Ультрацентрифугирование белков

Правило фаз и фазовые диаграммы были с успехом использованы при изучении растворимости белков. Кривые растворимости оказались особенно полезными при определении чистоты белковых препаратов. Среди различных используемых в белковой химии физических критериев чистоты, включающих гомогенность при ультрацентрифугировании или при электрофорезе, критерий постоянства растворимости белка остается основным надежным показателем, если только белок не полимеризовался и не образовал прочных комплексов с другими компонентами смеси. На растворимость белка в данном растворителе влияют многие факторы наиболее важными из них являются ионная сила, температура и pH. [c.161]

Разделение липопротеидов плазмы с помощью ультрацентрифугирования основано на существенном различии в плотности липидов и белков (соответственно 0,88—1,06 и 1,30—1,35). Различные классы липопротеидов плазмы, имеющие разное соотношение липид белок, характеризуются определенными значениями плотностей. Один из вариантов этого метода включает измерение скорости флотации (в единицах Сведберга, 5г) липопротеидов в водной среде данной однородной плотности. Величина 5 зависит от плотности, размера и формы молекулы липопротеида. Липопротеиды наиболее низкой плотности (низкое отношение белок липид) имеют наибольшее значение Другой вариант основан на центрифугировании по градиенту плотности. С этой целью плотность плазмы ступенчато повышают добавлением растворов веществ, не влияющих на ее свойства, в результате чего липопротеиды в процессе ультрацентрифугирования концентрируются в виде полос в тех местах раствора, где его плотность соответствует плотности липопротеида. [c.369]

Определение гомогенности выделенного белка кристаллизация (у чистого белка кристаллы одного типа) кривые растворимости (у чистого белка один перелом кривой растворимости) аналитическое ультрацентрифугирование (чистый белок дает один узкий пик) электрофорез в ПААГ, изоэлектрофокусирование (чистый белок дает одну полосу) иммунохимический (чистый белок дает одну полосу преципитации со смесью антител). [c.52]

Для определения чистоты (или гомогенности) ферментных препаратов в настоящее время наиболее широко используются ультрацентрифугирование и диск-электрофорез. В основе первого из них лежит различная скорость седиментации в ультрацентрифуге белков с различной молекулярной массой (и различной формой молекул). Одним из ограничений данного метода является то, что разные белки могут иметь одну и ту же величину седиментации и не разделяться при ультрацентрифугировании. С другой стороны, белок в растворе может находиться в виде нескольких форм, различающихся по степени агрегации, а следовательно, и по молекулярной массе. Если эти формы не превращаются одна в другую или превращения осуществляются достаточно медленно, на седиментограмме обнаружится несколько пиков, что, однако, не будет свидетельствовать о наличии примесных белков в исследуемом препарате фермента. Недостатком метода является также его невысокая чувствительность, что не позволяет обнаруживать малые количества примесных белков. [c.205]

На заключительном этапе выделения и очистки белков исследователя всегда интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому-либо физико-химическому показателю. Для этого пользуются разными критериями. Из огромного числа хроматографических, электрофоретических, химических, радио- и иммунохимических, биологических и гравитационных методов наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или хлорида цезия, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фоьсусирование, иммунохимические методы и определение растворимости белка. Действительно, если при гель-электрофорезе белок движется в ввде одной узкой полосы и в этой зоне сосредоточена его биологическая активность (ферментативная, гормональная, токсическая [c.32]

Все это показывает, как широко используется ультрацентрифугирование при изучении нуклеиновых кислот и биосинтеза белка. Ультрацентрифугирование незаменимо также при все более расширяющемся изучении смежных проблем — в частности при изучении механизмов регуляции ферментативных реакций. Метаболические потребности клетки удовлетворяются, как известно, благодаря тонкой согласованности скоростей различных биохимических последовательностей. Такая согласованность возможна благодаря чувствительности аллостерических ферментов к изменениям концентраций отдельных метаболитов, что в свою очередь зависит от конформационных изменений, вызываемых соответствующим метаболитом и, очевидно, передающихся путем взаимодействия субъединиц ферментного белка. Успехи, достигнутые в изучении свойств аллостериче-ского фермента — аспартат-карбамоилтрансферазы, хорошо иллюстрируют большое значение ультрацентрифугирования — особенно когда оно используется в сочетании с другими методами анализа. Так, Герхарт и Шахман [5] показали, что этот фермент, представляющий собой глобулярный белок с молекулярной массой около 3-10 , после обработки соединениями ртути распадается на субъединицы двух типов. Каталитической активностью обладают лишь субъединицы одного типа, в субъединицах же другого типа, не обладающих каталитической активностью, находится центр по которому происходит присоединение цитидинтрифосфата. С этой регуляторной субъединицей связывается 5-бромцитидин-трифосфат, о чем свидетельствует соответствующая картина седиментации. Позже Вебер [6] определил аминокислотный состав и Ы-концевые остатки субъединиц обоих типов и установил, что одна молекула фермента содержит четыре регуляторных и четыре каталитических субъединицы. [c.9]

Образно говоря, белки являются липкими и стремятся связаться друг с другом. Силы, обеспечивающие эту липкость , имеют различную природу. Это ионные связи, вандерваальсовы взаимодействия, водородные связи и т. д. Такое поведение белков может очень сильно влиять на их седиментационные свойства. Наиболее важен в связи с этим кинетический подход. Если скорость взаимодействия между компонентами невелика, то при ультрацентрифугировании можно наблюдать одновременно каждый компонент. Если же равновесие между компонентами смеси устанавливается быстро по сравнению с временем центрифугирования, то могут образовываться седиментирующие формы с промежуточными свойствами. Рассмотрим, например, чистый белок. При электрофорезе он ведет себя как один компонент, несмотря на наличие большого количества его ионных форм, очень быстро переходящих друг в друга. Кенн и Гоуд [9], однако, описали условия, в которых чистый белок не обязательно дает одну зону. [c.156]

Касасса и Эйзенберг [13] показали, что если в уравнения, описывающие равновесное ультрацентрифугирование, вместо величины (1—ир) подставить производную др дс, то они дают истинные значения молекулярной массы для негидратированных молекул. Величину др дс следует определять экспериментально, сравнивая раствор белка с растворителем, против которого этот белок был тщательно отдиализован. [c.220]

ЗЕИН — белок группы проламинов, содержится в зернах кукурузы (3—7%). 3. нерастворим в воде и водных солевых р-рах, хорошо растворим в спирте. Нри электрофорезе и ультрацентрифугировании 3. ра.зделяется на несколько фракций. Иэоэлектриче-ская, точка 3. находится при pH 6,2, коэфф. седиментации 1,9 S (единиц Сведоерга), мол, в. ок. 50 000. Ориентировочный химич, состав гидролизатов 3. (в %) общий азот 16,2 аммиак 3,0 аланин 11,5 серин 7,8 треонин 3,0 валин 3,0 лейцин 24,0 изо- [c.52]

Кристаллический гуанидированный альбумин сыворотки крови человека, по данным ультрацентрифугирования, является столь же гомогенным, как и исходный неизмененный белок оба они содержат приблизительно по 5% несколько быстрее оседающего компонента. Ни один из препаратов не обнаруживал заметных изменений в скорости перемещения границы. Таким образом, гуанидированный сывороточный альбумин представляет собой, повидимому, наиболее гомогенное из до сих пор полученных производных белка, за исключением, быть может, некоторых производных пепсина во всяком случае, это соединение было подвергнуто наиболее строгим испытаниям на гомогенность. Сывороточный альбумин, этерифицирован-ный производными ди-азоуксусной кислоты, также не обнаруживает никаких изменений в величине и форме мо- [c.342]

Полоновский и Джейл [140] установили, что в сыворотке крови присутствует компонент, который специфично связывает гемоглобин. Эти исследования были продолжены Джейлом и др. [141], которые с помощью электрофореза на бумаге нашли, что белок, связывающий гемоглобин, мигрирует как аг-глобулин. Белок, связывающий гемоглобин,— гаптоглобин — был выделен Джейлом и Буссье [142] его молекулярный вес, рассчитанный по данным ультрацентрифугирования, равен 85 ООО [143, 144]. [c.252]

Можно ли считать препарат чистым Является ли он гомогенным по составу Например, содержит ли образец полимерные молекулы лишь одной молекулярной массы На этот вопрос часто можно ответить с помощью измерения размеров молекул, используя такие методы, как ультрацентрифугирование, электрофорез и хроматографию (которые будут подробно описаны в гл. Пи 12). Те же методы могут быть использованы и для выделения одного компонента из смеси макромолекул. При более детальном изучении гомогенности можно использовать также химический анализ, часто с применением спектроскопических измерений. Например, нередко возш1кают вопросы, не содержит ли препарат белка примеси нуклеиновых кислот, нет ли в нем ковалентно связанных с ним сахаров (и если есть, то сколько), состоит ли белок из одной непрерывной полипептидной цепи (и если это так, то какова ее длина). Отметим, что далеко не всегда стоит задавать вопрос об отсутствии загрязнения белка или нуклеиновой кислоты малыми молекулами, так как последние неизбежно присутствуют в препаратах. Большинство биополимеров — полиэлектролиты и поэтому находятся в окружении противоионов. Иногда бывает важно тщательно проконтролировать тип противоионов, которые присутствуют в образце. Очень часто для нормального функционирования макромолекулы бывает необходимо присутствие или отсутствие тех или иных малых молекул. [c.22]

Для ЭТОГО предложено почти полтора десятка методов. Белок признают гомогенным, если увеличение его количества в твердой фазе не сопровождается возрастанием содержания белка в растворе (рис. 14). Наличие одной белковой полосы при электрофорезе в полиакрила-мдцном геле, одного пика на выходной кривой (либо одной белковой зоны на пластинке) при хроматографировании или гельфильтрации, резкой границы пограничного слоя белок—растворитель при ультрацентрифугировании белка являются наиболее надежными показателями гомогенности белкового препарата. В большинстве случаев гомогенны кристаллические белки. Если кривая распределения белковых частиц по высоте при использовании метода свободной диффузии подчиняется теоретической кривой распределения Гаусса, белок гомогенен. Достижение в процессе очистки белка стабильного содержания свободных Н8-групп или содержания радиоактивной метки (при работе с меченым белком), равно как и постоянного уровня биологической (ф мен-тативной, гормональной и т. п.) активности, свидетельствует в пользу гомогенности белка. Выявление единственной N-кoнцeвoй и единственной С-кон-цевой аминокислоты при анализе белкового препарата также является признаком гомогенности выделенного белка. [c.34]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология