Рекомбинантные частоты

Рекомбинантная ДНК проникает в клетки бактерий, характеризующихся низкой частотой трансформации, таким же образом, как плазмидная ДНК из донорской клетки в реципиент-ную в естественных условиях. Некоторые плазмиды обладают способностью создавать межклеточные контакты, через которые они и переходят из одной клетки в другую. Образование контактов между донорной и реципиентной клетками обеспечивается конъюгативными свойствами плазмид, а сам перенос ДНК - мобилизационными. Большинство плазмид, которые используются в работах с рекомбинантными ДНК, не обладают конъюгативными функциями и поэтому не могут переходить в реципиентные клетки путем конъюгации. Однако проникновение в клетку некоторых плазмидных векторов все-таки происходит при наличии в этой клетке второй плазмиды, обладающей конъюгативными свойствами. Таким образом, введя в клетку, несущую мобилизуемый плазмидный вектор, плазмиду с конъюгативными функциями, можно трансформировать клетки-реципиенты, с трудом поддающиеся трансформации другими способами. [c.77]

Рис. 24.10. Генетическое объяснение кроссинговера и появления рекомбинантных генотипов. Подсчитав число особей, у которых выявляется рекомбинация (х) и общее число особей (у), можно вычислить частоту рекомбинаций по формуле

Аллели, определяющие длину крыльев и цвет глаз, показаны вверху в двух женских (X) хромосомах р1. В результате кроссинговера между этими аллелями получаются показанные вверху рекомбинантные генотипы. Из 106 муху 35 (18 + 17) произошли рекомбинации таким образом, частота рекомбинаций равна 35/106, или приблизительно 30%. [c.361]

Во всех трех скрещиваниях появляются оба рекомбинантных типа, причем доля рекомбинантов hr равна доле рекомбинантов h r . Отсюда следует, что комплементарные классы рекомбинантов образуются с одинаковой частотой. [c.288]

Многочисленные опыты по Р1-трансдукции большого числа генов, ранее нанесенных на карту хромосомы Е. соН, на основе данных о рекомбинации при конъюгации показали, что сцепление двух генов на бактериальной хромосоме может быть установлено по относительной частоте их совместной трансдукции. Чем выше эта частота, тем больше сцепление. Это вполне естественно, так как чем ближе расположены два гена, тем больше вероятность того, что они окажутся в одном и том же фрагменте, вырезанном из генома бактерии (и составляющем от него 3%), и попадут, следовательно, в одну и ту же трансдуцирующую частицу. Если, однако, проследить за трансдукцией генетических маркеров, настолько тесно сцепленных, что они почти неизбежно должны попасть в одну и ту же частицу фага, то мы убедимся в том, что все-таки не всегда бактерия-трансдуктант несет одновременно оба таких маркера. Это расщепление по очень тесно сцепленным маркерам, происходящее при трансдукции, несомненно, отражает характер процесса генетической рекомбинации, в результате которого трансдуцированные локусы донорного генома включаются в геном клетки-реципиента. Как видно из фиг. 178, для каждого акта интеграции необходимо два кроссинговера. Отсюда следует, что два тесно сцепленных генетических маркера донора, введенные в клетку-реципиент, могут попасть в один и тот же рекомбинантный геном только в том случае, если ни один из этих двух необходимых перекрестов не произойдет между ними. Вероятность того, что такой кроссинговер не произойдет между двумя маркерами, возрастает с увеличением их сцепления. Следовательно, по частоте совместной трансдукции можно судить о расстоянии, разделяющем два очень тесно сцепленных локуса. Таким образом, изучение совместной трансдукции позволяет выявить тонкую структуру небольших фрагментов бактериальной хромосомы. [c.358]

Можно рассматривать и другие подходы к селекции, дополняющие или заменяющие селекцию при упаковке. Такие подходы могут пригодиться в особых случаях — например, когда отбираемые рекомбинантные молекулы слишком велики, чтобы быть упакованными в Х-частицы, или когда проводят селекцию на высокую частоту рекомбинационных событий. При таких способах селекции может, в частности, использоваться контролируемая внешними условиями репликация одного из двух репликонов (такую возможность дают, например, космидные производные с температурочувствительной областью начала репликации К6К) или специфическая мобилизация плазмидных или космидных последовательностей. [c.80]

Сцепление — это механизм, регулирующий частоту, с которой неаллельные гены, лежащие в одной и той же хромосоме, будут смешиваться с другими такими генами, локализованными в гомологичных хромосомах, происходящих от разных родителей. При полном сцеплении возникают только родительские типы, т. е. не появляется никаких новых комбинаций. Если же сцепление отсутствует, то происходит независимое расхождение генов в мейозе и вероятность сохранения родительских комбинаций очень мала. В тех случаях, когда родительские комбинации очень благоприятны, естественный отбор будет способствовать развитию механизмов, которые усиливают сцепление. И напротив, если изменчивость потомков выгодна популяции, то естественный отбор будет благоприятствовать ослаблению сцепления и повышению числа рекомбинантных типов. К числу механизмов, усиливающих сцеп- [c.109]

Допустим, что при высеве 0,1 мл культуры реципиентного штамма, разведенного в 10 , выросло 170 колоний, а при высеве 0,1 мл неразведенной смеси —68 колоний рекомбинантного штамма. Поскольку каждая колония образовалась в результате размножения только одной бактериальной клетки, то в 0,1 мл засеянной культуры реципиента содержится 170 10 жизнеспособных клеток, а в 1 мл —170 10 , или 1,7 10 . В то же время в 0,1 мл смеси находится 68 рекомбинантных клеток, а в 1 мл — 680, или 6,8 10 . Таким образом, частота трансформации в данном опыте будет равна [c.72]

Как можно быстро обнаружить рекомбинантный бактериофаг Бензер использовал в качестве клеток-хозяев два штамма Е. oli штамм В и штамм К- Бактериофаги с мутантным геном гП образовывали характерные пятна в чашках с бактериями штамма В, но не росли на бактериях штамма К. Для того чтобы определить частоту рекомбинаций между двумя разными г//-мутантами, вирусы добавляли к жид- [c.249]

Трансформация — это процесс введения свободной ДНК в бактериальную клетку. Е. соИ используется в качестве организма-хозяина при работе со многими рекомбинантными ДНК, и чтобы обеспечить проникновение в клетки плазмидной ДНК, их обрабатывают ледяным раствором СаСЦ, а затем вьщерживают при 42 °С в течение 1,5 мин. По-видимому, в результате такой обработки происходит локальное разрушение клеточной стенки. Этот метод дает максимальную частоту трансформации, примерно 10 , т. е. на каждую 1000 клеток приходится одна трансформированная. Эффективность трансформации, которая определяется как число трансформантов на 1 мкг добавленной ДНК, составляет примерно 10 —10. Частота трансформации никогда не бывает 100-процентной, но этот недостаток компенсируется применением схем отбора, позволяющих быстро идентифицировать трансформированные клетки. [c.76]

Вероятность трансляционных ошибок для Е. соИ составляет 2 10 " -2 10 на 1 клетку за генерацию. Однако в условиях нехватки определенных аминоацил-тРНК, что часто случается при суперпродукции чужеродных белков, вероятность включения в белковую молекулу неправильной аминокислоты вместо недостающей сильно увеличивается. Кроме того, точность трансляции еще больше снижается из-за недостатка GTP, который является необходимым компонентом корректирующего аппарата. В одной из работ было показано, что в условиях гиперпродукции фактора роста эпидермиса мыши в клетках Е. oli частота ошибочных включений аминокислот в рекомбинантный белок увеличи- [c.128]

Частоту появления рекомбинантных бакуловирусов удалось повысить с менее чем 1% до 99%. Для этого ДНК A MNPV обрабатывали эндонуклеазой рестрикции, которая расщепляла ДНК в двух специфичных сайтах с высвобождением фрагмента, несущего часть гена, необходимого для осуществления литического цикла. Клетки насекомого трансфицировали этим фрагментом, а затем — транспортным вектором. В результате двойного кроссинговера в некоторых клетках восстанавливался кольцевой геном A MNPV, который содержал клонированный ген и функциональный ген, необходимый для осуществления литического цикла. В результате почти все вирулентные бакуловирусы оказывались рекомбинантными. [c.155]

Большинство работ по созданию живых вирусных вакцин проводились на ВКО, однако в качестве кандидатов на роль векторов для вакцинации рассматриваются и другие вирусы аденовирус, полиовирус и вирус ветряной оспы. Вектор на основе живого аттенуированного полиовируса (его исследования только начинаются) привлекателен тем, что позволяет проводить пероральную вакцинацию. Такие слизистые вакцины (вакцины, компоненты которых связываются с рецепторами, расположенными в легюгх или желудочно-кишеч-ном тракте) пригодны для профилактики самьгх разных заболеваний холеры, брюшного тифа, фиппа, пневмонии, мононуклеоза, бешенства, СПИДа, болезни Лайма. Но до любых клинических испытаний любого на первый взгляд безобидного вируса как системы доставки и экспрессии соответствуюхцего гена необходимо убедиться в том, что он действительно безопасен. Например, повсеместно используемый ВКО вызывает у людей осложнения с частотой примерно 3,0-10 . Поэтому из генома рекомбинантного вируса, который предполагается использовать для вакцинации человека, желательно удалить последовательности, ответственные за вирулентность. [c.242]

Рис. 20.7. Неполное сцепление. В данном примере 20% (т. е. 0,1 + 0,1 = 0,2) потомков имеют генотипы, сформировавщиеся в результате рекомбинации(й) между локусами и в процессе мейоза. Частота рекомбинаций не зависит от генотипов родителей. Родитель, гомозиготный по двум рецессивным признакам, производит только один тип гамет даже в случае рекомбинации. В анализирующем скрещивании рекомбинантные продукты мейоза проявляются у потомков фенотипически.

Ключевым в признании генетически модифицированных микроорганизмов охраноспособными стало судебное решение, касающееся рекомбинантных бактерий, созданных А. Чакрабарти. В 1980 г. Верховный суд США постановил, что на бактерии, полученные в результате генетических манипуляций, может быть выдан патент. Позднее патенты США были выданы на трансгенную мышь с повышенной частотой возникновения злокачественных опухолей и некоторые трансгенные растения. Однако патентование животных, полученных с помощью методов генной инженерии, разрешено не во всех странах. [c.541]

ЭТОТ газон перепечатывали с помощью бархата (гл. VI) на чашку с минимальным селективным агаром, поверхность которого была покрыта плотным слоем ауксотрофных Р -бактерий, неспособных расти на этой среде. Генетический состав F - и F -штаммов был подобран таким образом, чтобы сделать возможным возникновение таких генетических рекомбинантов, которые были бы способны расти на селективном агаре чашки-реплики. Часть редких Hfr-клонов среди F -бактерий исходной чашки, способных образовывать селектируемый рекомбинантный тип, захватывается бархатом и переносится на газон F -бактерий чашки-реплики. В результате на этой чашке возникают рекомбинантные колонии. Местоположение такой рекомбинантной колонии указывает, таким образом, зону на газоне F -бактерий исходной чашки, в которой возникли Hfr-бактерии. Эту зону газона отбирали, высевали на вторую чашку и повторяли один или два раза процедуру отпечатков для селективного обогащения культуры Hfr-клетками. Наконец, отдельные Hfr-колонии обогащенной популяции F -клеток проверяли на плодовитость и среди них находили чистые клоны Hfr-клеток. Изменяя генотип Р -клеток и селективные условия исходной чашки, Вольман и Жакоб выделили из одного и того же родительского Р+-штамма различные Hfr-штаммы, некоторые из которых, подобно HfrH, переносят с высокой частотой участок генома thr-leu, а другие — иные участки генома. Таким образом, было доказано, что плодовитость скрещиваний F Х F действительно определяется небольшим колн-4e TB0M Hfr-6aKTepHn, возникающих спонтанно во время роста F -куль-туры. [c.229]

Путем сравнения частоты рекомбинации с частотой зиготной индукции Жакоб и Вольман смогли оценить эффективность процесса интеграции. Процесс зиготной индукции подробно рассматривается в гл. XV. Здесь же мы лишь скажем, что он служит прямой мерой переноса донорного гена. С помощью этого метода Жакоб и Вольман показали, что если донорный ген перенесен из Hfr-клетки в F"-клетку, то вероятность его интеграции в рекомбинантный геном составляет примерно 0,5, т. е. эффективность полностью соответствует той, которая установлена для интеграции гена при трансформации с помощью ДНК, описанной в гл. VH. [c.241]

По теории Висконти — Дельбрюка доля фагов-потомков, рекомбинантных по двум генетическим маркерам, участвующим в скрещивании, зависит, следовательно, не только от сцепления рассматриваемых мутантных генов, но и от числа актов скрещивания, прошедших в вегетативном фонде к моменту завершения внутриклеточного процесса роста в результате лизиса зараженной бактерии. Следовательно, сцепление генетических локусов нельзя прямо приравнять к частоте рекомбинаций. Поэтому истинное сцепление двух генетических локусов х и у определяется как среднее число перекрестов, происходящих в точках, которые расположены между этими локусами, при каждом скрещивании двух вегетативных фагов, находящихся в фонде. Чем больше расстояние между локусами в хромосоме фага, тем больше среднее число таких перекрестов на одно скрещивание. Однако наблюдаемая рекомбинция генетических признаков произойдет лишь в том случае, если между генами, определяющими эти признаки, возникнет нечетное число перекрестов. При четном числе перекрестов рекомбинации не наблюдается, так как сохраняется приходное расположение двух генов. Следующая схема иллюстрирует отсутствие рекомбинации в случае двух перекрестов [c.292]

Обнаружение лизогенных и нелизогенных штаммов у способного к конъюгации штамма Е. oli К12 дало возможность проводить скрещивания таких бактерий и изучать распределение профага А, у рекомбинантов. Первые скрещивания такого рода были осуществлены в то время, когда природа процесса конъюгации бактерий оставалась еще неясной, а частота появления бактериальных рекомбинантов в условиях опыта составляла примерно 10 на клетку. Тем не менее уже эти скрещивания показали, что профаг, по крайней мере в одном отношении, ведет себя как хромосомный детерминант наследственности, а именно некоторые рекомбинантные бактерии оказались лизогенными, а другие — нелизогенными. Характер распределения профага среди рекомбинантных бактерий указывает, что лизогенность по фагу сцеплена с генами gal, контролирующими сбраживание галактозы. Большинство рекомбинантов получает признаки gal и лизогенность по фагу (X) от одного и того же родителя. Однако в отличие от обычных хромосомных генов профаг X дает асимметричное распределение в реципрокных скрещиваниях между лизогенными и нелизогенными бактериями. Если нелизогенный донор скрещивается с лизогенным реципиентом F , то признак нелизогенности передается от донора к рекомбинантам, но при скрещивании с нелизогенным реципиентом F" признак лизогенности от донора F" " (X) почти никогда не обнаруживается у рекомбинантов. [c.342]

Распределение профага к среди рекомбинантных бактерий носит, однако, совершенно аномальный характер, если лизогенным оказывается родитель Hfr, а нелизогенным — родитель F". В таком случае профаг почти никогда не наследуется рекомбинантами. Кроме того, частота появления рекомбинантов оказывается очень низкой, а те рекомбинанты, которые все же возникают при этом, по своим генетическим свойствам резко отличаются от рекомбинантов, возникающ,их при скрещиваниях Hfr X F"(X) или Hfr(X) X F (X). Жакоб и Вольман показали, что эта аномалия является следствием явления, названного ими зиготной индукцией. Всякий раз, когда в нелизогенную клетку F проникает фрагмент хромосомы лизогенной бактерии-донора Hfr, несущей профаг Я, этот профаг индуцируется, переходит в вегетативное состояние и, размножаясь, дает от 1 до 200 частиц инфекционного фага X, которые в конечном итоге лизируют зиготу и высвобождаются. При таких скрещиваниях большая часть зигот, получивших от Hfr-бактерии фрагмент хромосомы с профагом, погибает. Следовательно, у рекомбинантов могут проявиться только те генетические маркеры донора, которые передаются раньше профага, т. е. располагаются ближе к началу хромосомы. Однако если при таком скрещивании лизогенной оказывается бактерия-реципиент F", то зиготной индукции не происходит, независимо от того, является ли донор Hfr лизогенным или нет. В потомстве, полученном от таких скрещиваний, не наблюдается аномалии в расщеплении родительских признаков. Таким образом, присутствие профага X обусловливает иммунитет реципиента F не только в отношении суперинфекции гомологичным свободным фагом X, но и в отношении вегетативного развития гомологичного внутри-хромосомного профага X, полученного клеткой-реципиентом от бактерии-донора Hfr. [c.343]

Генетики предпочитают изучать сцепление посредством анализирующего скрещивания, т. е. скрещивания с родительской линией, гомозиготной по рецессивным генам (рис. 5.2). При анализирующем скрещивании фенотип потомства прямо отражает типы гамет, формируемые гетерозиготным родителем, как это показано для случаев независимого расщепления и полного сцепления на рис. 5.3. В первом из представленных на рис. 5.3 случаев при независимом расщеплении аллелей двух генов следует ожидать, что в равном отнощении образуются четыре генотипа. Два из них содержат те же сочетания аллелей, что и у родителей (а и аЬ), а два-новые рекомбинантные сочетания аллелей (а Ь и аЬ ). Если в потомстве родительские типы и рекомбинантные типы представлены в равном отнощении, то, значит, гены а и Ь в мейозе гетерозиготного родителя расходятся независимо и могут быть названы несцеп-ленными. Частота рекомбинации между двумя генами определяется как доля обоих рекомбинантных типов в потомстве (в примере, представленном на рис. 5.3, 50/100 = 0,5, или 50%). Если гены находятся в независимо расходящихся разных хромосомах, то частота рекомбинации равна 50%. Обратное, как мы вскоре увидим, вообще говоря, не всегда справедливо. [c.130]

ЭТО изображено на рис. 5.9, три различные последовательности их расположения. Одна пара реципрокных рекомбинантных типов из числа представленных на рис. 5.8, не может возникнуть из исходной последовательности посредством одного кроссинговера в мейозе для ее образования необходимы два кроссинговера в одном мейозе. Другими словами, если три гена линейно упорядочены, то не все возможные рекомбинантные типы могут возникать независимо друг от друга. Как мы уже видели, единичные кроссинговеры происходят между сцепленными генами с частотой, меньшей 1/2. Следовательно, частота рекомбинантных типов, возникающих в результате двух кроссинговеров, должна представлять собой произведение дробей, т.е. быть меньще частоты появления рекомбинантных типов, возникающих в результате одного кроссинговера. Лишь одна из трех возможных последовательностей генов, изображенных на рис. 5.9, согласуется с данными, приведенными на рис. 5.8, а именно у-у -т. Наблюдаемая частота рекомбинаций между у и ш равна 0,007, а между ш и т-0,330. Следовательно, частота возникновения рекомбинантного класса в результате двойного кроссинговера должна примерно составлять 0,007-0,330 = 0,00231. Самый редкий класс рекомбинантов из числа изображенных на рис. 5.8-это тот, который появляется в результате кроссинговера между ш и у-т (частота 9/10495 = = 0,00086) следовательно, именно этот класс-продукт двойного кроссинговера. Стертевант показал, что такой тип отношений характерен для любых трех генов в Х-хромосоме и что только линейная генетиче- [c.136]

Рис. 8.19. Пример использования реципрокных скрещиваний для установления и подтверждения взаимного расположения маркеров в трехфакторном скрещивании при трансдукции. Для определения последовательности генов выявляют относительные частоты двух указанных рекомбинантных генотипов. Участок, на котором произошел кроссинговер, обозначен цветной стрелкой, а наиболее вероятное расположение второго кроссинговера -черной стрелкой. Менее вероятные локализации кроссинговера указаны пунктирными стрелками.

Опыт Г енотип донора Г енотип реципиента Селек- тивные маркеры Рекомбинантные классы неселективных маркеров Последовательность, Возмож- установленная ная после- по относитель-дователь- ным частотам ность неселективных маркеров [c.254]

Анализ частот возникновения рекомбинантных генотипов при трехфакторном скрещивании дает дополнительное (хотя и косвенное) подтверждение тому, что процесс рекомбинации сопровождается образованием гетеродуплексных участков ДНК. Впервые это было отмечено при изучении явления высокой отрицательной интерференции при скрещиваниях с участием очень тесно сцепленных генетических маркеров. Понятие интерференция (I), введенное нами в гл. 5, определяется формулой I = — с, где с коэффициент совпадения (коинциденции), т.е. отношение числа наблюдаемых двойных перекрестов к числу ожидаемых, при трехфакторном скрещивании. В большинстве случаев при скрещиваниях с участием маркеров в трех различных сцепленных генах (х — у — г) оказывается, что образование перекреста между х и у снижает вероятность образования второго перекреста в интервале между у и г. То есть в таких скрещиваниях величина с меньше 1, а / соответственно положительное число, отражающее наблюдаемую величину интерференции (см. гл. 5). [c.139]

Рис. 19.5. Соотношение 13 3, полученное в от скреищваиия двух различных линий кур белого цвета. Полученное расщепление обусловлено взаимодействием между геном окраски С и эпистатическим по отношению к нему геном I. Если бы эти гены были сцеплены, частота родительских аллельных комбинаций была бы выше, чем частота рекомбинантных комбинаций. Соответственно изменилось бы и соотношение фенотипов в Р,.

Появившиеся в последнее время методы позволяют составлять подробные карты очень больших геномов. Есть две категории карт 1. Физические карты, основывающиеся на строении молекул ДНК, составляющих каждую хромосому. Сюда относятся рестрикционные карты и систематизированные библиотеки клонов геномной ДНК. 2. Карты генетического сцепления их строят, основываясь на частоте совместной передачи потомству двух или нескольких признаков - генетических маркеров, различных у отца и матери и приписываемых определенному участку хромосомы. В качестве маркеров издавна принято использовать те гены, экспрессия которых обнаруживается по их эффекту (таковы, в частности, гены, вызывающие генетические болезни, например мышечную дистрофию). Разработанные сравнительно недавно новые методы с применением рекомбинантной ДНК дали возможность использовать в качестве генетических маркеров короткие последовательности ДНК, содержащие один из сайтов рестрикции и различающиеся у отдельных индивидуумов, такие последовательности особенно удобны для генетического картирования, потому что под действием рестрикционной нуклеазы возникают фрагменты, различающиеся по своей длине, и этот полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) легко может быть выявлен блот-анализом по Саузерну с помощью подходящего ДНК-зонда (рис. 5-90). [c.342]

Инкубируйте ночь при 37 °С. Белые колонии содержат клоны-ревертанты, появляюш,иеся с частотой от 0,1—90% среди фоновых голубых колоний, несуш,их рекомбинантные космиды. [c.94]

Смотреть страницы где упоминается термин Рекомбинантные частоты: [c.146] [c.564] [c.300] [c.301] [c.484] [c.243] [c.289] [c.298] [c.305] [c.43] [c.300] [c.301] [c.132] [c.144] [c.170] [c.201] [c.252] [c.253] [c.279] [c.299] [c.15] [c.104]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология