Глицилтирозин

Хотя выдвинутая Фишером гипотеза ключа и замка оказалась весьма плодотворной и объясняет многие общие закономерности субстратной специфичности, по мере накопления в последние годы детальной информации о взаимодействиях типа фермент-молекула ее недостатки становились все более очевидными. В буквальном смысле эта теория подразумевает наличие жесткого центра связывания. В то же время имеется большое число данных, как рентгеноструктурных, так и прямых спектрофотометрических и кинетических исследований ферментов в растворе, о конформационной мобильности белков. Мы видели, что тирозин-248 карбоксипептидазы при связывании глицилтирозина сдвигается не менее чем на 1,2 нм, явно меняя природу и форму как участка связывания, так и каталитического центра (см. разд. 24.1.3.4). Это, возможно, крайний случай, однако при наличии рентгеноструктурчых [c.515]

СТРУКТУРА КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ А И ЕЕ КОМПЛЕКСА С ГЛИЦИЛТИРОЗИНОМ [c.508]

X42X38 А имеет почти сферическую форму и, следовательно, компактнее, чем было предсказано на основании величины f/fo, определенной из коэффициентов диффузии [45]. В непосредственной близости от атома цинка находится полость, которая оказалась участком связывания ароматической боковой цепи глицилтирозина (ср. рис. 15.6 и 15.8). Это углубление на поверхности молекулы хорошо просматривается даже на картах КПА с низким разрешением [46]. При высоком разрешении в этой полости видно несколько молекул воды. От атома цинка в сторону, противоположную ей, проходит выемка или канал, в который можно поместить ацилированные трипептиды (разд. 2.4.1). Из общего числа 307 остатков 115 входят в спиральные структуры, 45 — в протяженные р-струк-туры, а оставшиеся 147 — в структуры, которые можно назвать нерегулярными в том смысле, что они отличаются от типичных. В табл. 15.2 приведены типы вторичной структуры, которые наблюдаются при рассмотрении пептидной цепи. Все спиральные участки, за исключением трех сравнительно коротких (остатки 112— 122, 173—187 и 254—262), расположены в левой части молекулы, изображенной на рис. 15.3. Фактически ни один из них нельзя считать находящимся внутри молекулы. Центр КПА и одна из сторон активного центра образованы участком с искаженной Р-структурой, состоящим из восьми сегментов, которые расположены таким образом, что четыре пары цепей параллельны, а три антипараллельны (рис. 15.4). На рис. 15.3 участок с р-структурой расположен перпендикулярно плоскости листа, в результате чего [c.511]

Роль металла в катализе, по всей вероятности, заключается в том, что он в качестве кислоты Льюиса оттягивает электроны от углеродного атома карбонильной группы. Эта точка зрения нашла отражение в разнообразных предполагаемых механизмах действия КПА [128, 129]. Ее прямым подтверждением служит обнаружение связи 2п—О в кристаллическом состоянии. Кроме того, изменение природы металла сказывается прежде всего на величине кат- Тем не менее активности нескольких металло-КПА не укладываются в ряд Ирвинга—Уильямса, в котором кислоты Льюиса располагаются в порядке изменения их силы (Мп< Ре< Со< К1< Си>>2п) [5]. Для пептидных субстратов эффективность металлов изменяется в ряду o>2n=Ni>Mn> u=0, а для эфирных — в ряду d>Mn> o>2n=Ni>Hg> u=0 (табл. 15.5). Выяснение способа, которым белок изменяет естественный ряд каталитической эффективности металлов, необходимо для понимания функциональных свойств этого металлофермента. Нельзя сказать, что сейчас в этой области достигнуты значительные успехи. Особенно большую роль в ферментативном гидролизе могут иметь пространственные и геометрические факторы. Например, выпадение Си-КПА из ряда Ирвинга—Уильямса может быть результатом того, что из-за ограничений, накладываемых ориентацией белковых лигандов и геометрией иона Си +, атом кислорода карбонильной группы субстрата не может занять положение, при котором возможен перенос части заряда на ион металла. Действительно, на картах электронной плотности комплекса Си-КПА и глицилтирозина с низким разрешением [70] не наблюдается участка с положительной плотностью около остатка 01и-270, что предполагает отсут- [c.544]

Структура активного центра образована теми атомами фермента, расстояния которых от природных субстратов не превыщают расстояния, на котором действуют силы Ван-дер-Ваальса. Если учесть все остатки вблизи молекулы глицилтирозина, а также те остатки, близость которых к ацилтрипептиду, находящемуся в выемке поверхности, постулируется из модельных опытов (рис. 15.3), [c.514]

ТО МОЖНО заключить, что в образовании активного центра участвуют следующие сегменты цепи 69—72, 125—127, 142—145, 155, 163, 164, 194—203, 243, 247—256, 268—270 и 275—279. Боковые цепи остатков 70, 126, 143, 195, 197, 200, 202, 249, 252—253 и 275—276 направлены в сторону, противоположную месту присоединения субстрата, и, по-видимому, не контактируют с ним непосредственно. Остатки 194—203 и 268—270 входят в слой с -структурой, который образует одну из стенок участка связывания глицилтирозина. Остальные остатки, за исключением лигандов цинка 69 и 72, находятся в извилистой правой части молекулы, показанной на рис. 15.3. Верхняя часть полости, в которой помещается тирозиль-ная боковая цепь глицилтирозина, образована остатками 243 и 246—250, а остальная ее часть — остатками 155 и 253—256. Левая часть выемки, являющейся участком связывания, образована сегментом 275—279 (рис. 15.3), а правая — сегментами 125—127, 142—145 и 163—164. На рис. 15.6 карта электронной плотности в районе связывания субстрата совмещена с изображениями глицилтирозина и части контактирующих остатков. [c.515]

Фермент-субстратный комплекс глицилтирозина и КПА был изучен кристаллографически при атомном разрешении с помощью разностного фурье-метода [1—3]. Это оказалось возможным благодаря чрезвычайно низкой скорости превращения глицилтирозина. В растворе ккат имеет порядок 1 мин , тогда как в кристаллическом состоянии величина периода полупревращения соизмерима со временем съемки дифракционной картины. В кристаллическом комплексе обнаружен только один тип связывания глицилтирозина с ферментом. Взаимодействия, наблюдаемые в этом комплексе, легли в основу предполагаемого механизма действия КПА (разд. 3.5.1) [2]. [c.518]

Обычно в кристаллографии белков для расчетов по разностному методу Фурье используются коэффициенты ю( Ез — / Е )ехр( гаЕ) . Поскольку вклад, соответствующий структуре нативного фермента, вычитается, то суммирование рядов Фурье позволяет получить изображение различий между структурами Е и Е5. Если некоторые атомы белка смещаются в результате комплексообразования, то на их месте появляются участки с отрицательной электронной плотностью. На предварительных разностных картах комплекса с глицилтирозином при разрешении 2,8 А хорошо наблюдалось расположение атомов тирозильной группы. Однако глицильный остаток субстрата, который на рис. 15.6 и 15.8 находится над атомом цинка, особенно его карбонильная группа, был виден плохо. Причиной этого могло быть то, что при связывании субстрата электронная плотность небелкового происхождения вблизи атома цинка замещалась на эквивалентную ей. Были рассмотрены две возможные ориентации глицильной части субстрата. Более вероятная из них предполагает образование связи между атомом металла и кислородом карбонильной группы [2]. [c.518]

Для того чтобы более надежно определить ориентацию молекулы глицилтирозина, был проведен новый обсчет дифференциальной карты. В общем случае можно ожидать, что карта, рассчитан- [c.518]

Контакты фермента с субстратом, обнаруженные на окончательной карте, представлены на рис. 15.6 и 15.8. Существенные взаимодействия между глицилтирозином и белком можно разбить на пять групп. [c.520]

Образование фермент-субстратного комплекса происходит в результате ряда конформационных изменений в структуре белка. Самые значительные из них затрагивают остатки 248, 270 и 145 и видны из сравнения рис. 15.8, а и б. Гуанидиновая группа остатка Аг -145 перемещается примерно на 2 А в результате поворота вокруг связи Ср—Су. Кислородные атомы карбоксильной группы остатка С1и-270 смещаются примерно на 2 А вдоль оси у вследствие поворотов вокруг связей Сц—Ср и Ср—Су (на рис. 15.8, б карбоксильная группа переворачивается и сдвигается вверх по отношению к наблюдателю). Более других изменяет свое положение остаток Туг-248. Кислородный атом боковой цепи этой аминокислоты сдвигается на 12 А в результате поворота приблизительно на 120° вокруг связи С а—Сри небольшого смещения пептидного скелета. Фенольное кольцо остатка Туг-248 поворачивается по направлению к субстрату, заключая С-концевой участок в полость. В своем новом положении этот остаток близок к расщепляемой пептидной связи. Движение остатков Агд-145 и Туг-248, вероятно, взаимосогласовано посредством нескольких менее значительных перемещений. В свободном ферменте остатки Туг-248 и Аг -145 соединены системой водородных связей, в которой принимают участие остатки 155, 154 и 249. После присоединения глицилтирозина взаимодействия о парах Агд-145—01и-155 и С1п-249—Туг-248 нарушаются и пептидная цепь на участке 247—249 несколько изменяет свое положение. [c.521]

Константа диссоциации комплекса глицилтирозина с КПА при 25 °С равна 1-10-з М (табл. 15.4). Соответствующая ей величина АС составляет —4,1 ккал/моль, что меньше суммы вкладов всех наблюдаемых взаимодействий [57, 58]. Часть энергии связывания предположительно используется для перевода субстрата и (или) фермента в напряженные, т. е. энергетически невыгодные конформации [59—62] (разд. 3.5.1). Таким образом, благоприятные фер-мент-субстратные взаимодействия служат источником энергии для [c.521]

Можно отметить, что моделирование подтверждает и некоторые известные особенности стереоспецифичности КПА [3, 52], если допустить, что молекула субстрата в кинетически важном комплексе расположена так же, как молекула глицилтирозина. Так, если субстраты, замещенные в области С-конца (КБЗ-01у-тиазолидинкар-боновая кислота [68], КБЗ-Gly-Pro [69]), поместить таким образом, что группа R оказывается в полости, С00 — вблизи Arg-145, а С=0 — вблизи атома цинка, то возникают стерические помехи со стороны остатков Пе-247 и Туг-248. Пептиды, оканчивающиеся [c.522]

Отщепляемый остаток З] ориентирован так же, как в случае глицилтирозина (рис. 15.6 и 15.8), но в образовании связи с остатком Туг-248 участвует группа КН пептидной связи, соединяющей 81 и 5г. [c.523]

Рентгеноструктурному анализу при разрешении 6 А были поД вергнуты комплексы фермента с несколькими ингибиторами [70]. В результате не было получено детального описания взаимодействий, возникающих при связывании. Тем не менее совмещение разностных карт с картами белка, построенными при высоком разрешении, дало некоторую положительную информацию. Три ингибитора — -иод-р-фенилпропионат, l-фенилаланин и l-лизил-L-тирозинамид — при pH 7,5 связываются вблизи атома цинка, причем в их поведении существуют интересные различия. Проще всего обстоит дело с ь-фенилаланином. Положительная плотность обнаруживается на разностных картах в том месте полости, которое на разностных картах с низким разрешением соответствует молекуле глицилтирозина. Эта плотность происходит от молекулы L-фенилаланина, причем свободная группа СОО остатка взаимодействует с остатком Arg-145. Кроме того, обнаруживаются участки с положительной и отрицательной плотностью, возникающие [c.523]

Атомы иода Ii и 2 находятся в положениях, при которых возможно взаимодействие между группой С00 ингибитора и атомом цинка. Ряд других данных подтверждает предположение о том, что фенилпропионат присоединен к иону металла [71, 72]. Таким образом, иодфенилпропионат не может служить хорошим аналогом субстрата, глицилтирозина. Несмотря на это, его присоединение, по-видимому, также вызывает изменение конформации в районе остатка Туг-248. Множественность центров связывания фенилпро-пионата не является неожиданной, так как кинетика ингибирования им довольно сложна (разд. 3.2.1). [c.524]

Непродуктивное связывание, проявляющееся в конкурентном ингибировании субстратом, довольно трудно обнаружить с помощью кинетических измерений [81]. Однако сравнение величин К м и Fm в ряду субстратов (Gly)n-Tyr, где п— —6, позволило однозначно установить его существование в случае дипептида. Величина /См для Gly-Tyr в 5 раз меньще, чем для более длинных субстратов, в то время как Ум для него составляет всего 1/1000 соответствующей величины для (Gly)2-Tyr [82]. Аналогичная закономерность при удлинении олигосахаридной цепи субстрата наблюдается для лизоцима. В случае этого фермента о существовании непродуктивного связывания, определяющего величину /См, хорощо известно [83, 84]. Анализ кристаллического комплекса глицилтирозин— КПА показывает, что сравнительно прочное присоединение субстрата, которое, возможно, мешает образованию переходного состояния, объясняется взаимодействием а-аминогруппы глицилтирозина через молекулу воды с остатком Glu-270 (разд. 3.5). Для более длинных субстратов такое взаимодействие невозможно. [c.527]

Хотя остаток Туг-198 и удален от расщепляемой пептидной связи, он может участвовать в вандерваальсовых взаимодействиях с субстратами, большими, чем глицилтирозин (рис. 15.3 и 15.4). Боковые цепи других остатков тирозина, расположенных в районе активного центра, направлены в сторону от участков присоединения субстрата. Таким образом, второй остаток этой аминокислоты, который, судя по результатам модификации, участвует в образовании активного центра, вероятно, является остатком 198. Иодфенилпропионат присоединяется в кристаллах КПА к центру, расположенному вблизи фенольной группы Туг-198 (рис. 15.10). Если фенилпропионат связывается аналогичным образом, то становится понятным влияние этого ингибитора на модификацию. Высокую реакционную способность остатков Туг-198 и Туг-248 можно частично объяснить тем, что они находятся в контакте с окружающим растворителем. Кроме того, рК нитруемого остатка тирозина меньше, чем р/С остальных [112]. [c.538]

Предполагаемый механизм гидролиза пептидов, основную роль в котором играют атом цинка и остатки Glu-270 и Туг-248, основан на предположении о большом сходстве комплекса с глицилтирозином и кинетически важного ферментативного комплекса ES [2, 3]. Рентгеноструктурное исследование показывает, что боковые группы только этих аминокислот белка находятся вблизи атомов пептидной связи. Следовательно, в интересующем диапазоне pH донором протона и нуклеофильным агентом могут быть только остатки Туг-248 и Glu-270. Кроме них, обе эти функции могут выполняться [c.545]

Карбоксипептидаза А, пищеварительный фермент, расщепляющий С-концевой пептид в полипептидах, служит примером фермента, в основе каталитического действия которого лежит совершенно иной механизм. Структура этого фермента и его комплекса с глицилтирозином-аналогом субстрата-раскрыта на уровне атомного разрешения. Связывание глицилтирозина вызывает большие структурные изменения в области активного центра, в результате которых эта область теряет воду и становится гидрофобной. Пример карбоксипептидазы А иллюстрирует ту важную роль, которую играет в катализе индуцированное соответствие формы фермента форме субстрата. Другая примечательная особенность данного фермента состоит в том, что в его активном центре содержится ион цинка, имеющий существенное значение для катализа. Карбонильный атом углерода расщепляемой пептидной связи поляризуется цинком и становится более чувствительным к нуклеофильной атаке. Здесь мы видим пример индукции смещения электронов в субстрате. При катализе карбоксипептидазой А молекула воды, активированная глутаматом-270, непосредственно атакует карбонильную группу расщепляемой пептидной связи одновременно тирозин-248 отдает протон на НН-группу этой связи, и в результате происходит гидролиз. [c.150]

Рис. 7.25. Схематическое изображение связывания глицилтирозина в активном центре карбоксипептидазы А. Показан постулированный каталитически активный комплекс.

Представление о характере связывания субстратов с карбоксипептидазой А возникло на основе данных, полученных при изучении структуры комплекса этого фермента с гли-цилтирозином. Глицилтирозин - медленно гидролизуемый субстрат. Процесс его связывания (рис. 7.25 и 7.26) можно представить в виде пяти последовательных этапов. [c.146]

Отрицательно заряженная концевая карбоксильная группа глицилтирозина вступает в электростатическое взаимодействие с положительно заряженной боковой цепью аргинина-145. [c.146]

Связывание глицилтирозина сопровождается структурной перестройкой активного центра (рис. 7.27). В сущности, только присоединив субстрат, каталитические группы фермента принимают правильную ориентацию-положепт, впервые постулированное Кошландом (КозЫапс ) в его модели индуцированного соответствия. Гуанидиниевая группа аргинина-145, а также карбоксильная группа глутамата-270 перемещаются на 2 А. Связывание карбонильной группы субстрата с ионом цинка вытесняет из связи с цинком молекулу воды. По крайней мере еще четыре молекулы воды вытесняются из неполярного кармана на ферменте при связывании с ними тирозиновой боковой цепи в молекуле субстрата. Самое большое изменение конформации-это перемещение фенольного гидроксила тирозина-248 на 12 А, т. е. на расстояние, составляющее около 1 /4 диаметра молекулы. Такое перемещение осуществляется в первую очередь, путем свободного вращения относительно одинарной связи —С—С— и состоит в том, что гидроксильная группа тирозина-248, [c.148]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология