Хроматография применение для идентификации аминокислот

Хроматография производных аминокислот получила интенсивное развитие в связи с разработкой методов определения первичной структуры белков. Вероятно, трудно найти в органической химии и биохимии более удачный пример столь тесной взаимосвязи развития представлений о структуре и функциях большого класса веществ, каким являются белки, с хроматографическими методами анализа. Основное внимание было направлено на разработку методов определения N-концевых остатков аминокислот в белках, причем в идентификации соответствующих производных большое значение имели тонкослойная (ТСХ) и бумажная хроматография (БХ) (см. обзоры [1, 2]). Газожидкостная и жидкостная колоночная хроматографии находят в этой области ограниченное применение, однако интерес к последнему методу постепенно растет. Интерес к жидкостной хроматографий вызван вполне определенными причинами. Во-первых, постоянно появляются новые методы избирательной модификации остатков аминокислот в белках, а идентификация производных аминокислот требует развития хроматографических методов. Во-вторых, исследованию подвергают все более труднодоступные белки, что в свою очередь вызывает необходимость создания надежных методов количественного анализа. Интерес к колоночной хроматографии возрастает также в связи с выделением и получением необычных аминокислот, а также в связи с необходимостью предотвращения ошибок при определении аминокислотной последовательности. Понятия современный и классический метод используют здесь условно, поскольку новые методики обычно создают на базе стандартной аппаратуры примером может служить автоматический анализ ДНФ- и ДНС-аминокис-лот [3, 4]. Насколько известно, до сих пор не пытались использовать скоростную хроматографию высокого разрешения для разделения производных аминокислот, хотя некоторые соединения, например ДНС-аминокислоты, являются для этого метода довольно удобным объектом. Производные аминокислот использовали в структурном анализе белков крайне неравномерно. По-видимому, всеобщее увлечение ДНФ-аминокислотами проходит окончательно, уступая место повышенному интересу [c.360]

Применение распределительной хроматографии для изучения химии и обмена аминокислот и белков имеет наибольшее значение, так как с ее помощью удается разрешить труднейшие задачи разделения, идентификации и выделения индивидуальных аминокислот и пептидов из их смесей. В литературе описано много работ по хроматографическому разделению и определению аминокислот. [c.144]

Распределительная хроматография. Принцип распределительной хроматографии впервые описан Мартином и Синджем в их работе по аминокислотам. В этом случае, вместо равновесия между твердой и жидкой фазами, устанавливающегося при работе по методу Цветта, равновесие устанавливается между двумя жидкими фазами, причем одна из жидкостей поддерживается в состоянии геля или находится на подходящем субстрате. Сначала был применен силикагель, способный адсорбировать до 70% воды и сохраняющий при этом вид сухого порошка. При пропускании раствора исследуемой смеси в несмешивающемся с водой растворителе (например, в хлороформе) через колонку из силикагеля происходит разделение компонент смеси, обусловленное различиями их коэффициентов распределения. Впоследствии в качестве стационарной фазы стали применять листы фильтровальной бумаги, насыщенной водой. Наиболее подходящими органическими растворителями оказались фенол, н-бутиловый спирт, коллидин и некоторые другие растворители, частично смешивающиеся с водой. Индивидуальные аминокислоты были идентифицированы по цветным реакциям и охарактеризованы величинами Rf, представляющими собой отношения скорости движения зоны адсорбции к скорости движения фронта растворителя. Можно также измерять и использовать для идентификации отношение расстояния, на которое переместилось данное вещество, к расстоянию, на которое перемещается эталонное вещество (например [c.1512]

Дальнейшее развитие применения метода хроматографии распределения для идентификации и анализа циклических ангидридов аминокислот непосредственно в гидролизатах белков, возможно, позволит обнаружить ряд новых более сложных ангидридов, разрушающихся вследствие своей нестойкости в процессе их выделения. [c.347]

Метод хроматографии распределения на бумаге применен для идентификации и установления состава циклических ангидридов аминокислот. [c.347]

В настоящее время поразительные успехи достигнуты при помощи других методов идентификации (в частности, при помощи хроматографии). Они, очевидно, менее надежны, чем способ выделения, и полученные результаты всегда нуждаются в подтверждении однако при правильном применении возможности этих методов действительно весьма велики. В качестве доказательства следует сослаться на те поправки, которые за очень короткое время были внесены в официальный перечень аминокислот. [c.102]

Хроматография на бумаге нашла широкое применение в химии почвы, в основном для качественной идентификации компонентов гидролизатов почвы. Это обусловлено тем, что составляющие почву соединения с трудом экстрагируются количественно ввиду их полимерного строения, а также присутствием в почве большого числа веществ, в одинаковой степени растворимых в различных растворителях. Для количественного анализа хроматографию на бумаге чаще всего применяют при определении аминокислот, содержащихся в гидролизатах почвы. Однако этот метод вытесняется колоночной ионообменной хроматографией, являющейся более точным, чувствительным и гибким методом, позволяющим анализировать большие количества веществ. [c.301]

Адсорбционная и ионообменная хроматография нашли применение при разделениях аминокислот и пептидов, углеводов, при извлечении витаминов ионитами, их очистке, разделении и идентификации, при очистке формалина, при хроматографировании антибиотиков. [c.276]

НИИ Смешанных ангидридов, полученных из свободной кислоты,, диэтиламина и этилового эфира хлормуравьиной кислоты (о получении in situ Смешанных ангидридов См. примеры в разд. А.1). В большинстве случаев смешанные, ангидриды дают производные боле сла-. бой кислоты, входящей в состав ангидрида, кроме случая с трифтор-уксусной кислотой, когда получаются смеси амидов [47]. Недавно было описано применение большого числа трифторацетамидов для идентификации аминов методом газо-жидкостной хроматографии [48]. Ацилированные аминокислоты можно получать с хорошим выходом из свободной кислоты и ангидрида [49], а соответствующие иминокислоты — из свободной кислоты и циклического ангидрида, лучше в присутствии 0,1 экв триэтиламина [50]. Выходы в этих превращениях обычно составляют 80% и выше. [c.390]

Развитие хроматографических методов разделения и идентификации аминокислот значительно облегчило проведение исследований с аминокислотами многие успехи, достигнутые в изучении аминокислот за последнее время, непосредственно связаны с применением хроматографии. Занимаясь разделением аминокислот, Нейбергер [154] в 1938 г. обнаружил, что у ацетил-производных разных нейтральных аминокислот коэффициенты распределения между водой и несмешивающимися с водой растворителями различны. В 1941 г. хМартин и Синг [155] осуществили разделение ацетилированных аминокислот на силикагеле последний служил инертной опорой для водной фазы, через которую протекал неводный растворитель. В дальнейшем эта техника была усовершенствована. Большим достижением явилось использование фильтровальной бумаги в качестве неподвижной фазы [156], что привело к широкому развитию разнообразных методов хроматографии на бумаге (см. Блок и др. [157]). В настоящее время считают, что в процессе разделения веществ на бумаге наряду с распределением между растворяющими фазами играют роль также механизмы адсорбции и ионного обмена. [c.40]

Сочетание пиролитической газовой хроматографии с масс-спек-трометрией, вероятно, позволит решить задачу идентификации аминокислот и простейших пептидов без применения стандартов непосредственно по тем фрагментам, на которые распадается исходная. дюлекула в процессе тер.модеструкцни. [c.62]

Количественный анализ аминокислот методом ГХ представляет несомненный интерес. Как правило, количественное определение аминокислотного состава пептида является одним из решающих моментов анализа последовательности. Поскольку при деградации крупного белка образуется большое число фрагментов, желательно затрачивать на анализ каждого из них минимальное количество времени и вещества. Привлечение в данном случае ГХ достаточно хорошо удовлетворяет этим условиям. Многочисленные исследования по ГХ аминокислот в конечном итоге направлены на решение этой задачи. Однако к действительно эффективному количественному методу предъявляются несоизмеримо более высокие требования, чем к качественному. Если учесть к тому же трудности получения и разделения производных аминокислот, станет ясно, почему до сих пор не разработан стандартный метод их количественного определения с помощью газового хроматографа. Основные трудности связаны, как подчеркивалось в разделе о получении производных, с полифункциональными аминокислотами. Метод, игнорирующий их идентификацию, может найти лишь ограниченное применение. Количественный анализ только простых аминокислот не может удовлетворять экспериментатора [40]. Вопрос о том, все ли аминокислоты, встречающиеся в белках, можно определять ГХ с достаточной точностью, все еще остается открытым. Здссь можно только вкратце рассмотреть имеющиеся условия и возможности. Проблемы, связанные с аппаратурой, необходимой для количественной ГХ, уже обсуждались ранее (см. стр. 302). [c.335]

Первая стадия опре51 еления строения белка состоит в идентификации и количественном определении составляющих его аминокислот. Для этого требуется образец чистого белка, что само по себе представляет значительную проблему. Чтобы получить чистый образец, обычно применяют комбинацию методов (гл. 3), таких, как гель-электрофорез, ионообменная хроматография и центрифугирование по градиенту плотности (белки с большей молекулярной массой оседают быстрее, чем белки с меньшей молекулярной массой). Когда белок в результате применения этих методов становится однородным или когда достигнут максимум биологической активности, белок считается чистым. Тогда его гидролизуют до составляющих аминокислот горячей соляной кислотой и гидролизат анализируют. [c.267]

Наряду с приведенными примерами применения комплексонов в хроматографии или ионофорезе необходимо отметить, хотя бы вкратце, применение комплексонов для выделения мешающих тяжелых металлов из бумаги для хроматографических или электрофоретических целей. Эти металлы могут образовывать соли или комплексы с разделяемыми веществами и мешать хроматографическому разделению их и идентификации [25]. Бумагу можно промывать раствором комплексона III перед хроматографическим проявлением или добавлять комплексон в растворитель. Хайс и Хоржешовский [26] применили второй способ для выделения тяжелых металлов в бумажной хроматографии аминокислот, Уокер и Уоррен [27] и Флеккенштейн, Янке и Эльке [28] — для разделения различ1 ых эфиров с]х сфорной кислоты. [c.260]

Открытие в 1944 г. метода бумажной хроматографии (БХ), чрезвычайно расширившего возможности обнаружения, идентификации и разделения малых количеств веществ, означало подлинную революцию в химии, особенно в биохимии. Этот метод был открыт Консденом, Гордоном, Мартином и Синджем, которые разработали и применили его для анализа белковых гидролизатов, т. е. смесей аминокислот. Последние два из перечисленных авторов были удостоены Нобелевской премии за открытие распределительной хроматографии. В последующие 10 лет метод БХ был значительно усовершенствован и получил такое распространение, что нельзя было представить без него работу какой-либо химической или биохимической лаборатории. Однако с 1952 г. БХ начала постепенно вытеснять ее младшая сестра — тонкослойная хроматография (ТСХ), которая оказалась эффективнее благодаря возможности более быстрого проведения эксперимента, большей пригодности для препаративных работ и более широким возможностям обнаружения (включая применение коррозионно-активных реагентов). В настоящее время ТСХ используется чаще, чем БХ, в примерно 5 и более раз. [c.58]

Другие внутренние звенья полинентидной цепи, прореагировавшие своими боковыми группами, будут вести себя при pH 7 как цвиттерионы, т. е. не станут сорбироваться на анионите. Таким способом мы селективно сорбируем интересующее нас N-кoнцeвoe звено (или звенья, если цепей не одна, а несколько). После элюции с ионита с помощью разбавленной кислоты мы можем идентифицировать окрашенное соединение тем или иным способом. Один из самых простых способов идентификации — применение бумажной хроматографии и измерение i y, т. е. отношения скорости движения пятна на хроматограмме к скорости движения фронта растворителя. Для всех соединений аминокислот с дипитрофторбензолом величины Rf хорошо известны, и ими можно воспользоваться для опознания аминокислоты. Можно также легко приготовить соответствующие свидетели . [c.22]

В работах [47—53] описано разделение аминокислот на тонких слоях целлюлозы. Обычно в этом случае вполне приемлемы растворители и реактивы для опрыскивания, применяемые в хроматографии на бумаге. Фон Арке и Негер [54] разработали методику разделения и идентификации 52 амйнокислот (табл. 17.3) на слоях целлюлозы с четырьмя смесями растворителей с применением пяти цветных реакций. С этой целью были приготовлены шесть пластинок раз.мером 20x20 см, покрытых целлюлозой (всего авторы использовали четыре цветные реакции при двумерной комбинации / и //), Пластинки сушили 12 ч при комнатной температуре в горизонтальном положении и наносили водный раствор пробы в угол пластинки на расстоянии 25 мм от края. Объем пробы не должен превышать 1 мкл, а общее количество данной аминокислоты не должно превышать 10 мкг. [c.484]

Приведенные результаты показывают, что метод пиролитической газовой хроматографии можно с успехолг использовать для идентификации белков, пептидов и аминокислот, в частности фракций, разделенных методом жидкостной хроматографии. Пиролитическую хроматографию можно непосредственно сочетать с жидкостной. В жидкостно.м хроматографе с пламенно-ионизационным детектором имеется устройство для пиролиза разделенных фракций. Если при записи хроматограммы в какой-то момент времени часть продуктов пиролиза направить не прямо в детектор, а через хроматографическую колонку, то можно получить пирограмму компонента, соответствующего данному пику. Такая методика весьма напоминает хроматомасс-спектрометрию, примененную к нелетучим соединениям, и позволяет провести идентификацию разделенных компонентов. [c.62]

Применение динитрофенильных производных, введенных в практику Зангером [25] с целью идентификации и количественного определения концевых аминогрупп, позволяет получить ценные сведения о количестве открытых цепей в белке. Кроме того, такие меченые аминокислоты служат в качестве реперных точек при исследовании неполного гидролиза (1346). В этом отношении полезными являются также е -аминогруппы лизина. Путем неполного гидролиза, осуществляемого с помощью кислоты и различных типов ферментов, оказалось возможным разрывать длинные полипептидные цепи в различных точках и путем анализа установить единственно возможную конфигурацию. Этим способом Зангер и Таппи[99]и Зангер и Томпсон [100] определили порядок чередования аминокислот в двух типах цепей, входящих в состав инсулина (табл. 27). Такой подход к проблеме структуры белка был облегчен широким применением новейших микрометодов хроматографии на бумаге и силикагеле и ионофореза. Таким образом, оказывается, что одна из крупнейших проблем химии белка поддается изучению с помощью весьма простых и экономичных методов. Цепи в инсулине имеют различную длину, причем цепь с N-концевым фенилаланином (цепь В) состоит из 30 остатков, а соответствующая глициновая цепь (цепь А) — из 21 остатка. Порядок чередования аминокислот и их содержание даны в табл. 27. Можно отметить следующее. Цепь А не содержит лизина, гистидина, аргинина, треонина, фенилаланина и пролина все эти компоненты входят в состав цепи В, в которой, в свою очередь, совсем нет изолейцина. Не наблюдается ни регулярного чередования аминокислот, ни тенденции к чередованию полярных и неполярных групп. Три ароматические аминокислоты (фен.фен.тир.) расположены последовательно, и два остатка глутаминовой кислоты связаны с двумя остатками ци-стеина (глу.глу.цис.цис.). В обеих цепях содержится шесть цистеиновых остатков, четыре из которых расположены врозь, а только что упомянутые два — рядом друг с другом в молекуле нативного белка все они существуют в форме цистина, но какие из них расположены между пептидными цепями, а какие в самих пептидных цепях — неизвестно. Часть дикарбоновых кислот присутствует в виде амидов — четыре в цепи А и две в цепи В. [c.255]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология