Среды для поддержания культур клеток

HI. Поддержание культуры. Анализ роста клеток в культуре на микроносителях не представляет никакой проблемы. Легко производится отбор проб, определяется число клеток (по подсчету ядер), концентрация глюкозы и исследуется морфология клеток. По мере роста клеток гранулы микроносителя становятся тяжелее, что требует увеличения скорости вращения. После 3 дней культивирования или около того происходит за-кисление культуры и следует сменить среду. Это также оказывается чрезвычайно простой процедурой мешалка отключается, гранулам с клетками дают осесть в течение 5 мин и затем удаляется столько среды, сколько нужно. После этого культура осторожно заполняется свежей средой, нагретой до 37 °С, и перемешивание возобновляется. [c.90]

Тщательное перемешивание культуры необходимо, во-первых, для равномерной доставки питательных веществ к клеткам и, во-вторых, для предотвращения накопления токсичных побочных продуктов метаболизма в каком-нибудь небольшом отсеке биореактора. Эффективное перемешивание относительно легко обеспечить при культивировании в небольших объемах, при крупномасштабном же культивировании поддержание гомогенности культуральной среды становится одной из главных проблем. [c.355]

На рис. 10.1 представлена типичная кривая роста простой гомогенной периодической культуры бактерий. Рост проходит через лаг-фазу, в течение которой число клеток не увеличивается. Затем начинается фаза роста, которая обычно характеризуется экспоненциальным увеличением количества клеток и подчиняется уравнениям (10.1) — (10.4). В конечном счете изменения химического и физического состава среды приводят к переходу культуры в стационарную фазу, в которой увеличения количества клеток не происходит, но клетки еще нуждаются в источниках энергии для поддержания своей жизнедеятельности. Поскольку в периодической культуре питательные вещества ограниченны, наступает фаза отмирания (автолиза), которая часто характеризуется экспоненциальным уменьщением количества жизнеспособных клеток. [c.376]

Флаконы и пробирки для культуры ткани, обеспечивающие поверхность роста 5—200 см , известны любому исследователю, работающему с культурами. Самыми большими стационарными флаконами, обычно используемыми в лаборатории, являются флаконы Ру или их пластиковые одноразовые аналоги. Эти сосуды обладают поверхностью для роста клеток 175—200 см (в зависимости от типа сосуда), требуют для роста клеток 100—150 мл среды объем газовой фазы составляет 750— ЮСО см В этих сосудах можно получать 2ХЮ диплоидных клеток и до 10 гетероплоидных клеток. При необходимости получения, например, 10 ° клеток придется использовать более 100 одинаковых культур, так что все манипуляции с клетками придется воспроизводить не менее 100 раз. Кроме того, для поддержания роста такого количества культур потребуется термостат С рабочим объемом 100 л. Ясно, что настало время, когда для увеличения масштабов получения клеток следует использовать более эффективные культуральные системы. Для получения большого количества клеток, зависимых от субстрата, следует использовать более совершенную технику культивирования это позволит более производительно использовать обслуживающий персонал, а также существенно повысить от- [c.74]

Для получения оптимального количества клеток в культуре необходимо обеспечить клетки максимальной поверхностью для роста, сохраняя при этом минимум объема среды и воздушной фазы. Стационарные культуры обладают только одной поверхностью, к которой могут прикрепляться клетки следовательно, они требуют большого объема среды. Количество среды может быть снижено при помещении культуры на качалку или же чаще при использовании вращающихся цилиндрических сосудов. У вращающихся бутылей почти вся внутренняя поверхность доступна для роста клеток, хотя в каждый момент времени лишь 15—20% поверхности бутыли покрыто средой. При вращении бутыли клетки попеременно оказываются на воздухе или под средой, тогда как в стационарной культуре наблюдаются почти анаэробные условия. Этот метод культивирования позволяет снижать объем среды, но все еще требует значительной воздушной фазы для поддержания достаточного количества кислорода и нужного pH. Увеличение масштаба культуры при использовании вращающихся бутылей требует использования сосудов с минимально возможным диаметром. Поверхность роста может быть увеличена вдвое как за счет удвоения диаметра, так и за счет удвоения длины. Однако в первом случае объем среды и воздушной фазы увеличивается в 4 раза, а во втором случае — только в 2 раза. [c.78]

V. Каждые 3 дня осаждайте клетки центрифугированием (800 об/мин) и суспендируйте в свежей среде до плотности не менее 2,5-10 клеток/мл. В зависимости от степени гибели клеток у вас почти наверняка будет возникать необходимость объединения нескольких культур для поддержания плотности клеток на требуемом уровне. [c.96]

После удаления из готовых пробирочных культур среды, содержащей сыворотку человека, клетки трижды отмывают 5% раствором куриной сыворотки в растворе Хэнкса с антибиотиками. Затем в пробирки вносят по 0,6 мл среды для поддержания жизнеспособности клеток, состоящей из 10 частей смеси куриных сыво- [c.142]

Морфологические тесты [11]. Наиболее представительны изменения, возникаюш,ие у нитчатых водорослей (кладофора, ризоклониум, спирогира, осциллятория). Эти водоросли отличаются длинным ветвящимся талломом и крупными клетками, поэтому нарушения, возникающие у них под влиянием токсичных агентов, хорошо заметны даже визуально. Наиболее доступным объектом является культура кладофоры, которая легко сохраняется в лабораторных условиях. Культуры часто засоряются другими водорослями и водными животными. Однако поддержание культур в относительно чистом виде не вызывает больших трудностей и сводится к регулярному пересеву отдельных клеток или нитей в чистую среду. Культуру кладофоры можно вывести также из зооспор, образующихся в процессе размножения водоросли. [c.31]

Ферментеры, или биореакторы, представляют собой камеры, в которых в жидкой или на твердой среде выращивают микроорганизмы. Процесс, происходящий в ферментере, называется ферментацией. Термин ферментация первоначально применялся только к анаэробным процессам, однако сейчас он используется более щироко и включает все процессы, как аэробные, так и анаэробные. На рис. 12.16 изображен типичный ферментер. Это довольно сложное техническое сооружение, поэтому необходимо потратить некоторое время для изучения его устройства. Не забывайте также о проблемах, возникающих при расщирении масштабов производства, которые бьши перечислены в предыдущем разделе. Содержимое ферментеров во время работы, как правило, тем или иным способом перемещивается. Например, при производстве белка одноклеточных прутина компанией I I перемещивание достигается с помощью воздуха, подаваемого с высокой скоростью со дна сосуда. Продуктом являются либо сами клетки (биомасса), либо какой-то полезный клеточный метаболит. Все операции должны проводиться в стерильных условиях, чтобы избежать загрязнения культуры. Кроме того, необходимо обеспечить возможность поддержания в стерильном состоянии всех вводных и выводных отверстий ферментера. Ферментер и среду стерилизуют перед использованием вместе или раздельно. Исходные культуры организма, который должен использоваться в процессе ферментации, хранят в неактивной форме (например, в замороженном состоянии). Пробу активируют, наращивают в достаточном объеме с использованием асептических методов (наращивание) и затем добавляют в ферментер (инокуляция). В ферментере организм растет и размножается, используя питательную среду. [c.66]

I. Посейте во флаконы Т-75 по 10 клеток каждой линии в общем объеме 8 мл соответствующей ростовой среды. В ряде случаев концентрации клеток могут варьировать для поддержани> обеих клеточных популяций в ходе совместного культивирования. Так, например, при совместном культивировании очень быстро пролиферирующих индикаторных клеток с испытуемыми, размножающимися медленнее, начальное число первых и последних при посеве может быть доведено до соотношения 1 10. С другой стороны, медленно размножающаяся популяция может быть повторно посеяна во флакон со смешанной культурой клеток в случае преимущественного зарастания культуры клетками, делящимися быстрее. [c.137]

Монослойные культуры. Клетки кроветворной и лимфоидной ткани, а также крови помещают в плоскодонные сосуды или в пробирки с покровными стеклами и культивируют в синтетической среде с добавлением сыворотки или без нее. Наблюдения проводят за прикрепившимися клетками, растущими по поверхности дна сосуда. В монослойных культурах могут быть, в частности, изучены пролиферация этих клеток, их движения, фагоцитарная активность и т. д. Как правило, в таких культурах в течение длительного времени (месяцы) наблюдается рост гистиоцитов н фнбробла-стов без поддержания кроветворения. [c.12]

В настоящее время при производстве бактериального концентрата и заквасок, приготовляемых на рснове бактериальной массы, бактериальные клетки наращиваются в периодическом режиме культивирования при поддержании температуры и pH на заданном уровне, в замкнутом объеме питательной среды — в ферментере. Прн этом действующие на клетки многочисленные факторы меняются по ходу развития культуры. Вначале микрооргг/низмы размножаются в условиях избытка питательных веществ, которые во время их интенсивного роста постепенно используются. Одновременно с этим в среде накапливаются продукты обмена. Они тормозят деятельность ферментов, участвующих в синтезе компонентов клеток. В соответствии с непрерывно происходящими в среде изменениями культура сама претерпевает ряд закономерных морфолого-биохимических изменений. Так, клетки, образовавшиеся в начале культивирования, отличаются от клеток, выросших позднее. Это ведет к гетерогенности культуры. Наращивание клеток в условиях непрерывного (проточного) культивирования предусматривает постоянный приток питательной среды и одновременное удаление продуктов жизнедеятельности. В результате этого микроорганизмы приобретают способность к продуктивному незатухающему во времени росту. [c.158]

Из рис 77 МОЖНО сделать вывод, что зона 2 вокруг клетки может не формироваться в случаях образования ее вокруг пузырька и клетки одновременно Тогда и путь перемещения О2 от газового пузырька в клетку сокращается, а его содержание в жидкой фазе (4) не будет коррелировать со скоростью поступления его в клетку для поддержания реакций биологического окисления (в ряде случаев О2 выступает химическим реагентом, обеспечивающим биотрансформацию, например, глюкозы в 5-кетоглюконовую кислоту с помощью уксуснокислых бактерий) Следует иметь в виду, что при избытке растворенного кислорода проявляется его токсическое действие на биообъект Вот почему желателен автоматический контроль за поддержанием оптимальных концентраций О2 в среде для соответствующих культур Теперь известны РО-статы (приборы для поддержания необходимого уровня растворимого О2), обеспечивающие подобный контроль [c.262]

Микрорепродукцией называют размножение, или клонирование, растений с помощью культуры ткани. Приставка микро указывает на то, что в качестве исходного материала обычно используют мелкие объекты — либо отдельные клетки, либо маленькие кусочки ткани. Этот материал выращивают на специальных культуральных средах и поэтому называют культурой ткани. В основе культивирования лежат эксперименты, показавшие, что кусочки ткани, отделенные от растений, можно заставить расти в растворе, содержащем питательные вещества и некоторые растительные гормоны, в частности ауксины и цитокинины. Гормоны необходимы для поддержания непрерывного деления клеток. В настоящее время культуру ткани широко используют для сохранения выведенных сортов растений (рис. 21.11). [c.49]

После извлечения клеток из ткани или организма и помещения их в культуру культуральная среда должна обеспечивать все внешние условия, которые клетки имели in vivo. Только в этом случае возможны выживание клеток, их пролиферация и дифференцировка. Внеклеточная среда должна обладать всем необходимым для выживания и роста, то есть обеспечивать клетки питательными и гормональными факторами, а также факторами стромы. Среди биологических сред, оказавшихся пригодными для культивирования клеток вне организма, наибольшее распространение получила сыворотка. И хотя уже частично выяснены потребности клеток, для удовлетворения которых составляют сложные химически определенные среды, добавление 5—20% сыворотки было и, как правило, все еще остается необходимым для поддержания оптимального роста клеток. Часто по различным причинам бывает необходимо избавиться от неидентифицированных компонентов сыворотки, то есть получить химически вполне определенную среду. Различные подходы к созданию таких сред и возникающие при этом проблемы уже нашли отражение в научной литературе [1-9]. [c.27]

Говоря о факторах, которые могут иметь значение в функционировании гипотерического механизма поддержания разнообразия в популяциях актиномицетов, нам хотелось бы упомянуть простейшие, в той или иной степени доступные для дальнейшего экспериментального анализа. Назовем, прежде всего, возможность метаболического взаимодействия между вариантами. Как отмечал Браун (1968), рост мутанта (имеются в виду мутантные клетки из вторичных колоний — папилл — бактерий) может зависеть от наличия в среде продуктов обмена клеток исходной культуры. В этом случае оказывается затруднительным выделение мутанта в чистую культуру, отделение его от популяции исходных клеток. Так называемая метаболическая комплементация более всего изучена у актиномицетов на примере совместного синтеза различающимися мутантами антибиотиков (Мс ormi k et al., 1960 Sermonti, 1969 Дмитриева и др., 1973). [c.94]

Однако выход биомассы в пересчете на 1 моль АТР довольно широко варьирует для разных бактерий, если рост не лимитируется энергетическим субстратом, а скорость роста культуры значительно ниже максимальной. Источники углерода и энергии могут использоваться не только для роста клеток, но и для образования продукта. Кроме того, энергетические субстраты расходуются на поддержание жизнеспособности клеток. Поскольку клетки могут использовать энергетические субстраты для дыхания в отсутствие роста, энергетические затраты на поддержание жизнеспособности бактерий будут вносить свой вклад в потребление этих субстратов без сопутствующего увеличения биомассы. Эндогенный метаболизм практически не оказывает влияния на расчеты выхода клеток, если скорость роста культуры близка к максимальной и энергетический субстрат является лимитирующим питательным компонентом. Однако потребление энергетических субстратов для поддержания жизнеспособности клеток может значительно возрасти при скоростях роста ниже максимальной или в экстремальных биофизических условиях среды. Поскольку надежные расчеты выхода биомассы требуют осторожного и тщательного контроля условий культивирования, лучше всего их проводить для хемостатных систем. Именно в этих условиях лимитирующий рост субстрат и удельная скорость роста ц, могут регулироваться. [c.433]

Культуры каллюса начинают свой рост из растительной ткани, и такой тип культуры используется для поддержания материала. Культуры каллюса обычно поддерживаются на поверхности твердой агаровой среды. По этой причине различные участки каллюса оказываются в различных условиях окружающей среды поэтому в большинстве случаев для биохимических исследований используются диспергированные клетки каллюса, растущие в суспензии. При возвращении на твердую среду клетки претерпевают определенную последовательность клеточных делений, приводящих к появлению адвентивных эмбрионов (Reinert et al., 1977). [c.17]

Отдельные клетки, небольшие группы или достаточно крупные агрегаты >50 клеток) выращивают во взвешенном состоянии в жидкой среде. Применяют разные аппараты и способы поддержания их в таком состоянии. Начальный момент получения суспензионной, клеточной культуры является событием рандоми-ческим. Зто означает, что только клетки, которые подряду причин способны к перестройке метаболизма и размножению с высоким коэффициентом в данных конкретных условиях суспензионного культивирования, образуют хорошие линии. Важными характеристиками таких линий является высокая степень дезагрегации (5—10 клеток в группе), морфологическая выравненность клеток (небольшие размеры, сферическая или слегка овальная форма, плотная цитоплазма), отсутствие трахеидоподобных элементов. На рис. 5 представлены клетки суспензионной культуры [c.21]

Мешки, изготовленные из фтор-этилен-пропиленового сополимера (ФЭП-Тефлон Ви Роп ), биологически инертны, но характеризуются очень высокой проницаемостью для газов. Мешки размером 5x10 см, заполненные клетками и средой (толщина слоя 2—10 мм), могут быть помещены в термостат. Система обеспечивает достаточное снабжение культуры кислородом (клетки растут внутри мешка и отделены от воздуха мембраной толщиной 25 мкМ), что позволяет получить высокую плотность клеток. Культуру можно помещать на качалку или вращать для поддержания гомогенности среды. Клетки можно снимать обычной трипсинизацией либо механически, путем выворачивания мешка и соскребания клеток. [c.82]

Метод суспензионных культур в его различных модификациях сводится к тому, что при постоянном вращении, встряхивании, помешивании или продувании газовой смеси через среду клетки удерживаются во взвешенном состоянии и не прикрепляются к поверхности культурального сосуда. Для культивирования клеток костного мозга и крови метод суспензионных культур не открыл пока перспектив длительного поддержания дифференцировки in vitro. Нормальная морфология клеток костного мозга сохраняется в культурах недолго (12—24 часа), в последующем наблюдается прекращение кроветворения и прогрессивное созревание гемопоэтических элементов (Lau а. oth., 1967). [c.31]

Для размножения РСВ в культуре клеток можно использо--вать основную минимальную среду Игла (МЕМ), желательно с дополнительными аминокислотами. Лучший выход вируса, как правило, дают активно делящиеся клетки. Можно использовать и другие среды, например среду Лейбовича, для поддержания pH которой не требуется газообразная СОг. Температура размножения РСВ составляет 25—39°С максимальный выход получают при температуре около 37°С. [c.135]

Реовирусы эффективно размножаются в большинстве клеточных линий млекопитающих. Принимая во внимание столь широкий круг хозяев, а также высокую стабильность вирусов, при работе с реовирусами следует соблюдать особую осторожность, чтобы не допустить случайной контаминации культур. Чаще всего для размножения реовирусов используют Ь-клетки мыши достоинство этих клеток состоит в том, что при правильном культивировании их можно легко переводить из монослойной культуры в суспензионную и обратно. Для размножения вирусов удобнее всего поддерживать суспензионную культуру Ь-клеток в стерильных плоскодонных колбах при 37°С. Для культивирования клеток используют модифицированную йокликом основную минимальную среду, содержащую 5% ЭТС высокое содержание фосфатов в этой среде обеспечивает поддержание нужного значения pH без пропускания СОг. Плотность суспензии должна составлять 5-10 —ЫО кл/мл, что достигается при пересеве клеток из каждой колбы в две новые один раз в сутки. Если Ь-клетки поддерживаются в суспензионной культуре в течение длительного времени (более 4— [c.202]

Стабильность структуры плазмиды и ее поддержание в культуре бактериальных клеток, по-видимому, во многом зависит от окружающих условий. Известно, что при росте на богатых питательных средах плазмидосодержащие и бесплазмидные клетки обычно делятся с одинаковой скоростью. В условиях же лимитирования по какому-либо фактору роста у плазмидосодержащих клеток время генерации, как правило, больше, чем у изогенного бесплазмидно-го штамма. Вероятно, это обусловлено тем, что [c.204]

Из изученных плазмид лишь pUBllO и ее гибридные производные характеризуются достаточно высокой стабильностью в клетках бацилл. При культивировании плазмидосодержащих щтаммов на питательных средах без антибиотиков заметная потеря клетками плазмид наблюдается только в постэкспоненциальной и стационарной фазах роста культуры, что обычно мало сказывается на продуктивности штаммов по целевому белку Большое значение для стабильного поддержания гибридных плазмид в клетках бацилл имеет состав питательной среды и условия культивирования. Поэтому при создании технологических процессов на основе штаммов-продуцентов, конструируемых методами генетической инженерии, необходимо уделять пристальное внимание выбору оптимальных условий культивирования. [c.268]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология