Образование комплексов с олигонуклеотидами

В водных растворах свободные основания, нуклеозиды и нуклеотиды, а также основания, входящие в состав олигонуклеотидов, способны к ассоциации с образованием комплексов, в которых пло- [c.246]

ОБРАЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ С ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ [c.421]

Этот вопрос на самом деле не так прост. Лучше всего было бы использовать олигонуклеотиды определенной длины. Тогда концентрационная зависимость условий образования спирали позволила бы определить число цепей в комплексе. Есть и другая возможность исследовать кинетику релаксации. Измерения зависимости образования комплекса от длины могут помочь отличить параллельные структуры от антипараллельных. В то время как взаимодействие параллельных цепей обязательно должно быть межмолекулярным (исключая протяженные структуры, которые могут образовывать циклы), антипараллельные взаимодействия возможны в одной цепи при ее сворачивании с образованием шпилечной структуры. Для таких внутримолекулярных комплексов концентрационная зависимость при исследованиях кривых плавления и кинетики релаксации будет отсутствовать. [c.497]

РИС. 23.5. Состояния комплекса, учитываемые в различных моделях плавления олигонуклеотидов. А. В модели с выравненными цепями рассматриваются лишь состояния с одной спиральной областью и считается, что сдвиг цепей друг относительно друга невозможен. Модель со сдвигом цепей (модель застежка-молния ) учитывает также и состояния, в которых цепи сдвинуты друг относительно друга (это может происходить в гомополимерах или в периодических последовательностях). Обшая модель рассматривает, кроме того, состояния с несколькими спиральными областями. В модели двух состояний предполагается, что сушествуют лишь спираль из Ы пар оснований с выравненными цепями и состояние без спаривания оснований. Б. Некоторые переходы между состояниями, рассматриваемые в обшей модели, которые поясняют смысл констант равновесия для образования определенных элементов структуры комплекса. [c.316]

В табл. 23.3 приведены данные, касающиеся внутримолекулярного равновесия между одноцепочечной формой олигонуклеотидов и образованными из них шпилечными структурами. Соотношения (23.8) — (23.10), (23.16) и (23.17) были получены для межмолекулярных комплексов, но они справедливы и для внутримолекулярных комплексов. При построении конформационной статистической суммы мы исключили из нее зависимость от концентрации. Поэтому для описания образования шпилек (S Н, где S соответствует одиночной цепи, а Н — структуре со шпилькой) нужно лишь выразить условие равновесия через долю структур со шпилькой А" = (H)/[(S) + (Н)] [c.321]

Как будет видно из дальнейшего изложения, в процессе продолжающейся разработки метода секвенирования ДНК посредством гибридизации предлагались различные варианты модификации олигонуклеотидов как иммобилизованных в матрице, так и образования на их основе за счет стэкинг-взаимодействий некоего гибридизационного комплекса с участием более коротких олигонуклеотидов, как несущих, так и не несущих метку. [c.404]

Pu . 1.40. Примеры образования целевых (fl, в) и непродуктивных (б, г) комплексов. Стрелками отмечено разбиение на олигонуклеотиды [c.61]

Рандедат и Вайман [81] использовали ТСХ на PEI-целлю-лозе для доказательства образования комплексов между дезок-сирибоолигонуклеотидами и полирибонуклеотидами. Нанося образцы первых соединений на пятна полиуридиловой кислоты, помещенной на тонкие слои PEI-целлюлозы, эти авторы добились, что олигонуклеотиды оставались в исходном положении в таких условиях, при которых обычно они перемещаются по слою. [c.134]

Все эти особенности и делают возможным разделение олигонуклеотидов на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой или ДЭЛЭ-сефадексом иоликатионные смолы задерживают анионные вещества в степени, пропорциональной величине их отрицательного заряда. Эта закономерность нарушается из-за стремления нуклеотидов образовывать в растворе более крупные комплексы. Но после того как было обнаружено, что образование комплексов можно предотвратить, добавив в элюирующий буфер мочевину (7 М), метод разделения нуклеотидных фрагментов по величине заряда приобрел большую ценность [5051. [c.99]

Аналогичные исследования иа олигонуклеотидах были выполнены для комплексов с этидием. Следить за образованием комплексов в этом случае можно по изменению флуоресценции и поглощения, а также спектров ЯМР. Результаты исследований методом ЯМР подтверждают, что и в растворе сахара принимают конформации С-3 -эндо (3 -> 5 ) С-2 -эндо, характерные для больщинства кристаллических комплексов с интеркаляцией лигандов. Полученные для растворов данные были неожиданными в одном отнощенин оказалось, что комплексы с UpA UpA, pG pG и UpG СрА значительно стабильнее, чем комплексы с соответствующими изомерами, имеющими обратные последовательности. Тот факт, что в смеси некомплементариых динуклеозидфосфатов практически отсутствуют комплексы с этидием, указывает на необходимость образования в комплексах двойной спирали. Было показано, что этидий предпочтительно связывается с двухцепочечными последовательностями пиримидин(3 -> 5 )пурин. Эта специфичность, однако, не является абсолютной, и полученные данные носят качественный характер Крайне важно тем не менее, что даже такая простая молекула, как этидий, способна узна вать некоторые специфические последовательности нуклеиновых кислот. Не удивитель но, что белки, взаимодействующие с ДНК, обладают несравненно более высокой специ фичностью, связываясь лишь со строго определенными последовательностями ДНК и РНК. Следует отметить, однако, что физическая природа специфичности взаимодействия этидия с нуклеиновыми кислотами еще не вполне ясна. [c.379]

Следующим щагом в развитии методов химического синтеза генов стало создание специализированных компьютерных программ, которые позволят оптимизировать структуру олигонуклеотидов, чтобы свести к минимуму образование комплексов, приводящих к появлению побочных продуктов. Одним из первых примеров использования такой программы для выявления самокомплементарных и повторяющихся последовательностей оснований служит работа по синтезу гена эпидермального фактора роста, предназначенного для экспрессии в клетках Е. oll. Целевой ген, кодирующий 53 аминокислоты, был разбит на 23 олигонуклеотида. На рис. 1.42 приведен фрагмент составленной с помощью ЭВМ схемы последовательной сборки целевой ДНК из 17 промежуточных блоков-интермедиатов, каждый из которых был выделен в индивидуальном состоянии. Несмотря на оче- [c.63]

Следующая стадия, инициация, требует наличия субстратов РНК-полимеразы, нуклеозидтрифосфатов и заключается в образовании первых нескольких звеньев цепи РНК- Первый нуклеотид входит в состав цепи, сохраняя свою трифосфатную группу, а последующие присоединяются к 3 -ОН-группе предыдущего с освобождением пиро юсфата. На стадии инициацни РНК-продукт связан с матрицей и РНК-полн.меразой непрочно и с высокой вероятностью может освобождаться из комплекса. В этом случае РНК-полимераза, не покидая промотора, снова инициирует РНК- Такой синтез ДИ-, три- и более длинных олигонуклеотидов называют абортивной инициацией в противоположность продуктивной (т.е. завершающейся образованием полноценного РНК-продукта) инициации. Когда РНК-продукт достигает критической длины (от 3 до 9 нуклеотидов на разных промоторах), абортивная инициация полностью прекращается, транскрибирующий комплекс стабилизируется и уже не распадается до тех пор, пока синтез. молекулы РНК не будет доведен до конца. Примерно в этот же мо.мент, который считается концом инициации и началом элонгации, ог РНК-полимеразы отделяется а-субъединица. [c.138]

Иммобилизация нуклеиновых кислот и олигонуклеотидов позволяет получить сорбенты, способные селективно связывать определенные нуклеиновые кислоты, обладающие комплементарными последовательностями, или белки, обладающие сродством к нуклеиновым кислотам — к молекуле целиком либо ее части. Например, олиго ((1Т)-сефароза широко используется для извлечения эукариотических мРНК из смеси нуклеиновых кислот, так как они имеют поли(А)хвосты на 3 -конце полинуклеотидной цепи. После образования комплементарных комплексов с иммобилизованным олиго((1Т) и отделения всех других компонентов смеси эти мРНК могут быть легко элюированы после повышения температуры %ыше точки плавления соответствующего дуплекса. [c.247]

Нуклеотидный состав. Температура плавления двухспиральных полинуклеотидов зависит также от их состава. С увеличением содержания пар гуанин цитозин Гщ двухспиральных молекул линейно увеличивается 145,212,343-347 как показано на рис. 4.18 (ср. с данными о стабильности пар оснований, стр. 225). В качестве модели для установления зависимости Гт полинуклеотида от состава оснований можно использовать синтетические олигонуклеотиды. При наличии возможности образования трех водородных связей на пару оснований температура плавления соответствующих двухспиральных полинуклеотидов повышается. Тем не менее число водородных связей на пару оснований само по себе не определяет однозначно Тщ двухспирального полинуклеотида. Так, для двухспирального комплекса поли-2-аминоаденило-вой кислоты с полиуридиловой кислотой Гщ значительно ниже, чем для двухспирального комплекса полицитидиловой кислоты с полигуаниловой кислотой, хотя число водородных связей у них одинаково Этот эффект уже был отмечен при взаимодействии мономерных компонентов нуклеиновых кислот (см. стр. 227). [c.265]

Нуклеиновые кислоты представляют собой полимерные соединения, которые различными способами могут быть расщеплены на люнонуклеотиды. Для удобства полимеры мононуклеотидов будут называться олигонуклеотидами, когда число мономерных единиц в молекуле составляет от 2 до 7 (приблизительно), и полинуклеотидами, когда это число превышает 7 . Как и в случае многих макромолекул, понятие дюлекула становится довольно неопределенным при очень больших молекулярных весах вследствие процессов агрегации и дезагрегации, которые могут происходить с большей или меньшей легкостью. И снова для удобства молекулами следует называть только структуры, образованные целиком ковалентными связями макромолекула — это очень большая одиночная молекула (которая, кроме ковалентных связей, может содержать вторичные внутримолекулярные связи) агрегаты должны быть описаны отдельно и люгут быть определены, когда это известно, как ди-, три- или полимолекулярные, указывая число молекул или тяжей, образующих комплекс. [c.363]

Описан родственный метод, основанный на образовании специфического комплекса с молекулами, имеющими относительно короткие цепи [563]. Этерификацией гидроксильных групп целлюлозы концевыми 5 -фосфатными остатками смеси политимидиловых кислот с небольшой длиной цепи при помощи дициклогексилкарбодиимида было достигнуто ковалентное связывание этих олигонуклеотидов с целлюлозой. При 4° гекса(дезоксиадениловая кислота) удерживалась колонкой и, таким образом, могла быть отделена от гекса(тимидиловой кислоты) олигоадениловая кислота элюировалась при 35°. Этим методом возможно фракционирование транспортных РНК [563]. [c.371]

Влияние длины цепи олигомера на гипохромизм двухцепочечного спирального комплекса полнрибоадениловой (высокомолекулярной) кислоты и олиготимидиловой кислоты с длиной цепи от 2 до 16 нуклеотидов было интерпретировано таким образом, что оно указывало на присутствие свободных концов из 2—4 остатков тимидиловой кислоты [385]. Оказалось, что двухцепочечные структуры совершенно не похожи на трехцепочечные комплексы, содержащие олигонуклеотиды, в том отношении, что последние фактически совершенно жесткие оказалось также, что они отличаются от двухспиральных комплексов, образованных полиуридиловой и олигоадениловой кислотами [386], по-видимому, вследствие более сильного межплоскостного взаимодействия в олигоаденило- [c.636]

Получаемые на опыте скорости и энергии активации для образования спирали (табл. 23.6) в основном не зависят от длины цепи. Напротив, скорость разрушения спиральной структуры очень резко падает с увеличением длины для большинства исследованных систем. Энергия активации для плавления также сильно зависит от длины цепи и составляет 5-6 ккал на каждую пару почти для всех приведенных в табл. 23.6 комплексов. Эта величина лишь немного меньше известной энтальпии разрушения стэкинга пары оснований. Таким образом, можно сделать вывод, что лимитирующим этапом при диссоциации коротких спиральных комплексов является разрушение большей части пар оснований, которое необходимо, по-видимому, для образования быстро релаксируюшего состояния, содержашего лишь зародыш спиральной структуры и играющего важную роль при образовании спирали. В опытах по релаксационной кинетике олигонуклеотидов, как правило, используются концентрации цепей около 10 М. Поэтому, как следует из соотношений (23.556) и (23.566) и табл. 23.6, при комнатной температуре процесс лимитируется диссоциацией цепей. При этом наблюдаемые времена релаксации лежат в интервале от 1 мс до 1 с. [c.340]

Другой тип олигонуклеотидных молекул при осуществлении праймерной прогулки описан в статье Фу и соавт. [Fu et al., 1995]. Ими был применен одно/двуцепочечный праймер, формируемый путем отжига 23-членного и 18-членного олигонуклеотидов, что привело к образованию на одном из его З -концов 5 выступающих нуклеотидов. Авторы цитируемой статьи делают заключение, что предсинтезированная библиотека подобных праймеров будет меньше, чем состоящая из более привычных гексамеров, поскольку все возможные варианты 5 неспаренных нуклеотидов приведут к существованию всего 1024 (4 ) таких олигонуклеотидов. Принцип же использования подобных праймеров заключается в образовании затравочного комплекса для ДНК-полимеразы путем их отжига на одноцепочечном участке фрагмента ДНК, образуемого подходящей рестрикционной эндонуклеазой (например АраШ), и удерживаемых на одноцепочечной матрице ДНК также за счет стэкинг-взаимодействия. [c.284]

Вследствие более значительного перекрывания полинуклеотидов, чем олигонуклеотидов, лигазные комплексы обладают большей стабильностью, что в ряде случаев позволяет получать целевые гены одностадийной ферментативной реакцией. Так, гены пептида III, активирующего рост соединительной ткани (85 АК), и уби-квитина (76 АК) были получены одностадийным лигированием 20 полинуклеотидов длиной от 28 до 32 нуклеотидных звеньев и 8 полинуклеотидов длиной от 50 до 64 нуклеотидных звеньев соответственно. В первом случае успех был обусловлен, кроме всего прочего, применением специальной программы Repeat для поиска непро-д тстивных комплексов. Путем вариации кодонов в последовательности гена пептида III было предотвращено образование неправильных комплексов, в которых возможно взаимодействие 8 и более пар оснований. [c.69]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология