Ионообменная хроматография нуклеотиды

Приложение ионообменной хроматографии к нуклеотидам, аминокислотам, сахарам и другим веществам [208]. [c.217]

В органической химии ионообменная хроматография используется для разделения органических кислот, а также некоторых веществ, характерных для биохимических систем — в частности, для разделения аминокислот, пептидов и нуклеотидов. В настоящее время ионообменная хроматография является обычным методом в биохимических исследованиях она используется также в качестве стандартного метода анализа в биохимической промышленности. [c.25]

Наличие фосфатной грунны в нуклеотидах резко отличает последние от нуклеиновых оснований и нуклеозидов. Нуклеотиды — сильные двухосновные кислоты (рК1 1 и рКа 6) [20]. Разделение и анализ микроколичеств нуклеотидов обычно проводят хроматографией на бумаге, для больших количеств или для точного анализа применяется ионообменная хроматография. [c.326]

Для анализа сложных смесей нуклеотидов наибольшее применение находит ионообменная хроматография. Разделение нуклеотидов на ионообменниках зависит в основном от двух факторов [c.326]

Нуклеотиды, нуклеозиды, пуриновые и пиримидиновые основания— нелетучие полярные соединения, имеющие приемлемую растворимость в водных растворах. Эти соединения способны ионизоваться в водных растворах, хотя в каждом отдельном случае это зависит от температуры, pH и ионной силы среды водных растворов. Все приведенные химические характеристики соединений указанного типа позволяют предположить, что в данном случае наиболее действенным способом разделения может быть ионообменная хроматография. Особенно важно, что степень ионизации зависит от трех переменных температуры, pH и ионности среды. Далее мы покажем, как, используя эти параметры, можно предложить практически бесконечное число вариантов методики разделения любой данной смеси компонентов нуклеиновых кислот. [c.302]

Структурные элементы нуклеиновых кислот — нуклеотиды, нуклеозиды и соответствующие основания, — являются соединениями, которые трудно либо вообще невозможно проанализировать методом газовой хроматографии. В то же время жидкостная хроматография позволяет осуществить быстрый анализ этих веществ и с высокой чувствительностью [4]. В связи с тем, что эти вещества обычно существуют в водных растворах в диссоциированном состоянии, их разделение осуществляется только методом ионообменной хроматографии. [c.203]

Нуклеотиды. 2, 3 -Нуклеотиды получают при щелочном гидролизе нуклеиновой кислоты. В связи с тем, что в состав молекул нуклеотидов входят фосфатные РО4-ГРУППЫ, имеющие сильнокислый характер, они находятся в растворах в виде анионов. Таким образом, разделение этих веществ следует проводить методом ионообменной хроматографии. В состав молекул входят также ароматические хромофоры, которые обычно сильно поглощают в ультрафиолетовой области. Поэтому для регистрации компонентов на выходе из колонки был выбран ультрафиолетовый (УФ) детектор. Молекулы анализируемых веществ сильно отличаются по своим [c.203]

Однако в 1949 г. Кон, применив ионообменную. хроматографию, выделил из щелочных гидролизатов дрожжевой рибонуклеиновой кислоты две изомерные адениловые кислоты [42, 43]. Затем и для других нуклеотидов было обнаружено существование подобных пар изомеров [44—46]. Для всех этих нуклеотидов менее кислый изомер (в отношении ионообменной хроматографии) назвали а -изо-мером, а другой — Ь -изомером будучи довольно устойчивыми к щелочам, эти изомеры в кислых условиях легко превращались [c.127]

Аденозин-2 -фосфат — монофосфорный эфир аденозина.-один из трех возможных изомеров адениловой кислоты. Его несложно получить, подвергая РНК щелочному гидролизу и выделяя образовавшиеся нуклеотиды с помощью ионообменной хроматографии. В щелочной среде — это стабильное соединение, в кислой среде — легко переходит в аденозин-2 -3 -фосфат. [c.35]

Может оказаться так, что сложные смеси нуклеотидов, сильно отличающихся по величине отрицательных зарядов и обладающих поэтому резко различным сродством к анионообменнику, будут очень плохо разделяться только в одном растворителе. Иногда такую смесь можно разделить, используя растворители с различными pH, однако в большинстве случаев наиболее успешным является ступенчатое элюирование растворителями с возрастающей концентрацией электролита [5]. Первому растворителю дают подняться на определенную высоту, затем пластинку не высушивая переносят в камеру с другим растворителем. Так можно повторить несколько раз, пока вещества не разделятся (обычно бывает достаточно 2—4 растворителей). При тонкослойной ионообменной хроматографии можно применять также элюирование градиентом концентрации [c.43]

Бариевые соли адениловой, гуаниловой, уридиловой и ци-тидиловой кислот являются наиболее удобной формой для выделения, хранения и применения нуклеотидов. Последние находят все больщее применение как для препаративных целей (синтез нуклеозидов, коферментов и т. д.), так и для биохимических исследований и в медицинской практике. Нуклео-зид-2 (3")-фосфаты бария могут быть получены из рибонуклеиновой кислоты щелочным гидролизом с последующим разделением методом ионообменной хроматографии и осаждением в виде бариевых солей. [c.93]

Эта техника имеет преимущества перед распределительной и адсорбционной хроматографией, когда она используется для фракционирования больших количеств материала, растворенного в воде. Очевидно, что основное использование ионообменной хроматографии состоит в выделении и фракционировании полинуклеотидов и нуклеотидов, но величины рКа гетероциклических оснований таковы, что в интервале pH 4—10 некоторые нуклеозиды могут нести по меньшей мере частичный заряд и, следовательно, могут быть разделены этим методом. Для ионообменника используют два основных типа подложки либо полистирол, либо целлюлозу, и оба типа широко использовались для разделения нуклеозидов. В ероятно, наиболее широко используется метод. [c.73]

Применение ионообменной хроматографии для анализа смесей нуклеотидов явилось логическим развитием этой техники разделения неорганических ионов. Хронологически катионообменная хроматография была изучена раньше анионообменной, однако последний метод дает наилучшие результаты по разделению фосфорных эфиров [3]. Адсорбция смеси фосфатов на анионообменной смоле с последующей элюцией их возрастающей концентрацией Кислоты или соли является стандартным приемом для выделения и анализа нуклеотидов. Позднее были применены ионообменные целлюлозы и декстраны, преимущества которых заключаются в [c.132]

При определении структуры индивидуальных нуклеотидов часто используют химический или ферментативный гидролиз, а также дефосфорилирование до соединений известной структуры. Исторически сложилось так, что гетероциклические основания и углеводные составляющие основных нуклеотидов были уже известны и нерешенным оставался лишь вопрос о положении фосфориль-ного остатка в углеводной части молекулы [14]. Эта проблема была решена сравнительно легко для 5 -нуклеотидов и для дез-оксинуклеозид-З -фосфатов. Однако быстрое взаимопревращение рибонуклеозид-2 - и -З -фосфатов оказалось серьезной проблемой для исследователей, начинавших работы в этой области. Применение ионообменной хроматографии для разделения компонентов гидролизата дрожжевой РНК позволило однозначно определить положение фосфорильных остатков в этих нуклеотидах. Для всех четырех основных нуклеотидов были получены пары изомеров (а) и (Ь). Осторожный гидролиз адениловых кислот (а) и [Ь) дал соответственно рибозо-2- и -3-фосфат, которые были идентифици- [c.137]

Моно- и дифосфаты являются кислыми соединениями, и их кислотная природа предопределяет использование ионообменной хроматографии для их выделения и разделения. Адсорбция смеси фосфатов на аниообменной смоле с последующей элюцией их возрастающей концентрацией кислоты или соли является стандартным приёмом для выделения и анализа нуклеотидов, Особенно удобны ддя этих целей модифицированные целлюлозы и декстраны, обеспечивающие наибольшую селективность. Нуклеотиды обладают сильным поглощением в ультрафиолетовой части спектра за счёт гетероциклических соединений, благодаря чему могут быть легко обнаружены в элюате и количественно оценены. [c.114]

Кон, впервые сообщивший в 1949—1950 гг. о ионообменной хроматографии осколков нуклеиновых кислот на синтетических обменных смолах [16—18], затем указал, что разделение этих веществ нужно проводить методом анионо- или катионообменной хроматографии [23]. Он применил оба вида хроматографии для разделения пуринов и пиримидинов [16], нуклеозидов и нуклеотидов [17—19, 24, 46]. [c.446]

Мононуклеотиды и нуклеотидполифосфаты разделяют на слоях эктеола методом ионообменной хроматографии в качестве растворителя пригоден разбавленный водный раствор хлорида натрия (табл. 115 и 117). Как правило, удовлетворительного разделения достигают за 15 мин. Величины Rf нуклеотидов являются функцией концентрации хлорида в растворителе скорость движения нуклеиновых оснований и нуклеозидов не зависит от концентрации хлорида. Это отчетливо видно из рис. 178, который заимствован из работы Рандерата [69]. [c.448]

Для разделения сложных смесей, содержащих вещества разных классов (основания, нуклеозиды, нуклеотиды и их поли-фосфаты, олигонуклеотиды, включая олигонуклеотиды, различающиеся порядком основании, и т. п.), с которыми имеют дело, например, при выделении кислоторастворнмой части клеток или тканей или при анализе ферментативных гидролизатов нуклеиновых кислот, применяют исключительно ионообменную хроматографию. В случае необходимости дальнейшее фракционирование проводят по многостадийной схеме, с использованием указанных выше методик. При этом наблюдаются те же закономерности, что и при анализе нуклеотидов (см. предыдущий раздел), поэтому в дальнейшем будет приведено лишь несколько примеров. [c.58]

Для пуриновых и пиримидиновых оснований такое протекание реакции с азотистой кислотой было доказано еще в прошлом веке возможность проведения аналогичных реакций с нуклеозидами была продемонстрирована в 1910 г.а с нуклеотидами — в 1932 г. Однако детальное исследование кинетики реакции с азотистой кислотой удалось провести лишь недавнотак как это было связано с техническими трудностями, вызываемыми постоянным изменением состава реакционной смеси (окислением нитрита, изменением pH и т. д.). Для получения воспроизводимых кинетических данных необходимо постоянно добавлять нитрит и кислоту или применять достаточно концентрированные буферные растворы. Скорость реакции удобно контролировать спектрофотометрически, поскольку продукты реакции заметно отличаются по своим УФ-спектрам от исходных соединений. Удовлетворительные результаты были получены также с помощью ионообменной хроматографии применение для этой цели хроматографии на бумаге менее надежно. [c.417]

Рис. 9. Разделение изомерных 2 -, 3 - и 5 -нуклеотидов [19] с помощью ионообменной хроматографии на анионите Дауэкс 1x2 (формиат), 400 меш, колонка — 5X0,82 см" , элюирующий раствор — муравьиная кислота и формиат аммония (в концентрациях, указанных на рисунке), 2, 3 и 5 — соответственно 2 -, 3 - и 5 -нуклеотиды.

Смешанные механизмы удерживания. Обсуждая выше условия ионообменной хроматографии, мы полагали, что механизмы удерживания, отличные от процесса ионного обмена, не играют существенной роли. Например, при выводе уравнений (3.78)— (3.82) мы предполож или, что в неподвижной фазе отсутствуют другие формы хроматографируемого компонента, такие, например, как протонированная форма аниона (ИХ). На практике это предположение не всегда является корректным. По этой причине различные неподвижные фазы с одинаковыми функциональными группами могут иметь различную селективность. Например, в работе [67] показаны различия в селективности при разделении нуклеотидов на двух различных сильных анионообмен- [c.110]

Из биологич. материала У. к. могут быть выделены их адсорбцией на угле, очисткой и разделением ионообменной хроматографией. Синтетически У. к. могут быть получены фосфорилпрованием уридина ферментативным или химич. путем (см. Нуклеотиды)-, УМФ-2 и УМФ-3 получают щелочным гидролизом рибонуклеиновой к-ты. [c.182]

Для разделения компонентов нуклеиновых кислот (т. е. оснований, нуклеозидов и нуклеотидов, а также самих нуклеиновых кислот) ионообменная хроматография применяется в весьма неодинаковой степени. Так, например, ионообменная хроматография — все еще типичный метод разделения нуклеотидов, однако для разделения оснований ее почти не применяют, отдавая предпочтение тонкослойной или бумажной хроматографии. При разделении нуклеиновых кислот ионитам также предпочитают другие сорбенты, в частности оксиапатит, диатомитовые земли, покрытые слоем метилальбумина. [c.327]

Если необходимо определение содержания только нескольких нуклеотидов, то возможен более быстрый анализ. Так, ори использовании ионообменной хроматографии без применения градиентного элюирования возможно разделение moho-, ди- и трифосфатов аденозина за [c.205]

Нуклеотиды. Разделение этих нуклеотидов методом ионообменной хроматографии имеет важное значение, так как соответствующая методика, применяемая для разделения этих веществ при помощи тонкослойной хроматографии, не позволяет разделить инозин-, гуанозин- и ксантозинмонофосфаты. Эти нуклеотиды обычно используют для усиления аромата мясных продуктов. [c.208]

Первый нуклеотид, инозиновая кислота (по-гречески — мышечная ткань), был выделен Либихом [2] в 1847 г. из мясного экстракта отчасти как результат полелп1ки, поднятой Берцелиусом по поводу наличия креатина в сыром и вареном мясе). С тех пор было выделено большое число мононуклеотидов, как правило, 5 -фосфаты, хотя в яде тигровых змей и родственных видов был найден также аденозин-З -фосфат 13]. Эти соединения выделяют прямой экстракцией тканей или организмов 14—9], в которых они обычно присутствуют в небольших количествах в качестве промежуточных соеди-нени1 обмена. Однако основным источником мононуклеотидов являются их полимерные производные, нуклеиновые кислоты. При щелочном гидролизе в мягких условиях [10, 11] рибонуклеиновой кислоты образуется смесь 2 - и З -фосфатов нуклеозидов, которую можно легко разделить с помощью ионообменной хроматографии 112], Для выделения аналогичных 5 -эфиров требуется применение ферментативного гидролиза, как правило, с использованием фосфо-диэстеразы змеиного яда 113, 14]. Подобная ферментативная обработка дезоксирибонуклеиновой кислоты после предварительной обработки дезоксирибонуклеазой приводит к дезоксинуклеозид-5 -фосфатаы [15—17]. Очищенная диэстераза змеиного яда значи- [c.123]

Применение методов хроматографии на бумаге для быстрого анализа пуриновых и пиримидиновых оснований [76, 77] в гидролизатах небольших количеств рибонуклеиновых кислот вскоре показало, что молярная эквивалентность этих оснований скорее была исключением, чем общим правилом. Еще более важным было наблюдение, что разделение смеси нуклеотидов в щелочном гидролизате рибонуклеиновой кислоты при помощи ионообменной хроматографии дает изомерные пары нуклеотидов, являющихся, как позже было показано, нуклеозид-2 - и пуклеозид-З -фосфатами [78]. Хотя эти изомеры не подвергались взаимопревращению в щелочи, кислота легко катализировала миграцию фосфатного остатка между 2 - и З -гидроксильными группами. Таким же методом были обнаружены 5 -фосфаты аденозина, цитидина, гуанозина и уридина (среди прочих продуктов) после гидролиза кишечной фосфодиэстеразой рибонуклеиновых кислот, предварительно обработанных рибонуклеазой [79]. Со значительно более высокими выходами нуклео-зид-5 -фосфаты получены при действии диэстеразы змеиного яда на рибонуклеиновые кислоты из дрожжей и печени теленка гидролизаты содержали также свободные нуклеозиды и нуклеозид-2 (3 ),5 -ди-фосфаты [80]. [c.373]