Рибонуклеаза установление структуры

Отправным пунктом в первых опытах по определению структуры фермент-субстратного комплекса, в котором субстрат связан продуктивно, была структура стабильных комплексов между ферментом и ингибитором. Классическим примером такого рода является установление структуры лизоцима (см. конец данной главы). Указанный подход можно реализовать несколькими способами. Например, можно связать определенную часть молекулы субстрата с ферментом и установить структуру остальной части путем построения модели. Другой способ состоит в использовании не способного к ферментативному превращению аналога субстрата, в котором модифицирована реакционноспособная связь. Показательным примером применения подобного подхода может служить связывание рибонуклеазой фосфоната вместо фосфата (гл. 12, разд. В). [c.36]

Таким образом, установленные экспериментально структура активного центра и схема расположения 6 нем аналога субстрата логично объясняют все характерные особенности действия панкреатической рибонуклеазы. [c.203]

Положение остальных аминокислотных остатков устанавливают методом ступенчатого гидролиза. Эта последовательность расположения аминокислотных остатков характеризуется как первичная структура белка, установленная менее, чем для двух десятков различных белков (например, инсулина, рибонуклеазы, папаина, содержа-UWX соответственно 51, 124, 187 аминокислотных остатков). Обнаружена жесткая ограниченность вариаций последовательности расположения аминокислот в белковых молекулах. В различных бел- [c.279]

Установление последовательности расположения аминокислотных остатков в одной или нескольких полипептидных цепях, составляющих молекулу белка, являлось первоначальной целью при исследовании его структуры. Экспериментальное решение этой задачи начинается с определения концевых аминокислот в молекуле белка. Положение остальных аминокислотных остатков устанавливают методом ступенчатого гидролиза. Эта последовательность расположения аминокислотных остатков характеризуется как первичная структура белка, установленная менее чем для двух десятков различных белков (например, инсулина, рибонуклеазы, папаина, содержащих соответственно 51, 124, 187 аминокислотных остатков). Обнаружена жесткая ограниченность вариаций последовательности расположения аминокислот в белковых молекулах. В различных [c.280]

Эти факты показывают, что высшие формы организации белковой молекулы в конечном итоге предопределяются ее первичной структурой. Установление этого сделало реальным воспроизведение путем синтеза природных биологически активных белков. Для этого в настоящее время используется разработанный в начале 60-х годов твердофазный синтез. Первая аминокислота при этом закрепляется на полимерном носителе (специальной полистирольной смоле) и к ней последовательно подшиваются все новые и новые аминокислоты. По окончании синтеза готовая полипептидная цепь снимается с носителя. Использование этого метода позволило синтезировать, например, инсулин и рибонуклеазу, причем оба полученных белка обладали биологической активностью. При синтезе рибонуклеазы необходимо было осуществить более 10 тыс. отдельных операций. [c.390]

В настоящее время ведется интенсивная работа по выяснению структуры ферментов пищеварения, и, по-видимому, в недалеком будущем она будет установлена. Однако нельзя ожидать, что установление первичной структуры, и даже вторичной и третичной структур, сразу разрешит тайну каталитического действия ферментов. Так, строение одной из фосфатаз — рибонуклеазы, гидролизующей рибонуклеиновые кислоты, установлено Муром, Штейном и Анфинсеном. Установленная ими структура приведена на стр. 702. [c.701]

Бычья панкреатическая рибонуклеаза, как было рассмотрено выше (разд. 7.3.1), гидролизует РНК ее аминокислотная последовательность приведена на рис. 9.7. Еще до установления трехмерной структуры фермента, когда была известна только его аминокислотная последовательность, серия интересных исследований позволила получить значительную информацию об активном центре и механизме действия рибонуклеазы. [c.306]

Ферменты имеют значительно больший молекулярный вес (10 ООО и выше) и для них проблема установления структуры является чрезвычайно сложной. Тем не менее Муру, Штайну, Анфинсену и сотр. удалось определить структуру фермента рибонуклеазы (мол. в. 13 683), содержащего 124 аминокислотных остатка. Этот фермент, расщепляющий РНК, содержится в поджелудочной железе он был впервые описан в 1920 г. [86]. Спустя [c.413]

При установлении структуры предполагают, что аминокислоты соединяются друг с другом только за счет а-амино- и -карбоксильных групп и поэтому пептиды, полученные при действии трипсина, должны иметь на С-конце пептида аргинин или лизин, а пептиды, полученные при действии химотрипсина, должны иметь в качестве С-концевой аминокислоты тирозин или фенилаланин. Другие исследователи [131], использовавшие гидролиз дипитрофенилиро-вапной рибонуклеазы трипсином, пришли к аналогичной структуре рибонуклеазы. [c.415]

Рибонуклеаза, еще один глобулярный белок небольшого размера, представляет собой фермент, секретируемый клетками, поджелудочной железы в тонкий кишечник, где он катализирует гидролиз некоторых связей в молекулах рибонуклеиновых кислот, содержащихся в перевариваемых пищевых продуктах. Третичная структура рибонуклеазы, установленная методом рентгеноструктурного анализа (рис. 8-7), характеризуется тем, что в ее полипептидной цепи имеется очень мало а-спиральньк участков, но зато в ней есть достаточно большое число сегментов, находящихся в р-конформации. В этом отношении рибонуклеаза отличается от миоглобина, цитохрома с и ли- [c.194]

Вслед за установлением структуры инсулина и рибонуклеазы были расшифрованы аминокислотные последовательности еще нескольких белков, а именно лизоцима, белка оболочки вируса табачной мозаики, химотрип-синогена, трипсиногена, папаина, миоглобина, гемоглобина, цитохрома с, клупеина и некоторых других. [c.94]

Определение аминокислотной последовательности — задача очень трудоемкая. Однако ее можно было бы значительно облегчить, если бы удалось выработать приемы для фрагментации длинных пептидных цепей на относительно небольшие пептиды, содержащие от 10 до 15 аминокислотных остатков, и на другой ряд более длинных пептидов, с тем чтобы можно было установить места перекрывания небольших пептидов. Такая идеальная возможность редко встречается. Практически проблема решалась несколькими путями. История изучения инсулина, рибонуклеазы и гемоглобина отражает три различных подхода. В первых исследованиях, проведенных на инсулине, изучали частичные кислотные гидролизаты динитрофепилированных пептидов (см. гл. 6), а ферменты были использованы на второй стадии работы для получения более крупных пептидов. Быстрое установление структуры рибонуклеазы оказалось возможным благодаря усовершенствованию анализа аминокислот. Аминокислотный состав пептидов, полученных [c.113]

Рибонуклеаза. — Одна из рибонуклеаз была выделена в кристаллическом виде из бычьей поджелудочной железы Купит-цем (1940). Панкреатическая рибонуклеаза гидролизует рибонуклео-тидные связи, в которых пиримидиновый нуклеозид этерифицирован по З -положению сахара. Этот фермент содержит 124 остатка аминокислот и четыре дисульфидные связи. Установление первичной структуры этого фермента Муром и Штейном (1960) явилось важной вехой в химии белка. Последовательность частично была определена на окисленной рибонуклеазе, которая при энзиматическом расщеплении дает 24 пептида. Их размеры позволяют непосредственно определить последовательность химическими и ферментативными методами. Наконец, ферментативный гидролиз нативного белка, разделение содержащих цистин пептидов, окисление их до цистеиновых пептидов и аминокислотный анализ последних позволили выяснить, каким образом восемь по-луци1стинооых о статков связаны друг с другом (рис. 27, стр. 740). [c.739]

К середине 1940-х годов пептидная теория белков Фишера и Вальд-шмидт-Лейтца была почти повсеместно принята. Встал вопрос о точном знании деталей химического строения, т.е. о конкретном порядке расположения аминокислот в белковых цепях. Впервые такое сложное исследование удалось провести в течение десятилетия (1945-1954 гг.) ф. Сенгеру, определившему аминокислотную последовательность инсулина. Вторым белком была рибонуклеаза А. Полная структура этого фермента расшифрована С. Муром, К. Хирсом и У. Стейном (1960 г.). Вскоре идентификация химичекого строения белков стала производиться с помощью автоматических секвенаторов и приобрела рутинный характер. Однако достижения в решении первой фундаментальной задачи проблемы белка не принесли удовлетворения. Сначала не вызывало сомнений, что химические и физические свойства белков получат свое объяснение, как только станет известно химическое строение их молекул. Однако основанная на опыте всей органической химии и биохимии надежда на то, что установление химического типа и строения молекул окажется достаточным для понимания хотя бы в общих чертах их специфического функционирования, не оправдалась. Тем самым определение структуры из конечной цели исследования превратилось в необходимый для последующего изучения белков начальный этап. Утвердилась мысль, что химическая универсальность и практически необозримое многообразие свойств соединений этого класса при строгой специфичности его отдельных представителей связаны с особенностями пространственных структур белковых молекул. [c.67]

Успехи в установлении строения и частичном синтезе инсулина еще в 50-х гг. вызвали большой интерес ученых к изучению строения других белков. В частности, внимание химиков привлек фермент рибонуклеаза, обладающий в отличие от инсулина одноцепочечной структурой. Американские ученые К. Хирс, У. Стейн и С. Мур, основываясь на опыте Ф. Сенгера и других исследователей, определили в 1960 г. полную формулу рибонуклеазы. При этом эффективным оказался новый метод, так называемый автоматический анализатор аминокислот , незадолго до этого разработанный У. Стейном, С. Муром и Д. Спекманом. [c.263]

Исследования структуры ДНК развивались значительно медленнее, что было обусловлено отсутствием ферментов, специфически расщепляющих полидезоксирибсиуклестидную цепь, подобных рибонуклеазам, которые гидролизуют РНК. Поэтому первые структуры достаточно протяженных участков ДНК были расшифрованы на основе установления последовательностн РНК. [c.308]

Если в 50-60-е годы XX века работы по установлению первичной структуры были пионерскими (инсулин — 51 аминокислота, Ф Сенгер, Нобелевская премия 1958 г, рибонуклеаза— 124 аминокислоты, С Мур, У Стейн, К Анфин-сен. Нобелевская премия 1972 г, химотрипсин — 241 аминокислота, Б Хартли, 1964 г, цитоплазматическая амино-трансфераза — 412 аминокислот, Ю Овчинников, А Бра-унштейн и др, 1973 г ), то в настоящее время это рутинные работы [c.881]

Разработанные в последние годы методы селективного гидролиза, разделения и идентификации открыли новые возможности для химического изучения структуры полипептидов и белков. Как уже указывалось, эти природные продукты включают разнообразный материал антибиотики, гормоны, токсины, ферйенты,. вирусы, волокна и т. д. Хотя за короткий период времени был достигнут большой прогресс в выяснении структуры различных природных продуктов, работа по установлению химической структуры белков в значительной степени осложнена их макромолеку-лярной природой. Изучение последовательности аминокислот в полипептидах и белках показывает наличие в них своеобразных группировок аминокислот. Например, из семи основных аминокислот, имеющихся в АКТГ, четыре расположены по соседству, а все семь включены в последовательность из 14 аминокислот из семи кислых аминокислот, ирисутствуюпщх в этом гормоне, три находятся по соседству друг с другом. В рибонуклеазе три остатка серина и три остатка аланина находятся рядом аналогична располагаются три ароматические аминокислоты в инсулине. Для ряда ферментов — тромбина, трипсина, химотрипсина и фосфоглюкомутазы было отмечено наличие одинаковой последовательности из шести аминокислот. Отмечено, что в структуре-и механизме действия протеолитических ферментов важную роль играют определенные трипептиды [160]. В настоящее время из-за ограниченности наших знаний относительно точного молекулярного механизма действия гормонов и ферментов можно делать только предположения о значении тёх или иных аминокислотных группировок. Вопрос о связи определенной последовательности аминокислот с функциями различных соединений может быть выяснен лишь по мере накопления экспериментального материала. Тем самым, по-видимому, станет возможным значительно более полное понимание механизма действия природных соединений на молекулярном уровне. [c.418]

В настоящее время в ряде лабораторий проводится рентгено-структурпый анализ многих белков. Инсулин, рибонуклеаза, лизоцим и цитохром С являются ближайшими объектами. Методы снятия рентгенограмм, фотометрпрования пятен и методы вычислений поддаются в значительной степени механизации и автоматизации. Можно полагать, что в ближайшие годы рентгеноструктурный анализ даст нам точное знание первичной, вторичной и третичной структуры десятков белков. Тогда эта проблема перейдет в область решенных, т. е. станет проблемой вчерашнего дня. Даже сейчас, когда только что на примерах миоглобина и гемоглобина выработан подробный путь — алгорифм измерений и расчетов — п показан их конечный итог, мы уже можем считать все три уровня строения белка в главных чертах установленными. [c.110]

В последнее время проблема установления первичной структуры ферментов и других белков развивается весьма успешно. Доступность данных о первичной структуре белков послужила стимулом для попыток синтеза фрагментов некоторых ферментов. В частности, особое внимание исследователей было обращено в связи с этим на рибонуклеазу поджелудочной железы быка (рис. 73а). Так, Ричардс и Витаятиль [1811] установили, что при действии на рибонуклеазу бактериальной протеазы суб-тилизина происходит разрыв пептидной связи лишь между остатками Ala и Ser при этом отщепившийся N-концевой эйкозапептид (S-пептид) остается связанным с основной частью фермента (S-белком) при помощи нековалентных связей. После разделения S-пептида и S-белка каждый из них оказался биологически неактивным однако при смешивании S-пептида и S-белка в молярном соотношении 1 1 ферментативная активность полностью восстанавливается (рибонуклеаза S ). [c.353]

Другая серия работ, проводимых в лаборатории Д. Г. Кнорре (С. К. Василенко и др.), направлена на установление первичной структуры олигонуклеотидов и т-РНК. Основу этих исследований составляет остроумное использование фосфодиэстеразы змеиного яда. Олигонуклеотиды тина Pup(Pup)nPyp, образующиеся при гидролизе РНК панкреатической рибонуклеазой, после снятия З -концевой фосфатной группы подвергали неполному перевариванию фосфодиэстеразой. При этом образуется набор олигонуклеотидов разной длины, причем конце вой нуклеотид в смеси находится в виде нуклеозида. Полученные фрагменты отличаются по величине и могут быть разделены ионообменной хроматографией. Сравнение спектров олигонуклеотидов, содержащих т я (т + 1) нуклеотидов, позволяет определять т + 1)-й нуклеотид. Таким образом, сравнивая попарно олигонуклеотиды, можно определить последовательность в исходном олигонуклеотиде. Работа выполнена совместно с Институтом химии природных соедипений АН СССР. [c.522]

Для исследовапия нуклеотидных последовательностей акцепторного конца т-РНК в лаборатории Д. Г. Кнорре был применен кинетический подход. Подвергая т-РНК неполному перевариванию фосфодиэстеразой змеиного яда до различной глубины и изучая кинетику накопления мононуклеотидов, можно установить последовательность 8—ill концевых нуклеотидов. Для установления полной структуры молекулы т-РНК в этой же лаборатории С. К. Василенко был предложен очень интересный и перспективный метод. Для индивидуальной т-РНК составляется карта олигонуклеотидов, образующихся при полном ферментативном гидролизе таких т-РНК или панкреатической рибонуклеазой или гуанилрибопуклеазой. Затем та же РНК подвергается ферментативному расщеплению фосфодиэстеразой на различную глубину (от 10 до 80%). Для каждой фракции переваренной РНК составляется аналогичная олигонуклеотидная карта . Исчезновение определенных олигонуклеотидов в исходной карте делает возможным установить местоположение этих олигонуклеотидов в иолинуклеотидной цепи исходной молекулы т-РНК. [c.522]

Достижения в области изучения первичной структуры нуклеиновых кислот непосредственно связаны с развитием методов фракционирования олигонуклеотидов. Ускорению этих исследований способствовало наличие очищенных препаратов РНК и рибонуклеаз, специфически расщепляющих одноцепочечную молекулу РНК. К настоящему времени установлена полная нуклеотидная последовательность многих РНК, в том числе многочисленных тРНК, 5S- и 5,8S-PHK, информационных и рибосомальных РНК. Работы по определению первичной структуры ДНК начались несколько позднее, однако благодаря использованию электрофоретических методов, позволяющих быстро анализировать смеси, они вскоре достигли того же уровня, что и исследования РНК. Стратегия установления первичной структуры нуклеиновых кислот описана во многих превосходных обзорах [5, 121—123]. В настоящем разделе особое внимание уделено методам электрофореза на бумаге и в геле, используемым для разделения рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов. [c.188]

Денатурация белка в классическом смысле определялась как любая непротеолитическая модификация уникальной структуры нативного белка, приводящая к определенным изменениям химических, физических и биологических свойств [388]. Из этого определения исключаются изменения состояния ионизации, если только они не сопровождаются конформационными переходами. Денатурация может происходить в результате нагревания, изменения pH и добавления неполярных растворителей или некоторых специфических денатурирующих реагентов, например мочевины или солей гуанидина. Она также может быть вызвана восстановительным или окислительным разрывом дисульфидных связей, которые стабилизуют нативные конформации некоторых белков. Денатурация, как правило, сопровождается уменьшением растворимости белка. Это можно легко понять, так как гидрофобное взаимодействие, стабилизующее нативную конформацию, приводит к межмолекулярной агрегации, если полипептидные цепи принимают вытянутые конформации. Другим характерным последствием денатурации является раскрытие реакционноспособных групп, которые расположены внутри третичной структуры и становятся доступны воздействию реагентов при разрушении этой структуры. К числу наиболее пригодных методов наблюдения за процессами денатурации принадлежат спектроскопические измерения, измерения оптической активности и определение каталитической активности ферментов или биологической активности гормонов. Конформационные переходы при денатурации включают ряд процессов, которые в различной степени могут сказываться на каждом из наблюдаемых изменений, и поэтому понятие степени денатурации бессмысленно, если не будет установлен критерий, с помощью которого денатурация измеряется. Эта точка зрения иллюстрируется рис. 44, на котором изображено изменение оптической активности, поглощения света и ферментативной активности рибонуклеазы [389]. [c.136]

Химический механизм действия рибонуклеазы в том виде, в каком его себе сейчас представляют, был построен из общих соображений еще до установления кристаллической структуры фермента [170]. Известно, что график зависимости активности фермента от pH представляет собой колоколообразную кривую с максимумом при pH 7. рН-зависимостьйса1/ м показывает, что скорость гидролиза зависит от состояния ионизации в свободном ферменте основания с р/(а = 5,22 и кислоты с р/(а = 6,78, в то время как из рН-зависимости ft at следует, что в фермент-субстратном комплексе эти значения р/Са изменяются до 6,3 и 8,1. Было высказано предположение, что реакция катализируется по механизму общего кислотно-основного катализа с участием двух остатков гистидина, как выяснилось позднее,— His-12 и His-119 [c.389]