Нуклеиновые как зонды

Метод моделирования и получения искусственных мембран основан на получении и исследовании моно- и бимолекулярных липидных слоев, везикул, липосом и протеолипосом. Сущ ествует два основных типа искусственных мембран классические плоские и сферические мембраны различного размера. Для получения искусственных мембран используют различные фосфатиды, нейтральные глицериды, смеси липидов биологического происхождения, добавляя к ним холестерин, а-токоферол и другие минорные добавки. Потенциальная ценность искусственных мембран для исследований зависит от возможности включения в них природных белков, в особенности тех, которые обладают транспортными свойствами. Липосомы, со-стоящ ие из белков и липидов, стали получать в 60-е гг. термин протеолипосомы был введен В. П. Скулачевым. В настоящее время разработан целый ряд методов приготовления различных типов липосом и протеолипосом, а также их стандартизации по размерам, структуре, гомогенности, стабильности и другим характеристикам. Липосомы используют для доставки в клетку лекарственных и химических соединений, стабилизации ферментов в инженерной энзимологии, введения в клеточные мембраны молекул зондов, модифицирующих и моделирующих их поверхность. Большой интерес для генной инженерии и медицины представляют работы по введению в клетки при помощи липосом нуклеиновых кислот и вирусов. В липосомы включают митохондриальные компоненты и изучают на таких модельных системах процессы генерации энергии в клетках. Ультра-тонкие искусственные мембранные структуры — полислои Лен-гмюра—Бложе (ПЛБ) — применяют для получения био- и иммуносенсоров. Создаются ПЛБ с иммобилизованными ферментами и компонентами иммунологических систем. При использовании смешанных липид-белковых пленок ПЛБ получают информацию о функционировании белков и о липид-белковых взаимодействиях в мембране. Результаты изучения физических характеристик, проводимости, проницаемости и других свойств искусственных липидных мембран имеют большое зна- [c.216]

Радиоактивно меченный зонд нуклеиновой кислоты, имеющий последовательность оснований, комплементарную разыскиваемой ДНК [c.225]

Рис. 4-72. Методы Нозерн - и Саузерн -блоттинга. После электрофоретического фракционирования смеси молекул ДНК или РНК в агарозном геле проводят перенос различных фрагментов нуклеиновых кислот на лист нитроцеллюлозы или найлона ( блоттинг ). Этот лист затем инкубируют с радиоактивным ДНК-зондом в течение длительного времени в условиях, способствующих гибридизации. Затем лист тщательно промывают, гак что радиоактивно меченными оказываются лищь те фрагменты, которые гибридизуются с ДНК-зондом. На радиоавтографе,

Молекулярно-биологическая диагностика — обнаружение в клиническом материале фрагментов нуклеиновых кислот вирусов-возбудителей с помощью зондов (гибридизация НК) или ПЦР. [c.259]

В диагностических тестах, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот, ключевыми являются три компонента ДНК-зонд, ДНК-мишень и метод детекции гибридизационного сигнала. Система детекции должна быть в высшей степени специфичной и высокочувствительной. [c.187]

Для выявления молекул нуклеиновых кислот, последовательность которых комплементарна всему зонду или его участку, ДНК-зонды часто используются в сочетании с гель-электрофорезом. Множество различных молекул РНК и ДНК, содержащихся в смеси, фракционируют электрофорезом согласно размеру и после этого проводят реакцию гибридизации если проба метит молекулы одного или нескольких размеров, можно быть уверенным, что гибридизация достаточно специфична. В некоторых случаях очень ценной является информация даже о размере гибридизуемых молекул ДНК. Это будет проиллюстрировано следующим примером. [c.239]

Наряду с исследованием белковых макромолекул, метод спинового зонда применяется и при исследовании других биополимеров — нуклеиновых кислот, однако в значительно меньшем масштабе (см., например, соответствующую обзорную главу в монографии [11] и одни из последних работ [197, 198]). Кроме того, методом спинового зонда исследуются и обычные синтетические полимеры, о чем пойдет речь в следующем разделе. [c.193]

Идентификация нужного гена из клонотеки. В этом случае задача исследователя сводится к поиску среди миллионов клонов тех, которые содержат фрагмент ДНК с интересующим его геном. В настоящее время для решения такой задачи применяются молекулярные зонды (пробы). Зонд представляет собой меченую молекулу нуклеиновой кислоты, гомологичную последовательности гена. [c.46]

ДНК-зонды применяют для поиска родственных генов в реакциях гибридизацрш с РНК — для выявления экспрессии данного гена в различных клетках. Для вьывления молекул нуклеиновых кислот, комплементарных всему зонду (или его участку), ДНК-зонды часто сочетают с методом гель-электрофореза, что позволяет получать информацию о размерах гибридизируемых молекул ДНК. Эффективное использование современных приборов, способных автоматически синтезировать любые нуклеотидные последовательности за короткий промежуток времени, дало возможность перестраивать гены, что представляет собой один из важных аспектов генной инженерии. Обмен генами, а также введение в клетку гена другого вида организма осуществляют посредством генетической рекомбинации in vitro. Этот подход был разработан на бактериях, в частности на Е. соИ. Он основан на важном свойстве ДНК — способности к перестройкам, изменяющим комбинацию генов в геноме и их экспрессию. Такая уникальная способность ДНК позволяет приспосабливаться данному виду к изменяющейся среде. Генетическую рекомбинацию подразделяют на два больших класса общую рекомбинацию и сайт-специфическую рекомбинацию. В процессе общей рекомбинации генетический обмен в ДНК происходит между гомологичными нуклеотидными последовательностями, например между двумя копиями одной и той же хромосомы в процессе мейоза (кроссинговера), или при скрещивании и перегруппировке генов у бактерий. [c.112]

Первая глава данного тома касается использования плаз-мидных векторов, имеющих в своем составе высокоспецифичные промоторы РНК-полимераз некоторых бактериофагов. Такие векторные молекулы позволяют получать радиоактивно меченные зонды, которые благодаря своим уникальным свойствам все шире применяются сейчас в исследованиях структуры и функций нуклеиновых кислот. Подобные системы на основе космидных векторов рассматриваются во второй главе. Эти векторы разработаны для того, чтобы сделать менее трудоемкими прогулки по хромосомам высших организмов. Фаговые промоторы здесь расположены таким образом, что синтезируемый радиоактивно меченный зонд соответствует концевой области клонированной ДНК, а это облегчает поиск клонов, содержащих перекрывающиеся сегменты ДНК. [c.8]

В этом разделе рассматриваются основные методы использования РНК-зондов при исследовании нуклеиновых кислот в обычной лабораторной практике. В раздел включены детальные описания методов, в которых РНК используются вместо ДНК-зондов при Саузерн- и нозерн- гибридизации и в опытах по защите от действия РНКазы. [c.27]

В этой главе рассматриваются методы синтеза и использования в экспериментальных целях РНК, полученной in vitro с помощью РНК-полимераз фагов SP6, Т7 и ТЗ. Основное внимание мы уделили использованию радиоактивных РНК-зондов для рутинного анализа нуклеиновых кислот и не пытались изложить, кроме как в самых общих чертах, более специальные аспекты их применения, например для гибридизации in situ, в качестве смысловой мРНК или трансляционных матриц. По таким вопросам мы постарались дать ссылки на ключевые работы, которые позволят хорошо разобраться в технических возможностях этих методов. [c.12]

А. Представим себе, что космический зонд сконструирован таким образом, что может обнаруживать только такие вещества, как глюкоза, аденозинтрифосфат, белки, нуклеиновые кислоты или сходные с ними соединения. Допустим, что такие соединения обнаружить не удалось. Можем ли. мы в этом случае утверждать, во-первых, что на данной планете нет живых систем и, во-вторых, что на ней отсутствуют условия, которые могли бы привести к появлению живых систем в будущем [c.316]

Не изменены ли свойства индивидуальных звеньев Вообще говоря, нам хорошо известны ионные равновесия, химические и физические свойства всех обычных боковых цепей, входящих в белки и нуклеиновые кислоты. Однако эти свойства часто изменяются, когда остатки оказываются включенными в упорядоченную вторичную структуру или структуры высших порядков. Это изменение может явиться источником информации о локальной структуре вблизи данного остатка. Изменение свойств можно исследовать при помощи некоторых физических методов с гораздо более высоким разрешением, чем это удается при исследовании структуры как целого методом рентгеновской кристаллографии. Например, определенные спектроскопические методы обладают высокой чувствительностью к характеру химической связи или к распределению электронов вокруг данного атома. Если этот атом чем-то выделен, он может служить зондом, поскольку его можно изучать на фоне всей макромолекулы. [c.29]

Когда генетические вариации отсутствуют или не удовлетворяют требованиям опыта, иногда применяется избирательная химическая модификация. Некоторые аминокислотные остатки могут быть избирательно модифицированы в присутствии остальных. Даже если в белке имеется много экземпляров остатков каждого типа, часто лишь ограниченное их число обладает высокой реакционной способностью. Если в результате модификации структура или функция белка изменяются, можно попытаться объяснить, каким образом эта модификация привела к такому результату. В случае нуклеиновых кислот осуществление специфической химической модификации затруднительно, поскольку здесь гораздо меньше видов звеньев, а химические свойства всех звеньев, к сожалению, очень близки. И все же существуют приемы, способные упростить задачу. Предположим, что в результате модификации получается гетерогенная смесь молекул, прореагировавших в нескольких различных местах. Вероятно, некоторые из этих молекул будут инактивированы, а другие сохранят нормальную функцию. Тогда можно будет с помощью физических методов, основанных на способности молекул к функционированию (например, с помощью аффинной хроматографии), разделить полученную смесь. На практике получение химически модифицированных макромолекул является нередко трудоемкой процедурой, проводимой методом проб и ошибок. Тем не менее использование таких макромолекул необходимо для ряда других методов, таких, как метод зондов или меток, а также для изоморфного замещения тяжелыми атомами при изучении больших молекул методом рентгеновской кристаллографии. [c.40]

Данный метод включает иммобилизацию вирусной нуклеиновой кислоты на нитроцеллюлозе и гибридизацию ее с комплементарной нуклеиновой кислотой в качестве зонда. Экстрагировать нуклеиновую кислоту из вирусных частиц перед нанесением на нитроцеллюлозу нет необходимости. Фракции сахарозных или цезиевых градиентов можно наносить непосредственно,, не удаляя среды, используемой для центрифугирования. [c.29]

После отмывки фильтров от несвязавшегося радиоактивного зонда их высушивают и анализируют с помощью авторадиографии с использованием чувствительной к радиоактивному излучению рентгеновской пленки. Образование специфических гибридов обнаруживают после проявления рентгеновской пленки по появлению на ней четких гибридизационных сигналов в виде темных пятен, положение которых точно соответствует таковому определенных колоний или бляшек на исходной чашке Петри. В результате проведения исследования идентифицируются бактериальные колонии или фаговые бляшки, содержащие искомые рекомбинантные ДНК. С этого момента с помощью обычных микробиологических и биохимических методов можно получать неограниченное количество идентичных копий клонированной последовательности нуклеотидов ДНК для дальнейших исследований. В ряде случаев, когда нет необходимости в скрининге большого числа клонов, гибридизацию с зондами можно заменить ПЦР. При таком подходе в качестве источника матричной ДНК используют суспензию бактериальных клеток или фаговых частиц отдельных клонов без специальной очистки матричных нуклеиновых кислот. [c.163]

Метод гибридизации нуклеиновых кислот можно использовать на препарате хромосом после их соответствующей обработки. Так, исследуемый ген можно локализовать в специфическом хромосомном сегменте, одном из тех сегментов, которые наблюдаются при дифференциальном окрашивании. Поскольку эксперимент проводится с зондом к-ДНК, синтезированном на м-РНК, можно утверждать, что идентифицированный участок хромосомы содержит активный ген. Известно, что в геноме помимо активных генов, могут находиться псевдогены, такие последовательности ДНК, которые гомологичны активному гену, ио не транскрибируются из-за отсутствия каких-то важных последовательностей вне транскрибируемой части. [c.69]

Скорость формирования двойной спирали лимитируется вероятностью столкновения двух комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот, что в свою очередь определяется их концентрацией в растворе. Скорость гибридизации может быть использована для определения концентрации любых последовательностей РШС или ДНК в смеси, содержащей и другие последовательности нуклеиновых кислот. Для этого теста необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДШС, комплементарный к той последовательности, которую нужно обнаружить. Этот фрагмент ДНК можно получить клонированием, а если последовательность короткая, ее можно синтезировать химическими методами. В любом случае фрагмент ДНК интенсивно метят Р (см. рис. 4-65) с тем, чтобы можно было следить за включением этой молекулы в состав дуплексов в процессе реакции гибридизации. Одноцепочечная молекула ДНК, используемая здесь в качестве индикатора, называется ДНК-зонд она может содержать от 15 до 1000 нуклеотидов. [c.238]

Экспресс-диагностика. В качестве экспресс-диагностики используются молекулярно-биологические методы выявление в клинических образцах нуклеиновых кислот возбудителя с помощью ПЦР и метод гибридизации на основе ДНК-зондов. Разработана мультиплексная ПЦР, позволяющая одновременно определять в клинических образцах нуклеотидные последовательности М. genitalium, и. urealyti um и М. hominis. Однако в связи с высокой частотой носительства полученные результаты требуют подтверждения методами серодиагностики. [c.252]

Где располагаются блоки сателлитной ДНК Развитие техники гибридизации нуклеиновых кислот позволило определить расположение последовательностей сателлитной ДНК непосредственно в хромосоме. При гибридизации in situ или цитологической гибридизации хромосомную ДНК денатурируют, обрабатывая клетки, распластанные на покровном стекле. Затем к препарату добавляют радиоактивный ДНК- или РНК-зонд. Зонд гибридизуется с комплементарными ему участками денатурированного генома. Расположение участков гибридизации можно определить с помощью радиоавтографии. [c.301]

На следующем этапе работы эту пленку помещают в раствор, содержащий так называемый зонд, т.е. одноцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты, комплементарные отыскиваемым в библиотеке и содержащие радиоактивную метку. Таким радиоактивным зондом может служить информационная РНК, выделенная из ткани, в которой наиболее активно функционирует интересующий нас ген это может быть также искусственный дезоксиолигонуклеотид, синтезированный так, чтобы отвечать известной последовательности аминокислот в том белке, который кодируется разыскиваемым нами геном наконец, это может быть рестрикт из другого участка клонируемой ДНК. Радиоактивный зонд гибридизирует с комплементарной ДНК на поверхности пленки. Затем с пленки смывают не вступившие в гибридизацию остатки зонда и производят радиавтографию, позволяющую установить, где именно на поверхности пленки, а значит и на поверхности чашки Петри, располагаются негативные колонии, содержащие ДНК, способную гибридизировать с зондом (рис. 9.15). Затем из соответствующих негативных колоний можно выделить фаг, содержащий интересующий нас фрагмент чужеродной ДНК. [c.282]

Для мечения очищенных молекул ДНК радиоизотопами широко используются два метода. В первом случае в молекулу ДНК с помощью ДНК-полимеразы I Е oli вводят радиоактивно меченные нуклеотиды (рис. 4-65. А). Нри этом получают радиоактивные ДНК-зонды . используемые в реакциях гибридизации нуклеиновых кислот (см. ниже). Во втором методе фермент полинуклеотидкиназа из бактериофага [c.233]

Для анализа РНК. кодирующих альбумин, с помощью ДНК-зонда используется метод Нозерн-блоттинга. На первом этапе с помощью гель-электрофореза, фракционируют интактные молекулы РНК дефектных и контрольных клеток печени и пол чают набор полос. Для гого чтобы молекулы РНК, содержащиеся в геле, сделать более доступными ДНК-зонду, осуществляют перенос (блоттинг) фракционированных молекул РНК из геля на лист нитроцеллюлозы. На следующем этапе лист нитроцеллюлозы инкубируют с раствором, содержащим меченый ДНК-зонд. Полосы РНК, гибридизующиеся с зондом, выявляют методом радиоавтографии (рис. 4-72). Известно, что скорость движения молекул нуклеиновых кислот в геле зависит от их размера при электрофорезе малые молекулы перемещаются быстрее, чем большие. Сравнивая [c.239]

Результаты молекулярной гибридизации in situ могут быть достоверными только при условии высокой чистоты зондов поскольку метод основан на использовании избытка зонда, даже малейшие примеси могут принимать участие в гибридизации. Используя стандартные физические методы, можно получить зонды высокой чистоты для нуклеиновых кислот, имеющихся в избытке, таких как рибосомальная РНК. Однако относительно низкая концентрация большинства видов мРНК создает значительные трудности при использовании этих методов для получения зондов в чистом виде и в достаточном количестве. Проблема примесных последовательностей нуклеиновых кислот решается благодаря применению методов клонирования рекомбинантных ДНК в принципе эти методы могут быть использованы для получения зондов на любые интересующие вас гены или участки генома. [c.305]

Изучение генотипа микроорганизмов стало возможным в результате успешного развития молекулярной биологии и привело к возникновению геносистематики. Исследование генотипа, основанное на анализе нуклеиновых кислот, в принципе дает возможность построить со временем естественную (филогенетическую) систему микроорганизмов. Филогенетические взаимоотношения бактерий оценивают определением содержания ГЦ в ДНК, ДНК—ДНК и ДНК—рРНК гибридизацией, с помощью ДНК-зондов, а также изучением последовательности нуклеотидов в 55, 165 и 235 рРНК см. гл. 8). [c.196]

Эффективность гибридизации in situ зависит от следующих параметров (I) частоты встречаемости нуклеотидных последовательностей-мишеней (т. е. числа специфических последовательностей нуклеиновой кислоты, присутствующих в цитологическом препарате) (II) чистоты зонда (III) удельной радиоактивности меченого зонда (IV) чувствительности метода гибридизации (V) усиления сигнала (VI) эффективности метода радиоавтографического выявления пробы. [c.305]

В заключение этой главы кратко рассмотрим уже упомянутый метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот, осуществляемой на кольцевых ковалентно замкнутых молекулах ДНК по типу катящегося кольца (rolling ir le amplifi ation -R A) [331]. В методе линейной R A используется один праймер, комплементарный кольцевой одноцепочечной ДНК, которая может быть получена денатурацией исходных двухцепочечных молекул. Синтезировав комплементарную цепь, ДНК полимераза начинает вытеснять 5 -конец синтезированной цепи из гибрида, причем процесс продолжается непрерывно на протяжении всей реакции, во время которой фермент совершает множество оборотов вокруг амплифицируемой кольцевой матрицы. Продуктом R A является длинная одноцепочечная ДНК, в которой мономеры, комплементарные исходной кольцевой молекуле, следуют друг за другом в виде конкатемера. Поскольку в этом случае гигантская молекула ассоциирована с единственным праймером, метод R A с успехом используется для амплификации сигнала на микроматрицах [331]. При этом на двумерных и трехмерных микроматрицах имеет место возрастание сигнала в 10 ООО раз по сравнению с сигналом, получаемым от отдельного зонда, меченного флуоресцентным красителем. Ковалентное связывание 5 -концов праймеров для R A с антителами позволяет обнаруживать белки в концентрации до 0,1 пг/мл анализируемой жидкости [332, 333]. [c.250]

Библиотека генов представляет собой большое количество клонов гибридных фагов А или космид (см. 2.2.2, 2.2.3). Негативные колонии гибридных фагов или колонии клеток Е. соЫ, содержащих гибридные космиды, перепечатывают на нитроцеллюлозные фильтры и осуществляют гибридизацию нуклеиновых кислот in situ с каждым из полученных меченых препаратов ДНК. Те клоны, в которых обнаруживается гибридизация с ДНК-зондом мутантных клеток и отсутствует гибридизация с ДНК-зондом клеток дикого типа, содержат амплифициро-ванную последовательность. [c.346]

Для мечения очищенных молекул ДНК радиоизотопами широко используются два метода. В пфвом случае в молекулу ДНК с помощью ДНК-полимеразы I Е соИ вводят радиоактивно меченные нуклеотиды (рис. 4-65, А). При этом получают радиоактивные ДНК-зонды , используемые в реакциях гибридизации нуклеиновых кислот (см. ниже). Во втором методе ффмент полинуклеотид киназа из бактериофага используется для пфеноса отдельных фосфатов, меченных Р, с АТР на 5 -конец каждой из цепей ДНК (рис. 4-65, Б). Поскольку каждая из цепей ДНК метится с помощью киназы только одним атомом Р, молекулы ДНК обычно недостаточно радиоактивны, чтобы использоваться в качестве зондов ДНК однако то, что помеченными цепи ДНК оказываются только по одному концу, делает их очень удобными для секвенирования и футпринтирования , что будет обсуждаться ниже. [c.233]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология