Метод равновесного диализа

В наших работах для определения растворимости жидких углеводородов в растворах белков применяли методы равновесного диализа, спектрофотометрический, рефрактометрический, весовой. [c.21]

Недостаток метода равновесного диализа состоит в том, что диффузионное равновесие через мембрану устанавливается в течение нескольких часов, хотя в большинстве случаев действительное химическое равновесие для реакции связывания достигается за доли секунды. Этот недостаток преодолевается использованием быстрого способа определения скорости отщепления радиоактивного лиганда при диализе от равновесной системы [103] фермент — лиганд. В таком случае даже при работе с неустойчивыми веществами быстро получают точные результаты. [c.408]

Для определения положения равновесия между свободными антителом и антигеном и их комплексом или между антителом и гаптеном и их комплексом использовали различные методы. Среди них — метод равновесного диализа (I), прямой анализ преципитатов и надосадочной жидкости (II), электрофорез и ультрацентрифугирование (III) и метод рассеяния света (IV). Эти эксперименты подробно описаны в цитированных работах. Здесь мы можем только сказать, что все это методы определения или расчета концентраций свободных антител, свободных антигенов, свободных гаптенов и их комплексов в состоянии равновесия. На основе таких измерений можно вычислить константу равновесия К и AF°. Если эти измерения произвести при нескольких значениях температур, можно определить также величины ДЯ° и А5°. [c.166]

Кон определил молекулярный вес единицы ферментного белка, содержаш его 1 активный центр, с помощью метода равновесного диализа ингибиторов ферментативного катализа, т. е. измерения количества белка, связывающего 1 моль ингибитора. Найденная им цифра молекулярного веса — 135 ООО. На самом же деле очищенный белок представляет собой гексамер этой элементарной единицы, т. е. имеет молекулярный вес 810 ООО. [c.486]

Обширное исследование связывания субстратов и т.п. с креатинкиназой и аденилаткиназой выполнили Куби и сотр. [45]. Методами равновесного диализа и ультрацентрифугирования были получены доказательства слабого связывания М + и относительно сильного связывания свободного нуклеотида и его комплекса с металлом. [c.669]

Эффект Доннана необходимо принимать во внимание во всех случаях, когда связывание ионов макромолекулами исследуется методом равновесного диализа через полупроницаемую мембрану, иначе доля связанных ионов от их общего количества, присутствующего с обеих сторон мембраны, будет получена с большой ошибкой. [c.452]

В ходе реакции гаптен-антитело (когда гаптен имеет небольшую молекулярную массу и одновалентен) не происходит никаких взаимных превращений гаптена и антитела. Поэтому о их взаимодействии судят с помощью различных физических и физико-химических методов. Эти методы основаны на оценке количества связанного гаптена по изменению диффузионного равновесия последнего в присутствии антитела (метод равновесного диализа ) или по изменению оптических свойств гаптена после его связывания антителом. [c.104]

Метод равновесного диализа в его различных модификациях — общепринятый способ оценки реакции антител с простыми гаптенами. Его чувствительность зависит только от чувствительности методов оценки концентрации гаптена. Наиболее чувствительным, разумеется, яв- [c.246]

Связывание аденозина с поли(и) было изучено методом равновесного диализа (Huang, Ts o, JMB, 16, 523, 1966). В приведенной ниже таблице указаны доли занятых центров в молекулах поли(и), т. е. значения у при разных молярных концентрациях свободного аденозина (А) в растворе при 5°С. Определите истинную константу ассоциации для присоединения аденозина к поли(и) и свободную энергию взаимодействия между расположенными по соседст- [c.333]

Взаимодействие аргинил- РНК-синтетазы из Е.соИ с субстратом аргинином, содержащим радиоактивную метку [ С]-аргинина, исследовали с использованием метода равновесного диализа. Диализ проводили в кювете, разделенной на два равных по объему отсека целлюлозной мембраной, проницаемой для а згинина и непроницаемой для фермента. В кювету запива.пи раствор субстрата различной концентрации в стандартном буфере. Далее в один из отсеков кюветы вносили раствор фермента в стандартном буфере. Концентрация фермента во всех опытах была постоянной, равной 6,5 мкМ. После проведения диализа и установления равновесия определяли концентрацию арпшина в отсеке, не содержащем фермент. [c.126]

Степень связывания ионов белками можно определять различными методами из них наиболее широко распрострапен метод равновесного диализа. При диализе (так же как и при осмометрии) используют мешочек, стенки которого непроницаемы для молекул белка, но проницаемы для небольших ионов. Диализный мешочек с раствором белка помещают в раствор, содержащий необходимый ион. После установления равновесной концентрации диффундирующего иона по обе стороны мембраны измеряют концентрацию иона в растворе, не содержащем белка разность начальной и конечной концентраций иона в не содержащем белка растворе позволяет определить концентрацию иона в растворе белка. Если концентрации иона по обе стороны мембраны равны друг другу, то это означает, что связывания не произошло. Если связывание имело место, то концентрация иона в белковом растворе должна быть выше, чем в растворе, не содержащем белка разность концентраций может служить мерой числа ионов, связанных с одной молекулой белка. Для того чтобы исключить влияние эффекта Гиббса — Доннана, равновесный диализ проводят обычно либо в изоэлектрической точке белка, либо при высокой ионной силе. Такие методы, как ультрафильтрация, распределительный анализ, а в некоторых случаях и адсорбционная спектрофотометрия, также могут служить для определения степени связывания ионов с белками. [c.73]

Сывороточный альбумин — белок с молекулярной массой приблизительно 69 000, который содержит (наряду с полным набором других аминокислот) 16 остатков гистидина. Проведенное ранее методом равновесного диализа исследсвание связывания с 2п(П) и влияние этого связывания на равновесие сывороточного альбу- [c.280]

В 1963 г. Мальмстрём с сотр. [56] опубликовал серию работ, в которых изложил результаты тщательно выполненных экспериментов с использовании классического термодинамического метода равновесного диализа, дополненного методом электронного парамагнитного резонанса. Уделяя особое внимание тому, чтобы показать, что равновесие действительно достигается, и обрабатывая свои данные новым методом графического анализа, эти исследователи заключили, что связывание железа трансферрином можно описать, предположив участие в связывании двух эквивалентных невзаимодействующих центров. Если это так, то напрашивается вывод, что трансферрин в растворах не полностью насыщен железом и должны сосуществовать три типа белковых частиц частицы с двумя связанными атомами железа, частицы только с одним связанным атомом и частицы, не содержащие металла [59]. Вернер и Вебер [21] на основании электрофоретических диаграмм, скорее интуитивно, различили три типа молекул в неполностью насыщенных железом растворах кональбумина. Однако они не сопоставили это наблюдение со своими заключениями, сделанными на основании исследования равновесия. Позднее это предположение было детально подтверждено для трансферрина с помощью фронтального электрофореза методом движущейся границы [59], а окончательно для кональбумина методом изоэлектрического фокусирования [60]. Было высказано предположение, что частицы, обладающие промежуточной подвижностью при электрофорезе и в опытах по изоэлектрическому фокусированию, могут представлять собой димер апопротеина и белка, насыщенного железом [61]. Однако позднее было доказано, что это предположение несостоятельно [41]. [c.341]

Вся сумма имеющихся в настоящее время данных подтверждает мнение о том, что термодинамические константы, описывающие связывание железа с трансферрином, внутренне идентичны. Повторное изучение методом равновесного диализа связывания железа кональбумином также показало большое сходство в связывании металла этим белком и трансферрином [62]. По-видимому, более ранние данные Вернера и Вебера были получены до достижения равновесия, так как в этих опытах проходило только 18 ч между добавлением железа к раствору апокональбумина и временем наблюдения проведенное позднее исследование зависимости от времени показало, что для достижения истинного равновесия требуется по крайней мере несколько дней [56]. Физиологическое исследование Шэйда не содержало термодинамических измерений и поэтому не противоречит предшествующим результатам. Количественных данных о связывании железа с лактоферрином в настоящее время не имеется. [c.341]

Существуют некоторые разногласия по поводу значения чисел, полученных при измерении связывания металла с сидерофилинами методом равновесного диализа. Константы связывания К и /Сг характеризуют химические реакции, представленные выше уравнениями (1) и (2), и записываются в следующем виде [55] [c.342]

Для получения информации о связи химического строения с иммунологической специфичностью в системах углевод — антиуглевод применяют следующие типы иммунологических исследований а) количественное осаждение близкородственных полисахаридов гомологичными антисыворотками с последующим построением кривых осаждения [9, 10] б) количественное осаждение гетерологичными или перекрестно реагирующими антисыворотками [11 — 13] в) ингибирование осаждения в гомологичных или перекрестно реагирующих системах олигосахаридами или простыми сахарами [6—8, 11] г) специфическое связывание олигосахаридов с антителом, определяемое методом равновесного диализа [14] д) связывание комплемента и ингибирование связывания комплемента [15, 16] е) получение искусственных антигенов с углеводными детер-минантными группами конденсацией простых сахаров известного строения с белками через азофенильную группу и сравнение специфичности появляющихся антител с известными изменениями в структуре введенных групп [17, 18] или использование, гаптенного ингибирования для выяснения специфичности антисыворотки [19—22]. [c.431]

Во всех изученных ранее объектах исследования, в которых показано значение циклической формы нуклеотида в качестве регулятора обменных процессов, был обнаружен, как правило, белок, связывающий циклический АМФ. В связи с этим интересно, что в случае НС таким белком оказался родопсин. Этот феномен был показан в нашей лаборатории Думлер, исследовавшей связывание различных нуклеотидов дигитониновым экстрактом родопсина при помощи метода равновесного диализа. Так, оказалось, что родопсин связывает 47% добавленного циклического АМФ, но лишь 19—22 /о АМФ или АТФ. [c.105]

Реакцию низкомолекулярного гаптена с антителами можно оценить с помощью прямых реакций, сргди которых наибольшее применение получил метод равновесного диализа (см. гл. 12). Полученные в эксперименте данные позволяют рассчитать константу равновесия (Д) в системе гаптен-антитело (см. гл. 4 и 12). Если определять величины константы равновесия при реакции антител к определенному конъюгированному антигену с рядом сходных по строению гаптенов, можно оценить вклад каждого радикала в структуру детерминантной группы. При этом удобно сопоставлять сродство к антителу какого-то аналога детерминантной группы со сродством наиболее близкого к ней по строению гаптена ре-ференс-гаптен). Таким способом получают относительную величину константы связывания Кот) Дотн= = Кх/Кр.г, где Кх — константа связывания исследуемого аналога, Кр.г — константа связывания референс-гаптена. [c.24]

Связывание небольшого полимера с более крупным (например, тРНК с аминоацил-тРНК—сиитетазой) нельзя исследовать методом равновесного диализа, а для равновесной гель-фильтрации требуются относительно большие объемы. В этом случае используют метод аналитического центрифугирования, позволяющий работать с объемами 100—200 мкл. Ячейку центрифуги [c.206]

Константы связывания для гаптенов были определены методами равновесного диализа и спектроскопии. Например, присоединение окрашенного гаптенатипадини-трофенильного производного тушит флуоресценцию остатков триптофана в белке-ан-тителе. Степень тушения служит мерой насыщения участков связывания в молекуле белка. Для большинства гаптенов константы связывания лежат в пределах от [c.236]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология