Элюирование ферментов

Элюирование фермента без стадии промывки [c.27]

Элюирование фермента после нескольких промывок [c.29]

Другим наиболее часто применяемым методом освобождения фермента из его комплекса со связанным лигандом является элюирование фермента раствором конкурентного ингибитора. При этом основное требование состоит в сохранении значения Кь в ходе процесса элюирования. Уравнения (3.1) и (3.2), описывающие равновесие между ферментом и связанным аффинным лигандом, необходимо дополнить [c.30]

Сорбция, промывка и элюирование ферментов с использованием колоночной аффинной хроматографии описываются с помощью уравнений, выведенных для модели одноразовой сорбции и элюирования путем изменения Кь (рис. 3.7). Из рис. 3.7, а хорошо видно, что при /Сь=10 моль/л значительная потеря фермента (61,6%) происходит при промывках. Элюирование при Кь, равных [c.32]

Разновидность количественной аффинной хроматографии — фронтальный анализ [10] он основан на понятии плотности о аффинного лиганда на единицу длины колонки с агарозой. Если / — общая длина колонки с агарозой, а Li — общее количество им мобилизованного лиганда в сорбенте, то о = - г/ - Если аффинный сорбент характеризуется слабым сродством, то раствор фермента в концентрации [ 0] наносится на колонку непрерывно, а для элюирования фермента с колонки необходим объем V. Можно написать следующее уравнение [c.51]

Теоретические основы элюирования ферментов конкурентными ингибиторами уже рассмотрены в гл. 3 (рис. 3.6). [c.92]

Данные, приведенные в табл. 7.2, иллюстрируют влияние концентрации соли на ступенчатое элюирование ферментов метаболизма гликогена с различных метиламин — сефароз, характеризующихся возрастающей гидрофобностью [27]. [c.158]

Адсорбционный метод Данилевского основан на способности ферментов адсорбироваться при определенных условиях на поверхности некоторых мелко измельченных веществ (гидроокись железа, глины, животный уголь и др.). После взбалтывания раствора фермента с надлежащим образом подобранным адсорбентом фермент оказывается адсорбированным на частицах твердого тела и увлекается вместе с этим частицами в осадок при отстаивании, фильтровании или центрифугировании взвеси. Большинство примесей при этом остается в растворе. После этого остается только снять адсорбированный фермент с твердых частиц адсорбента. Так как степень адсорбции зависит от состава и реакции среды, то, изменяя условия, можно вызвать элюирование фермента, т. е. обратный переход его из осадка в жидкость. Выделение фермента из адсорбента может быть произведено, например, путем промывания осадка раствором фосфорнокислого натрия или калия (с определенным значением pH), водным раствором аммиака и др. Обычно эти операции — адсорбцию и последующую элюцию— пов- [c.126]

Характерно, что применение групповых лигандов способствовало лучшему пониманию механизма действия кофакторов, а также влияния солей и сопутствующих белков, определяющих силу биоспецифического взаимодействия и условия адсорбции и элюирования фермента. Таким образом, несмотря на сравнительно низкую специфичность групповых лигандов, путем подбора соответствующих условий можно достичь высокой степени очистки выделяемого фермента. [c.190]

V. Гипотонические растворы. Для элюирования фермента щеточной каемки почек использовали 2 мМ трис-НС1, pH 8[26]. [c.178]

Рис. 4.24. Проведение аффинной элюции. Л. Образец наносят при том же значении pH, при котором проводят элюцию влияние лиганда настолько велико, что величина а уменьшается от >0,95 до очень низкой величины. Б. Образец наносят при рНд, когда а 1,0, затем повышают pH до В, чтобы снизить величину а примерно до 0,9. В результате добавление лиганда оказывает значительное влияние (как показано на рис. 4.23). В. То же, что и на рис. Б, но с подставным> лигандом. На практике подставной лиганд можно использовать, когда начинают промывать колонку буфером с рНв-Заштрихованные пики представляют собой элюированный фермент.

Было высказано предположение, что более эффективное разделение можно осуществить, используя двухколоночный метод [96]. Первая колонка должна содержать краситель, не связывающий нужный фермент. С помощью этой колонки удаляются очень сильно связывающиеся белки, которые в противном случае адсорбировались бы и занимали связывающие участки на второй колонке. Вторая колонка должна содержать краситель, имеющий высокое сродство к нужному ферменту, но относительно низкое к другим белкам. Чтобы найти оптимальные условия, необходимо провести обследование многих окрашенных адсорбентов, измеряя при этом активность фермента и содержание белка в исследуемой смеси до и после ее пропускания через колонку, а также после элюирования фермента подходящим буфером. Этот способ пригоден в тех случаях, когда для выделения необходимого фермента иными методами требуются большие количества адсорбента. [c.171]

Элюирование фермента буфером, содержащим фруктозе-1,6-Рг высаливание сернокислым аммонием. [c.273]

Для более полного объяснения кривых элюирования ферментов растворами высокомолекулярных ингибиторов Туркова и др. [15] определили константы диссоциации комплекса химотрипсина с антилизином по методу Данна и Чейкена [7]. Антилизин — поли- [c.49]

Сравнивая связывание различных дегидрогеназ и киназ па N - (6-аминогексил) -5 -АМР—сефарозе и Р - (6-аминогексил) -Р -(5 -аденозин) пирофосфат—сефарозе, Харвей и др. [9] выразили силу взаимодействия между ферментом и иммобилизованным нуклеотидом с иомоплью так называемой связываемости . Этот параметр представляет собой концентрацию хлорида калия (мМоль/л) в центре пика фермента при элюировании фермента линейным градиентом концентрации КС1 (рис. 4.6 и табл. 4.2). Для определения константы диссоциации комплекса лактатдегидрогеназы с №-(6-аминогексил)-5 -АМР, связанным с сефарозой, Лоу и др. [11] использовали линейную зависимость между количеством связанного фермента и концентрацией иммобилизованного нуклеотида. [c.58]

Связываемость отражает меру силы взаимодействия фермента с иммобилизованным нуклеотидом и соответствует концентрации (ммоль/л) КС1 в центре пика фермента при элюировании фермента линейным градиентом концентрации K 1. На колонку (50X5 мм), содер-жащую 1 г аффинного сорбента, наносили 5 Е фермента. I — 1,5 мкмоль/мл АМР, II — 6,0 мкмоль/мл АМР. [c.60]

Аффинный сорбент А, приготовленный путем привязки ингибитора — л-аминофенил-р- о -тиогалактопиранозы — непосредственно к сефарозе, не связывает и не задерживает фермент в заметной степени. Прикрепление ингибитора через короткую ножку (- 10 А) дает сорбент Б, который очень мало задерживает фермент во время его пропускания через колонку. Для освобождения фермента из комплекса нет необходимости в изменении состава буферного раствора, п фермент выходит из колонки сразу же за неактивным белком. Только когда между ингибитором и поверхностью носителя помещена длинная ножка ( -21 А), образующийся сорбент В способен сильно связывать р-галак-тозидазу из различных бактериальных источников. Элюирование фермента происходит только после замены буферного раствора. Этот сорбент часто приводится в качестве примера очень эффективного специфического сорбента, приготовленного из ингибитора с относительно высокой константой ингибирования (5-10 моль/л) при относительно низкой концентрации аффинанта (0,6 ммоль/л). О Карра и др. [26] приготовили сорбенты, ана- [c.71]

Изменения аффинности и емкости Р -(6-аминогексил)-Р -(5 -аденозин) пирофосфат — сефарозы при разбавлении разными количествами немодифицированной сефарозы на примере взаимодействия с миокиназой хорошо видны в табл. 5.2 [8]. Разбавление аффинным сорбентом ведет к уменьшению связываемости р, выраженной через концсптрацпн хлорида калия, которые необходимы для элюирования фермента. Емкость сорбента, выраженная в единицах активности фермента, сорбированного па 1 мкмоль нуклеотида, возрастает при низких концентрациях нуклеотида, хотя абсолютная емкость на 1 г материала колонки с разбавлением уменьшается. [c.78]

Из сопоставления ВЭТТ можно сделать важные практические выводы, а именно найти аффинный сорбент, характеризующийся не только хорошей связываемостью, но и лучшей избирательностью. Очевидно, таким образом Олсон и др. [28] обнаружили, что необходимо прекратить поток раствора в колонке за несколько часов перед специфическим элюированием. Время уравновешивания не влияет на связываемость лактатдегидрогеназы на иммобилизованном NAD+ или на связываемость глицерокиназы на иммобилизованном АТР, если перед элюированием ферменты в течение 1,5 и 20 ч соответственно оставлять в контакте с иммобилизованными нуклеотидами [19]. Этот факт можно использовать для хранения ферментов, устойчивость которых зависит от присутствия субстратов или кофакторов. [c.83]

Бесконкурентное действие. Если устойчивость тройного комплекса ЕЫ выше, чем двойного Е1, то присутствие свободного ингибитора I уменьшает долю фермента в подвижной фазе и повышает связываемость фермента. Если тройной комплекс ЕЫ менее устойчив, чем двойной ЕЬ, увеличение концентрации свободного аффинного лиганда приведет к элюированию фермента. [c.92]

М -(6-аминогексил)-5 -АМР-сефа-роза, разбавленная незамещенной сефарозой до требуемых концентраций лиганда 2 — Ы -(б-аминогек-сил)-5 -АМР, однородно присоединенный к сефарозе 4В с указанной концентрацией лиганда. Нулевое разбавление эквивалентно концентрации лиганда 1,5 мкмоль 5 -АМР/мл сефарозы. Прочность связывания оценивалась по концентрации КС1 (ммоль/л), необходимого для элюирования фермента. (Воспроизведено с разрешения.) [c.105]

ВИТЬ при использовании линейного градиента ЫАОЙ. Из рис. 8 видно, что концентрация МАОН, требуемая дл5 элюирования фермента, также уменьшается с повышением температуры. При повышенных температурах сродство фермента к иммобилизованному лиганду, как правило, уменьшается. [c.112]

В работе [11] показано, что изменение температуры можно использовать с целью элюирования ферментов с аффинных адсорбентов. На рис. 9 приведены результаты разделения дрожжевой алкогольдегидрогеназы, глицерокиназы, гексокиназы и лактатдегидрогеназы на иммобилизованном 5 -АМР с использованием линейного градиента температуры. Уместно заметить, что глицерокиназа и дрожжевая алкогольдегидрогеназа элюируются в порядке, соответствующем их кажущимся энергиям адсорбции с почти количественным выходом (70—90%), в то время как для элюирования лактатдегидрогеназы даже при [c.117]

Таким образом, изменение температуры в сочетании с другими приемами, такими, как уменьшение концентрации лиганда, пульсирующее введение NADH или использование градиентов ионной силы, можно применять при элюировании жестко связанных ферментов. Кроме того, градиенты температуры могут служить очень чувствительными методами элюирования слабо связанных ферментов. Добавим, что элюированные ферменты, не содержащие десорбирующих агентов (например, солей или незначительных количеств нуклеотида), можно непосредственно использовать при кинетических исследованиях. [c.117]

Ферментный термистор успешно применяют в качестве инструмента специфического контроля в гель-фильтрации, ионообменной и аффинной хроматографии [11]. Поскольку ферментный термистор можно использовать для непрерывного определения активности ферментов непосредственно в неочищенных пробах, с его помощью можно идентифицировать и локализовать отдельные компоненты сложной хроматограммы, например на начальных стадиях процесса очистки фермента (рис. 29.4). Кроме того, в аффинной хроматографии при элюировании ферментам часто сопутствуют их коферменты, сильно поглощающие в УФ-области, что затрудняет непрерывный контроль за содержанием фермента по УФ-спектрам или спектрофотометрически регистрируемым изменениям концентрации NAD(P)H. Таким образом, в аффинной хроматографии калориметрическое определение активности элюированного фермента имеет определенные преимущества. [c.467]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология