метода можно определить содержание белка в препаратах иммобилизованных ферментов, содержащих более 10 мкг белка в [c.85]

Определение белка. Для определения концентрации фосфоглюкомутазы используют метод Лоури (см. с. 81). При спектрофотометрическом измерении регистрируют оптическую плотность при 278 нм, учитывая, что Л °А1см=7,0. [c.228]

Определение соотношения отдельных фракций белка. При pH 8,6 белки сыворотки крови заряжены отрицательно и перемещаются в электрическом поле к аноду. Быстрее всего к аноду движется фракция, альбуминов, затем идут ар, аг,-, р- и у-глобулины (рис. 9, Л). Участки бумажных лент, на которых проявились пятна белков, делят поперечными линиями простым карандашом на полоски шириной в 3—5 мм и разрезают по этим линиям. Каждую полоску измельчают и помещают в отдельную пронумерованную пробирку, заливают 3 мл 0,01 М раствора NaOH, оставляют на час для извлечения краски из бумаги, а затем находят для каждого раствора значение оптической плотности на ФЭКе при 612 нм. Параллельно обрабатывают контрольную пробу. Для нее вырезают полоску из неокрашенных участков электрофореграммы. [c.91]

Вытекающий из колонки буферный раствор собирают в пробирки порциями по 1—3 мл. Регистрацию объема элюата, прошедшего через колонку, начинают с момента нанесения образца на колонку. Содержание белка во фракциях определяют спектрофотометрически при 280 нм. Оптическую плотность растворов, содержащих рибонуклеазу, определяют при 230 нм, голубой декстран — при 650 нм, цитохром с — при 412 нм. После окончания анализа колонку промывают несколькими объемами буферного раствора. Строят профиль элюирования отдельных белковых фракций. Для этого вычерчивают график, на горизонтальной оси которого откладывают номера пробирок (фракций) или объем прошедшей через колонку жидкости, а на вертикальной оси — величины оптической плотности фракций. [c.108]

Подготовка и нанесение исследуемого материала. Получение сыворотки крови см. на с. 90. Для удаления солей ее диализируют против исходного буферного раствора. Для этого сыворотку разводят в два раза исходным буферным раствором, помещают в диализный мещо-чек и диализируют против того же буфера в течение не менее 12 ч (можно оставлять на ночь). В отдиализированном растворе определяют содержание белка и наносят на колонку 50—100 мг белка в объеме 1—3 мл. Колонку промывают исходным буферным раствором до тех пор, пока оптическая плотность не станет равной примерно 0,05. [c.112]

В кювету спектрофотометра вносят раствор белка и добавляют 5—10-кратный молярный избыток ДТНБ над сульфгидрильными группами. Полученную смесь перемешивают и через 5—10 мин измеряют оптическую плотность при 412 нм. Спустя 30 мин проводят повторное измерение оптической плотности, используя в качестве контроля раствор, содержащий равное количество ДТНБ, но не содержащий белка или низкомолекулярного тиола. Обычно реакция протекает очень быстро и максимальная оптическая плотность достигается через 5— [c.160]

Хроматография на фосфоцеллюлозе. Подготовленную для работы фосфоцеллюлозу (циклизацию проводят, как указано на с. 109) уравновешивают буфером А и добавляют к раствору белка (примерно 20 г сухой фосфоцеллюлозы на раствор белка, полученный из 200 г мышц). Смесь перемешивают 20 мин, затем переносят на воронку Бухнера и фильтруют под небольшим давлением. Фосфоцеллюлозу отмывают от несвязавшегося белка буфером А (примерно 5 л) до тех пор, пока оптическая плотность элюата при 280 нм будет равна 0,01. После этого фосфоцеллюлозу суспендируют в 1 л буфера Б и pH осторожно доводят до 7,2 NaOH. Этим же буфером вновь отмывают фосфоцеллюлозу от несвязавшихся белков (примерно 7 л). [c.236]

Хроматография на КМ-целлюлозе. Аффинная элюция. Измеряют pH раствора и доводят его соляной кислотой до 7,2. Раствор белка наносят на колонку с КМ-целлюлозой (13X5,5 см), уравновешенную буфером А, pH 7,2. После того как белок адсорбировался на колонке, ее промывают 75—100 мл буфера А (скорость тока 200 мл/ч). На этой стадии может потребоваться использование перистальтического насоса. Затем колонку промывают буфером Б, pH 8,0. При этом элюируются различные примесные белки, а лактатдегидрогеназа остается связанной с носителем. После того как через колонку пройдет 5—6 объемов буфера Б, оптическая плотность элюата при 280 нм начинает уменьшаться. Необходимо продолжать промывание буфером Б до тех пор, пока снижение Л280 не прекратится ( 280 может достигнуть значения 0,1—0,2 или меньше). Затем на колонку подают буфер В. После прохождения через колонку 1—2 объемов этого буфера определяют активность лактатдегидрогеназы в собираемых фракциях. В случае ее отсутствия на колонку подают буфер Г. Определяют активность лактатдегидрогеназы во фракциях элюата. Если ее нет либо она незначительна, на колонку подают буфер Д. Собирают фракции, определяют в них активность фермента и содержание белка (по поглощению при 280 нм за вычетом фона, который дает НАДН). Фракции, содержащие наибольшую активность, объединяют и добавляют к ним ЭДТА до конечной концентрации 1 мМ и мелкоизмельченный сульфат аммония для кристаллизации. [c.276]

Оптимум pH действия фермента — 7,6. Величины Кт для рибозо-5-фосфата и ксилулозо-5- фосфата равны соответственно 4-10 и 2,1-10 М. Оптическая плотность для раствора транскетолазы, содержащего в 1 мл 1 мг белка, при 280 нм равна 1,45. [c.279]

После получения меченных ФИТЦ препаратов СР определяют количество включенной метки. Для этого измеряют оптическую плотность образца, содержащего модифицированный белок, при 490 нм и рассчитывают концентрацию ФИТЦ, используя коэффициент молярной экстинкции метки, равный 64-10 М см . Для учета вклада светорассеивания в качестве контроля используют раствор везикул СР той же концентрации по белку, но не обработанных ФИТЦ. После этого рассчитывают включение метки в белок Са—АТФазы, зная, что молекулярный вес фермента равен 100 000, а содержание белка Са— АТФазы в препаратах легкой фракции СР составляет 807о- Для приведенных условий обработки включение метки составляет 1 моль/моль Са—АТФазы. [c.366]

I мл/мин. Элюцию белка контролируют по изменению оптической плотности при длине волны 280 нм. Элюат собирают до исчезновения оптической плотности. В отсутствие увикорда контроль выше перечисленных операций можно осуществить по объему буфера. При промывке объем буфера близок к пяти, а при элюции — к трем объемам колонки. Фракционирование элюата необходимо начать, пропустив объем элюирующего буфера, равный объему колонки. [c.380]

В кювету спектрофотометра помещают 2 мл среды измерения активности. Включают прибор и выводят перо самописца в крайнее положение. Убедивщись в том, что в отсутствие фермента не происходит изменения оптической плотности среды, добавляют 10 мкл разведенного препарата СУР и регистрируют восстановление СВ, сопряженное с сукцинат убихинон-редуктазной реакцией. Добавляют 0,02 мл 20 мМ ТТА, при этом активность СУР резко тормозится. Рассчитывают каталитическую активность фермента в микромолях окисленного сукцината в минуту на 1 мг белка и степень торможения реакции ТТА. [c.426]

Определение белка в препарате цитохромоксидазы. Содержание белка в полученном препарате измеряют с биуретовым реактивом (с. 483) в модификации Ионетани [3], которая состоит в том, что к раствору цитохромоксидазы перед добавлением биуретового реактива добавляют 0,05 мл 30%-ного раствора перекиси водорода. Такая обработка фермента позволяет уменьшить вклад поглощения фермента в оптическую плотность комплекса белка с биуретовым реактивом. [c.434]

Определение содержания гема а в препарате цитохромоксидазы. В кювету спектрофотометра помещают 2 мл 0,1 М. фосфатного буфера (pH 7,4), содержащего 1,5%-ный холат натрия, и 0,1 мл полученного препарата. Измеряют оптическую плотность раствора при 605 нм. Затем фермент восстанавливают, добавляя несколько кристаллов дитионита. Через 10 мин регистрируют значение оптической плотности раствора при 605 нм. Концентрацию гема а рассчитывают, исходя из разности коэффициентов молярной экстинкции окисленной и восстановленной форм гема, которая при 605 нм составляет 12-10 см . Высокоочищенные препараты цитохромоксидазы, выделенные предложенным методом, содержат около 11 нмоль гема а на 1 мг белка фермента. [c.434]

Колбочки помещают в термостат аппарата Варбурга при 28° С и выравнивают температуру в течение 15 мин. В каждую колбочку добавляют по 0,1 мл густой суспензии митохондрий (6—7 мг белка) и пробы инкубируют в течение 10 мин при перемешивании. По окончании инкубации их помещают в лед и после быстрого охлаждения их содержимое осторожно наслаивают на поверхность холодного 0,88 М раствора сахарозы. Предварительно охлажденную до 0°С сахарозу разливают по 5—7 мл в четыре центрифужных стаканчика от супернасадки центрифуги ЦЛР, стоящие во льду. Пробы центрифугируют при максимальной скорости вращения 10 мин. Верхний слой отсасывают пипеткой и отбрасывают, раствор сахарозы сливают и поверхность осадков осторожно споласкивают 0,3 М сахарозой, охлажденной до 0°С. В стаканчик добавляют по 1,5 мл 1 н. хлорной кислоты, осадки хорошо размешивают стеклянной палочкой и центрифугируют при 5000 в течение 15 мин. Супернатанты собирают в пробирки и экстракцию повторяют вновь в тех же условиях. Объединенные супернатанты нейтрализуют крепким раствором МН40Н. К нейтрализованным растворам добавляют по 2 мл метилового спирта, 2,5 мл 1 М аммиачного буфера, 0,2 мл раствора цианистого калия и 0,4 мл раствора эриохро-ма черного Т в метиловом спирте. Объем доводят до 10 мл аммиачным буфером. Определяют количество Mg + в пробах, измеряя оптическую плотность при 520 нм против раствора, не содержащего Mg +. Калибровочную кривую строят одновременно с обработкой опытных проб, используя в качестве стандарта титрованный раствор Mg l2. Область концентраций, в которой сохраняется линейная зависимость между количеством Mg + и оптической плотностью, — О—0,3 мкмоль Mg2+ на пробу. [c.457]

Заранее составляют калибровочную кривую, градуируя шкалу оптической плотности фотоэлектроколориметра в процентах белка, для чего проводят ие менее 50—60 параллельных анализов проб молока по колориметрическому методу (или методу К ьельдаля) и по адсорбции красителя. Калибровочную кривую составляет обычно лаборант для каждого прибора (в начале учебного года). [c.140]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология