Олигонуклеотиды фосфорилирование

Нагревание ДНК с растворами кислот приводит к деградации полинуклеотида с образованием пиримидиновых моно- и олигонуклеотидов, фосфорилированных как по 3 -, так и по 5 -концевым звеньям. [c.572]

Основными продуктами реакции являются пуриновые нуклеозид-3, 5 -дифосфаты и олигонуклеотиды, фосфорилированные по 3 -и 5 -концевым звеньям. От мечено также образование дефосфорилированных по концевым звеньям олигонуклеотидов (см. стр. 576) Кроме того, имеется указание з на неполноту и [c.580]

Лучше всего разработано фосфорилирование нуклеотидов. Для этой цели предложен целый ряд фосфорилирующих агентов — хлорангидридов или ангидридов замещенных фосфорных кислот, причем в ряде случаев последние получают непосредственно в реакционной смеси при действии соответствующих конденсирующих агентов (обзоры — см. 2,73 Наиболее мягкие агенты успешно применяются и для фосфорилирования олигонуклеотидов [c.521]

Из числа щелочных систем все еще применяются смеси С1 и Сз. Первая особенно пригодна для разделения монофосфатов нуклеозидов, а вторая позволяет разделить соединения даже с большим числом фосфатных групп (от динуклеотидов до олигонуклеотидов, высшие фосфорилированные мононуклеотиды), малоподвижные в системе Сь [c.127]

Речь идет о сходстве 5 - и 3 -фосфорилированных олигонуклеотидов. - Прим.ред. [c.283]

Изучение проблем, связанных с синтезом нуклеотидов, олигонуклеотидов, коферментов-нуклеотидов и, в еще большей степени, нуклеиновых кислот и фосфатидов (фосфолипидов), привело к накоплению обширного научного материала значительно обогащающего и химию органических соединений фосфора рядом новых препаративных методов, в том числе наиболее тонких. К таким методам относится фосфорилирование дибензилхлорфосфатом — метод, [c.27]

Панкреатическая рибонуклеаза А (РНКаза А) является небольшим белком (124 а.о.), который обладает активностью эндо-рибонуклеазы, специфически расщепляющей фосфодиэфирные связи, образованные пиримидиновыми нуклеотидами [92]. Продуктами гидролиза являются З -фосфорилированные пиримидиновые мононуклеотиды и олигонуклеотиды, содержащие концевые пиримидин-3 -монофосфаты. Во многих тканях всех млекопитающих обнаружен специфический белковый ингибитор RI (450-460 а.о.), обладающий высоким сродством к РНКазе А [93]. [c.66]

Для отщепления дуплекса от твердого носителя либо разрушают ковалентную связь стартового олигомера с носителем, либо расщепляют его по заранее введенным сайтам рестрикции. Если стартовый олигомер не связан ковалентно с остальной последовательностью (в том случае, когда ближайший к нему олигонуклеотид не был фосфорилирован или между ними была специально оставлена небольшая брешь), препарат ДНК подвергают кратковременному нагреванию, достаточному для отщепления, но не полной денатурации ДНК. Примером использования этой стратегии может служить синтез генов ингибитора трипсина из молозива коровы и /З-эндорфина. [c.69]

Щелочной гидролиз был использован для расщепления ряда различных ДНК с частично удаленными тем или иным способом основаниями, например для расщепления апуриновых ДНК °. С этой целью ануриновые ДНК обрабатывают 0,2—0,3 н. раствором КОН при 100° С в течение 35—60 мин или 0,3—1,0 н. раствором щелочи при 37° С в течение 18—24 чОсновными продуктами реакции, как и при кислотном гидролизе ДНК, являются пиримидиновые нуклеозид-3, 5 -дифосфаты и пиримидиновые олигонуклеотиды, фосфорилированные по 3 - и 5 -концевым звеньям (о других продуктах реакции см. стр. 576). При этом относительное содержание каждого из типов олигонуклеотидов (по длине цепи и нуклеотидному составу) достаточно близко совпадает, если оба метода — гидролиз 0,3 н. щелочью и 0,2 н. серной кислотой при 100° С в течение 35 мин — применяются для расщепления одного и того же препарата ДНК . [c.579]

Далее проводили фосфорилирование всех олигонуклеотидов по 5 -концам радиоактивным фосфором за счет [7- PlATP с помощью Т4-полинуклеотидкпназы. Смесь меченых олигонуклеотидов разделяли электрофорезом в ПААГ, получая лестницу полос, как было описано при рассмотрении электрофореза [Остерман, 1981]. В отличие от методов секвенирования ДНК здесь каждой полоске ( перекладине лестницы ) соответствует фрагмент, укороченный точно на один нуклеотид по сравнению с фрагментом предыдущей полоски. Как и при секвенировании ДНК, меченые гидролизаты наносили в параллельные треки со сдвигом по времени в 4, 8 и И ч, а весь электрофорез проводили в течение 14 ч, с тем чтобы лучше разрешить разные по длине фрагментов участки лестницы . [c.508]

Несмотря на неясность механизма реакции фосфорилирования, легкость использования ДЦК привела к тому, что он был применен для синтеза многих фосфодиэфиров и олигонуклеотидов [50]. Карбодиимиды являются также ценными реагентами для получения внутримолекулярных фосфодиэфиров. Так, рибонуклео-зид-2 (30-фосфаты в разбавленных растворах превращаются в 2, 3 -циклофосфаты, в то время как нуклеозид-5 -фосфаты, например АМР, превращаются в 3 5 -циклофосфаты, например сАМР схемы (38), (39) . [c.162]

Фосфорилирование нуклеозидов. В синтезе олигонуклеотидов разработаны два пути фосфорилнрования нуклеозидов. В одном из них используются стабильные производные фосфорной кислоты, содержащие высокореакционноспособную группировку. В другом такая группировка создается прямо в процессе реакции за счет взаимодействия производного фосфорной кислоты с активирующим реагентом. В обоих случаях фосфорилирование гидроксильных групп сахара проходит в результате нуклеофильного замещения у атома фосфора фосфорилирующего компонента. [c.355]

Рис. 208. Два подхода к получению двухцепочечных по-пинук-пеотидов методами химико-ферментативного синтеза а — использующий для соединения отдельных фрагментов реакцию, катализируемую Т4 ДНК-лигазой й — с применением репаративной достройки частичного дуплекса с помощью ДНК-полиме-разы ( —5 -фосфорилированный олигонуклеотид -алнгонуклестид, не

ДО 10 единиц) едва ли можно отделить от тРНК даже на сефадексе 0-200, если не принять специальных мер предосторожности [75]. Положение еще более осложняется тем, что на разделение очень сильно влияет степень фосфорилирования олигонуклеотидов [80]. В этих условиях нецелесообразно указывать границы эксклюзии (Мцт) нэ отдельных гелях для нуклеотидов или соответственно нуклеиновых кислот. [c.223]

З -О-ацетилдезоксинуклеозид-5 -фосфаты 10, 184 олигонуклеотидов синтез 10, 159 185 сл. [7236] региоселективное фосфорилирование [c.561]

PEI (полиэтиленимин)- целлюлоза. Образуется в результате практически необратимой адсорбции высокомолекулярного растворимого полиэтиленимина на простой ил и слабо фосфорилированной целлюлозе. Активные группы [—С2Н4—NH—] и — 2H4NH2, среднеосновные. Применяют для селективного поглощения полианионов — олигонуклеотидов, нуклеозидов, нуклеиновых оснований, фосфатов сахаров. [c.161]

Экзоциклические аминогруппы в нуклеозидах могут подвергаться и фосфорилированию под действием фосфорилирующих агентов. Образующиеся при этом фосфоамиды не были охарактеризованы, а лишь обнаружены с помощью хроматографических методов. При фосфорилировании в стандартных условиях 2, 3 -0-защищепных производных рибонуклеозидов при действии 2-циан-этилфосфата и дициклогексилкарбодиимида в случае цитидина М-фосфорилированные производные образуются с выходом 45%, в случае аденозина выход составляет 20% и в случае гуанозина 10%. Возможность протекания такой реакции заставляет использовать при синтезе олигонуклеотидов защищенные по аминогруппе производные нуклеозидов и нуклеотидов. В отличие от обычных фосфоамидов продукты К-фосфорилирования нуклеозидов легко расщепляются при действии аммиака. [c.407]

Если олиго- или полинуклеотид фосфорилирован по З -концу, первой стадией является ферментативное дефосфорилирование. Затем следует периодатное окисление, превращающее З -концевой нуклеозидный остаток в 2, 3 -диальдегид XVI, в котором 5 -фосфо-диэфирная связь находится в р-положении к З -альдегидной группе (подробнее о периодатном окислении см. стр. 531). Завершающей стадией является расщепление 5 -фосфоэфирной связи в диальде-гидном производном XVI под действием различных первичных аминов. В результате образуется олиго- или полинуклеотид, укороченный с З -конца на одно нуклеотидное звено. Весь цикл превращений может быть повторен. От продукта превращения бывшего З -концевого нуклеотидного звена XVII при действии кислоты (рН< 3) или щелочи (pH > 11) отщепляют основание, определяемое далее обычными аналитическими методами. Разрешающая способность метода (возможность определять достаточно длинную З -концевую последовательность олигонуклеотида или РНК) зависит от полноты прохождения каждой стадии реакции. Важнейшей из этих стадий является расщепление фосфодиэфирной связи в диальдегиде XVI под действием аминов. Первоначально для этой цели использовали глициновый буфер (pH 10—10,5 37° С, 18 ч) 175,176 Хаким методом была проведена ступенчатая деградация 3 ряда динуклеотидов [c.588]

В то время было известно, что рибонуклеиновые кислоты могут быть гидролизованы щелочью до мононуклеотидов, которые, как тогда считали, были исключительно нуклеозид-3 -фосфатами. Общий план строения нуклеиновых кислот с 2 —З -фосфодиэфирными связями был предложен Левиным и Типсоном [71], причем было сделано допущение, что 2 -связь гораздо менее устойчива, чем З -фос-фоэфирная связь, и обусловливает таким образом образование при щелочном гидролизе исключительно нуклеозид-З -фосфатов. Однако, когда рибонуклеиновую кислоту обработали змеиным ядом (который содержит фосфомоноэстеразу, специфичную для нуклеозид-З -фосфатов), то получили неорганический фосфат и нуклеозиды [72, 73]. Далее, изучение рибонуклеиновой кислоты методом дифракции рентгеновских лучей, проведенное Астбери, позволило предположить, что основной межнуклеотидной связью является скорее 2 —5 или 3 —5, чем 2 —3 [74]. С другой стороны, прямого химического доказательства наличия 5 -фосфатной связи не существовало, и отсутствие 5 -фосфорилированных производных в кислых гидролизатах рибонуклеиновой кислоты, несмотря на их известную стабильность, действительно находилось в явном противоречии с предположением о 2 (или 3 ) — 5 -межнуклеотидной связи. Устойчивость дезоксирибонуклеиновой кислоты (неизбежно 3 —5 -связанной) по отношению к щелочи в противоположность неустойчивости рибонуклеиновой кислоты также указывало, как считали в то время, на различие в типах связи. В противоположность этому при действии панкреатической рибонуклеазы на рибонуклеиновую кислоту получается смесь олигонуклеотидов, устойчивых к перио- [c.372]

Аналогично при полимеризации тимидин-3 -фосфата (который сначала превращается в Р1,Р -дитимидин-3 -пирофосфат) при обработке избытком дициклогексилкарбодиимида в безводном пиридине образуется сложная смесь продуктов [12]. Наряду с гомологическим рядом циклических олигонуклеотидов, образующихся из линейных соединений фосфорилированием 5 -гидроксильной группы, находящейся на одном конце, 3 -фосфатным остатком, находящимся на другом, были получены с еще более низкими выходами линейные тимидинолигонуклеотиды (вплоть до пентапуклеотида), несущие З -фосфатные концевые группы. [c.480]

Эти обозначения позволяют избежать путаницы, неизбежной в тех случаях, когда непосвященные, а иногда и посвященные пытаются описать концевые положения нутслеотидных цепей, основываясь на том, свободен или фосфорилирован концевой гидроксил. Окончательно застраховаться от ошибки удается благодаря общему правилу изображать нуклеотидные цепи с 5-гидроксилсвязанным концом справа и 3-гид-роксилсвязанным концом слева, как показано на примере олигонуклеотида, содержащего пять звеньев (рис.1.5). Для [c.22]

Установлено, что при ионофорезе на ДЭЛЭ-бумаге в растворителе с pH 1,9 все фосфорилированные нуклеотиды движутся быстрее соответствующих нуклеотидов, содерямщих дополнительный нуклеотидный остаток у 5 -конца. Следовательно, разные нродукты, образующиеся нри деградации олигонуклеотида экзонуклеазой, можно разделить в этой системе но нх длине длинные фрагменты дрижутся медленнее коротких. Расстояние на карте между любыми двумя нуклеотидами, отличающимися только па один остаток, будет зависеть от природы этого остатка. Следовательно, это расстояние дает возможность судить о природе разных остатков поэтому довольно часто можно определить полную последовательность остатков в олигонуклеотиде, проводя деградацию только один раз с носледу- [c.65]

Один из общих способов основан на введении фосфатного остатка с помощью различных фосфорилирующих агентов в молекулу защищенного олигонуклеотида, содержащего свободную гидроксильную группу. Первоначально фосфорилирование такого защищенного олигонуклеотида, например динуклеозидмонофосфата, проводилось дибензилхлорфосфатом с промежуточным образованием пирофосфата [c.397]

Известно несколько ферментов, катализирующих последовательное отщепление нуклеотидов от нуклеиновых кислот, начиная с определенного конца. Такие ферменты широко используются при определении последовательности олигонуклеотидов. Кроме того, ферменты эти можно с успехом использовать в тех случаях, когда необходимо осуществить полное расщепление РНК либо на З -нуклеотиды, либо на 5 -фосфорилированные нуклеозиды. Ферментом, атакующим нуклеиновые кислоты с 5 -конца, является экзонуклеаза селезенки, тогда как фосфодиэстераза змеиного яда и полинуклеотидфосфори-лаза атакуют полинуклеотид с З -конца, образуя фХ и ффХ соответственно. Однако все попытки использовать такие ферменты для определения последовательности у столь больших нуклеиновых кислот, как вирусные РНК (подобно тому как аминопептидазы и карбоксипептидазы были использованы для анализа белков), оказались обескураживающими. Следует отметить также, что эти экзо-нуклеазы наиболее активны в отношении немодифициро-ванных и незамещенных концевых групп. Так, экзонуклеаза селезенки не атакует 5 -фосфорилированные концы, [c.101]

ДНаза II (тимус теленка, селезенка) ДНК Одна, две З -Фосфорилированные олигонуклеотиды [c.219]

Как уже отмечалось выше, методология олигонуклеотидного синтеза разработана настолько хорошо, что трудно ожидать какого-либо еще существенного прогресса в этой области. Однако, это относится, главным образом, к синтезу обычных олигонуклеотидов, которые после процедур очистки и ферментативного фосфорилирования от натуральной ДНК отличаются разве что размером. Что касается синтеза модифицированных олигонуклеотидов, то здесь имеется огромный простор для химиков-синтетиков по созданию все новых их вариантов. В то же время особенность синтеза модифицированных олигонуклеотидов заключается не в самом химизме реакций присоединения очередных мономеров в ДНК-синтезаторе, а, главным образом, в использовании соединений различной природы (выбор которых диктуется целым рядом причин и условий) при синтезе исходных фосфорамидитов. [c.61]

Смотреть страницы где упоминается термин Олигонуклеотиды фосфорилирование: [c.572] [c.576] [c.581] [c.272] [c.425] [c.611] [c.170] [c.314] [c.350] [c.353] [c.400] [c.478] [c.500] [c.173] [c.507] [c.72] [c.66] [c.69] [c.219] [c.219]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология