ДНФ-производные аминокислот хроматография

Идеальным носителем является носитель, инертный по отношению к разделяемым веществам. Однако получение таких носителей связано с рядом технических трудностей, поэтому область применения распределительной хроматографии на колонках невелика и ограничивается разделением органических кислот, дубильных веществ, динитрофенильных производных аминокислот и др. [2—6]. [c.74]

Осадок ДНФ-производного пептида переносят в ампулу, добавляют 1 мл 5,7 н. НС1 (перегнанной), отсасывают воздух и запаивают (с. 124). Препарат гидролизуют в течение 8 ч при 105° С. Гидролизат переносят в пробирку с притертой пробкой, разбавляют 1—2 объемами воды и экстрагируют ДНФ-производные аминокислот эфиром, свободным от перекисей. Экстракцию проводят 2—3 мл эфира несколько раз. Эфирный слой осторожно отсасывают капилляром в маленький стаканчик. После испарения эфира осадок растворяют в небольшом количестве ацетона и исследуют методом хроматографии. Оставшийся после экстракции эфиром водный раствор может быть использован для хроматографического определения водорастворимых ДНФ-производных аминокислот. [c.146]

При использовании метода тонкослойной хроматографии разделение проводят на пластинках, покрытых силикагелем. Их можно приготовить в лаборатории (на поверхность стекла тонким слоем наносят суспензию силикагеля в воде) (с. 72). Разделение ДНФ-производных аминокислот можно проводить также на готовых стандартных пластинках, например Силуфол . Размеры камеры определяются размером пластинки. [c.147]

Обнаружение вещества непосредственно на столбике носителя представляет собой наиболее простой и удобный метод. Если сами вещества окрашены, как, например, динитрофенильные производные аминокислот или органические красители, то их наблюдение не представляет никаких затруднений, так как в настоящее время применяют только бесцветные носители. Так же как и при адсорбционной хроматографии, наблюдение можно вести в ультрафиолетовом свете. Однако необходимо иметь в виду что флуоресценция иногда может быть вызвана присутствующими загряз нениями, в то время как сами разделяемые вещества остаются невидимыми [c.460]

По другому способу на свободную аминогруппу в дипептиде действуют динитрофторбензолом [127] (см. также стр. 473), а полученное производное гидролизуют способом, описанным выше. Остаток гидролизата после упаривания на бумажной хроматограмме дает пятно аминокислоты, которая была связана в дипептиде своей аминогруппой, и пятно динитрофенильного производного аминокислоты, которая была связана в дипептиде карбоксильной группой. Существует еще несколько аналогичных способов,позволяющих найти последовательность аминокислот в молекулах пептидов с применением хроматографии на бумаге. [c.480]

Радиоизотопный анализ производных жирных и желчной кислот, приготовленных с использованием и разделенных методом хроматографии на бумаге, осуществляли путем непосредственного измерения радиоактивности пятен хроматограммы [91, 94, 95] или путем приготовления из бумажной хроматограммы авторадиограммы и последующего измерения интенсивности хроматографических зон с помощью записывающего микрофотометра [92, 93]. Использовали и жидкостные сцинтилляционные счетчики в комбинации с жидкостной колоночной хроматографией [96]. При использовании жидкостного сцинтилляционного счетчика в комбинации с тонкослойной хроматографией чувствительность метода, в котором применяется для определения динитрофенильных производных аминокислот [97], возрастала в сто раз, достигая 1 пМ 98] при воспроизводимости результатов d=6%. Анализируя аналогичным методом смеси кислот известного состава, можно идентифицировать анализируемые кислоты и оценить их количества. Определенным преимуществом диазометана является отсутствие пространственных эффектов при проведении вышеуказанных реакций. [c.154]

Методическое руководство по биохимии и иммунохимии белка. Рассмотрены теоретические основы методов и современная аппаратура для гель-фильтрации, бумажной, ионнообменной н тонкослойной хроматографии, в том числе методы количественного аминокислотного анализа с помощью автоматических анализаторов. Подробно описан анализ производных аминокислот методом газовой хроматографии. Книга хорошо иллюстрирована и снабжена подробной библиографией. [c.4]

Для ГХ-анализа, разумеется, прежде всего необходим газовый хроматограф. Ниже дано описание этого прибора, подробное настолько, насколько это необходимо с точки зрения анализа производных аминокислот. Принцип работы прибора иллюстрирует фиг. 65. Прибор состоит из источника газа-носителя и различных измерительных и контрольных приборов, с помош ью которых поддерживается постоянный поток газа. Газ-носитель, прежде чем попасть в колонку, проходит через дозатор, куда вводится 0,05—5,0 мг анализируемого веш ества здесь веш ество испаряется и переносится га-зом-носителем в колонку (или капилляр). В колонке происходит разделение по принципу различного удельного давления паров компонентов и их различной растворимости в разделяюш ей жидкости. Различные скорости миграции компонентов обусловлены так- [c.295]

Производные аминокислот для газовой хроматографии [c.312]

ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ПРОИЗВОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ [c.328]

Эта метка является хромофорной группой благодаря наличию в ней протяжённой системы сопряжённых связей,, поэтому аминокислота, несущая метку, становится окрашенной в отличие от остальных аминокислот. При последующем гидролизе меченого пептида аминная связь 2,4-динитрофенильной группы с пептидом не затрагивается, и в образовавшейся смеси аминокислот только К-концевая кислота оказывается меченой. Анализ гидролизата с помощью тонкослойной хроматографии позволяет однозначно идентифицировать N-концевую аминокислоту путём сравнения хроматографической подвижности окрашенного пятна из гидролизата с подвижностями заведомых 2,4-ДНФ-производных аминокислот. [c.56]

Хроматография производных аминокислот получила интенсивное развитие в связи с разработкой методов определения первичной структуры белков. Вероятно, трудно найти в органической химии и биохимии более удачный пример столь тесной взаимосвязи развития представлений о структуре и функциях большого класса веществ, каким являются белки, с хроматографическими методами анализа. Основное внимание было направлено на разработку методов определения N-концевых остатков аминокислот в белках, причем в идентификации соответствующих производных большое значение имели тонкослойная (ТСХ) и бумажная хроматография (БХ) (см. обзоры [1, 2]). Газожидкостная и жидкостная колоночная хроматографии находят в этой области ограниченное применение, однако интерес к последнему методу постепенно растет. Интерес к жидкостной хроматографий вызван вполне определенными причинами. Во-первых, постоянно появляются новые методы избирательной модификации остатков аминокислот в белках, а идентификация производных аминокислот требует развития хроматографических методов. Во-вторых, исследованию подвергают все более труднодоступные белки, что в свою очередь вызывает необходимость создания надежных методов количественного анализа. Интерес к колоночной хроматографии возрастает также в связи с выделением и получением необычных аминокислот, а также в связи с необходимостью предотвращения ошибок при определении аминокислотной последовательности. Понятия современный и классический метод используют здесь условно, поскольку новые методики обычно создают на базе стандартной аппаратуры примером может служить автоматический анализ ДНФ- и ДНС-аминокис-лот [3, 4]. Насколько известно, до сих пор не пытались использовать скоростную хроматографию высокого разрешения для разделения производных аминокислот, хотя некоторые соединения, например ДНС-аминокислоты, являются для этого метода довольно удобным объектом. Производные аминокислот использовали в структурном анализе белков крайне неравномерно. По-видимому, всеобщее увлечение ДНФ-аминокислотами проходит окончательно, уступая место повышенному интересу [c.360]

Совершенно не ясно, каким образом вообще осуществляется взаимодействие между набухающими в воде гелями и ароматическими соединениями. Этот эффект можно подавить, вводя в элюент различные добавки. Создавая в элюенте высокую концентрацию роданида или мочевины, удается почти полностью нормализовать элюирование пикриновой кислоты и триптофана [52]. На сефадексе 0-25 в водно-спиртовой среде полифенолы ведут себя в соответствии с их молекулярным весом, ВТО время как в чистой воде они сильно задерживаются гелем [53]. Возможные активные центры геля не удается насытить путем добавления к элюенту ароматических соединений (например, 0,2 н. салицилата натрия) [42], однако в 1 М пиридине ди-нитрофенильные производные аминокислот появляются в элюате раньше, чем свободные аминокислоты. По-видимому, при хроматографировании в системе фенол — уксусная кислота — вода (1 1 1) гель уже не имеет сродства к ароматическим соединениям [54], Карнеги [55], работая на сефадексе 0-25 в этой системе (которая позволяет избежать побочных эффектов), сумел на ряде пептидов подтвердить обычную зависимость между объемами выхода и молекулярным весом (табл. 26). Он предполагает, что при молекулярном весе выше 400 имеет место собственно гель-хроматография, поскольку здесь уже не должен действовать эффект распределения [63]. Однако до сих пор все же не доказано, одинаков ли состав растворителя в гранулах геля и между гранулами. [c.130]

Для тонкослойной хроматографии фенилтиогидантоиновых производных аминокислот в качестве сорбента использовали также силикагель, а в качестве растворителей системы ксилол — метанол (80 10) и гептан — дихлорэтан — пропионовая кислота (45 25 30) [186]. Проявление велось при помощи 1,7%-ного раствора нингидрина в смеси метанол — коллидин — уксусная кислота (15 2 5). Этим методом можно разделять фенилтиогидантоины, имеющие близкие значения Rf. [c.115]

Необходимо отметить, что анализ производных аминокислот в тонком слое приблизительно в 10 раз чувствительнее, чем хроматография их на бумаге. Используя оптимальное зернение силикагеля в пределах 2— 5 мк и ограничивая пробег растворителя до 4—5 см, можно резко (в 5—10 раз) улучшить чувствительность определения фенилтиогидантоиновых производных аминокислот [192]. [c.117]

Окислы, гидроокиси и карбонаты кальция, магния и цинка являются полярными адсорбентами основного характера со свойствами, близкими к свойствам окиси алюминия (см. разд. 5). В некоторых случаях они проявляют повышенную селективность, например к веществам с конъюгированными двойными связями и к ароматическим веществам. Их применяют для хроматографии каротиноидов, порфиринов, желчных кислот, фосфолипидов высших жирных кислот, производных аминокислот. [c.32]

Большое число работ, опубликованных в 1980—1983 гг., посвящено отработке обратнофазовой гидрофобной хроматографии фенил-тиогидантоиновых производных аминокислот (ФТГ-АК). В виде таких производных аминокислоты одна за друго отщепляются при автоматическом определении последовательности аминокислот в полипептиде по методу Эдмана. Эта операция получила название секвенирования белков, а соответствующие автоматические приборы [c.196]

Вследствие тенденции метильных групп к подаче электронов заряд на азоте диметиламинокислот несколько повышен, амфотерные свойства их выражены столь же ярко, как и у самих аминокислот. Разделение их методами электрофореза и хроматографией менее четко, чем разделение динитрофенильных производных аминокислот. Диметильные производные аминокислот не имеют широкого применения при исследованиях строения пептидов. [c.511]

В качестве хиральных реагентов для получения пригодных для хроматографии диастереомерных производных аминокислот используют оптически активные амиловый спирт как компонент этерификации для N-пентафтор-пропиониламинокислот [178] и а-хлоризовалерилхлорид как аш1лирующий компонент для эфиров аминокислот [179]. Применение продажных стеклянных капилляров с готовой неподвижной фазой обеспечивает оптимальное разделение большинства аминокислот. [c.64]

ДНФ-группу вытеснила Л -(1-диметиламинонафтил-5-сульфо-нильная) или дансильная группа, которую можно вводить при реакции пептида или белка с 1-диметиламинонафтил-5-сульфонил-хлоридом (8) при pH 8 схема (13) . Дансильные производные аминокислот и пептидов сильно флуоресцируют их можно отделить и идентифицировать с помощью тонкослойной хроматографии, например на е-поликапролактаме [16]. Обычная чувствительность (примерно 100 пикомоль) может быть повышена до 25 фемтомоль при использовании [ Н]-меченного дансилхлорида с последующей авторадиографией [17]. [c.266]

Тонкослойная хроматография на силикагеле оказалась весьма полезной для идентификации фенйлтиогидантоиновых производных аминокислот (ФТГ-аминокислот). Для предварительного определения этих соединений Бреннер и др. [4] рекомендовали двумерное разделение сначала в смеси хлороформ—метанол (9 1) и затем в смеси хлороформ — муравьиная кислота (100 5). Чтобы идентифицировать ФТГ-аминокислоты, на той же хроматографической пластинке фракционируют стандартные растворы известных аминокислот. [c.236]

Количественный анализ аминокислот методом ГХ представляет несомненный интерес. Как правило, количественное определение аминокислотного состава пептида является одним из решающих моментов анализа последовательности. Поскольку при деградации крупного белка образуется большое число фрагментов, желательно затрачивать на анализ каждого из них минимальное количество времени и вещества. Привлечение в данном случае ГХ достаточно хорошо удовлетворяет этим условиям. Многочисленные исследования по ГХ аминокислот в конечном итоге направлены на решение этой задачи. Однако к действительно эффективному количественному методу предъявляются несоизмеримо более высокие требования, чем к качественному. Если учесть к тому же трудности получения и разделения производных аминокислот, станет ясно, почему до сих пор не разработан стандартный метод их количественного определения с помощью газового хроматографа. Основные трудности связаны, как подчеркивалось в разделе о получении производных, с полифункциональными аминокислотами. Метод, игнорирующий их идентификацию, может найти лишь ограниченное применение. Количественный анализ только простых аминокислот не может удовлетворять экспериментатора [40]. Вопрос о том, все ли аминокислоты, встречающиеся в белках, можно определять ГХ с достаточной точностью, все еще остается открытым. Здссь можно только вкратце рассмотреть имеющиеся условия и возможности. Проблемы, связанные с аппаратурой, необходимой для количественной ГХ, уже обсуждались ранее (см. стр. 302). [c.335]

Полиамиды применяются для жидкостной хроматографии липофильных I гидрофильных веществ флавонов, халконов, хинонов, лактонов, ароматически нитросоединений, изомерных нитроанилинов, дубильных веществ, фенолов, орга нических кислот, амидов, аминов, ДНФ- и данзил-производных аминокислот сахаров, гликозидов, сульфокислот и сульфонамидов, азотистых оснований нуклеозидов и нуклеотидов, стероидов, витаминов, пестицидов, красителей антиокислителей, лекарственных жаропонижающих веществ. В хроматографи ческой практике полиамиды используются с 1955—1956 г. [c.186]

Важным этапом стало открытие Н. А. Измайловым и М С. Шрайбер метода хроматографии в тонком слое в 1938 г. в Харьковском. химико-фармацевтическом институте. Далее существенным в развитии хроматографии стало открытие Мартином и Сингом в 1940 г. варианта жидкостной распределительной хроматографии на примере разделения ацетильных производных аминокислот на колонке, заполненной силикагелем, насыщенным водой, с использованием хлороформа в качестве растворителя. Тогд же было отмечено, что в качестве подвижной фазы может быть использована не только жидкость, но и газ. Далее эти ученые предложили осуществлять разделение производнцх аминокислот на смоченной водой бумаге с бутанолом в качестве подвижной фазы. Они же осуществили первую двумерную систему разделения. [c.15]

Выше рассмотрены основные закономерности хроматографии на силикагеле в нормально-фазовом режиме. Такой способ использования силикагеля — исторически первый, и с помощью его решено множество практически важных задач. Впоследствии силикагель в значительной степени был вытеснен обращенно-фазовыми сорбентами. Однако данные самого последнего периода свидетельствуют о том, что возможности силикагеля далеко не исчерпываются классической нормальнофазовой Хроматографией. Помимо относительно малополярных элюентов при хроматографии на силикагеле могут использоваться различные нетрадиционные подвижные фазы. При этом возможно получение хороших практических результатов даже для таких сорбатов, которые, как правило, рекомендуют разделять в обращенно-фазовом режиме. Механизм сорбции в таких случаях довольно сложен и изучен еще недостаточно. Обычно принято считать, что поверхность силикагеля слабокислая, и это иногда является причиной затруднений при нормальнофазовой хроматографии оснований. Установлено, однако, что современные марки силикагеля для ВЭЖХ, имеющие сферическую форму частиц, могут быть как кислыми, так и щелочными [128]. Это обстоятельство следует иметь в виду при разработке методик, так как высокое значение pH силикагеля может положительно сказаться на форме пиков оснований и селективности разделений. Аналогичен результат при применении буферированного силикагеля [343, 344]. Для получения этого материала силикагель пропитывали 0,1 М раствором соли или кислоты, после чего высушивали в вакууме и затем заполняли колонку суспензионным способом. В качестве подвижных фаз использовали обычные для нормально-фазовой хроматографии системы например, смеси гексана с диэтиловым эфиром в различных соотношениях. Пропитка силикагеля гидросульфатом натрия либо щавелевой, лимонной, винной кислотами способствовала существенному улучшению формы пиков изомеров гераниевой кислоты. Аналогичного эффекта для сорбатов основного характера — производных антраниловой кислоты — удалось добиться пропиткой фосфатно-цитратным буфером. Последний прием позволил также получить вполне симметричные пики ФТГ-производных аминокислот. [c.157]

Рис. 6. Разделение ДНС-производных аминокислот двумерной хроматографией на тонком слое силнкаге.пя а различных системах растворителей.

В газовой хроматографии на открытых капиллярных ко лонках внутренние стенки колонок перед нанесением непод вижной фазы подвергают щелочной обработке или травлений Так, авторы работы [25] обрабатывали капилляр из мягкоп стекла 2,5 н раствором гидроксида натрия в течение 2 - 8 при 100°С Полученную таким образом колонку использовал) для разделения сильных производных аминокислот Оптималь ные условия предварительной обработки колонок такого тиЛ подробно изучены Исии и сотр [45] [c.66]

К счастью, несколько иная методика измерения была разработана рядом хроматографистов, одним из которых был Г. Поллок, работающий в том же самом Научном центре в Эймсе. Основанный на газовой хроматографии, метод Поллока требует всего лишь нескольких микрограммов пробы и может быть применен к сложным смесям атаино-кислот. Первым этапом методики была этерификация аминокислот чистым (только одним энантиомером) 7 -2-бутанолом. Полученный эфир имел два асим метрических центра и мог существовать в виде-двух диастереомеров ЯЯ и где первая буква относится к конфигурации спирта, а вторая — к конфигурации аминокислоты. Затем эфиры были переведены в амиды обработкой трифторуксусным ангидридом для уменьшения полярности амино-группы и повышения летучести производных аминокислот, что позволило проводить успешное их хроматографирование. Используя капиллярные колонки, имеющие характеристики, приведенные на рис. 17-16, Поллок получил хроматограмму смеси диастереомерных производн ых аминокислот. Заметим, что каждая аминокислота дает пару пиков. Эксперименты доказали, что каждый пик отвечает одному из двух диастереомеров и что характеристики удерживания диастереомеров, которые отличаются только конфигурацией при асимметрическом углеродном атоме, как оказалось, были вполне достаточными, чтобы можно было проводить их разделение на газохр оматографической колонке. Таким образом, относительные количества Я- и 5-энантиомеров для некоторых отличающихся между собой аминокислот можно было определить хроматографированием,, сравнивая относительные высоты ЯЯ- и 5-пиков для каждого производного аминокислоты, причем для обнаружения требуется всего несколько нанограммов каждой аминокислоты. [c.585]

К флуоресцирующим соединениям, главными из которых являются ДНС-аминокислоты. Для контрольных анализов Ы-кон-цевых аминокислот используют гадантоины и фенилтиогидан-тоины аминокислот. Помимо методик, касающихся разделения этих групп соединений, в данную главу включен небольшой материал по жидкостной хроматографии других производных аминокислот. [c.361]

Известно более 40 производных аминокислот, при помощи которых можно определять Ы-концевые остатки аминокислот в пептидах и белках. Однако эти соединения редко идентифицируют методом жидкостной хроматографии обычно удовлетворяются качественным анализом при помощи тонкослойной хроматографии. При этом с целью облегчения детектирования стремятся использовать окрашенные флуоресцирующие или радиоактивно меченные реагенты. В качестве примера можно привести 3,5-динитрофенилизо йоцианат [32—34] и 4-дИметила-мино-3,5-динитрофенилизотиоцианат [32—35]. Много внимания было уделено вопросу применения в аналитической химии белка меченого иодбензол-п-сульфонилхлорида (пипсил-хлорида) [36, [c.384]

Широкое применение хроматография в тонком слое получила для разделения производных аминокислот — фенилтиогидантоиновых и дансильных (5-диметилами-нонафтилсульфонильных) производных, широко используемых для анализа аминокислот в химии пептидов и белков. [c.115]

Порошки полиамидов используют в хроматографической практике с 1955— 1956 гг. Полиамиды применяют для жидкостной адсорбционной хроматографии липофильных и гидрофильных веществ — фенолов, фенолгликозидов, флаво-ноидов (флавонов, халконов, катехинов и др.), кетонов, хинонов, лактонов, полиспиртов, углеводов, органических кислот, сульфокислот и сульфонамидов, тиаминов, ароматических нитросОединений, ДНФ- и дансил-производных аминокислот, азотистых гетероциклических соединений (индолов, хинолинов, алкалоидов, нуклеиновых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов, желчных пигментов), стероидов и желчных кислот, каротиноидов, витаминов, антибиотиков, пестицидов. [c.47]