Равновесная гель-фильтрация

Равновесная гель-фильтрация [7] [c.204]

Число связывающих центров и их сродство можно определить прямыми методами, такими, как равновесный диализ [2] или хроматографическая гель-фильтрация [3]. Во всех исследованиях такого типа число связанных ионов металла определяется непосредственно анализом концентрации комплекса металла с белком как функции равновесной концентрации свободного иона металла. При изучении связывания с металлом особенно важны значения pH как для получения достоверных данных, так и для их интерпретации (разд. 3), и в зависимости от цели исследования значения pH могут поддерж иваться постоянными или изменяться. По возможности следует избегать большинства буферов из-за конкуренции между белком и буфером за металл, а также из-за возможности образования тройного комплекса, включающего металл, белок и буфер [4]. Со спосо бами обработки первичных данных с целью определения числа различных центров связывания и оценки их сродства можно ознакомиться в специальных руководствах [c.275]

В последнее время наиболее тщательное фракционирование полимеров удается осуш,ествить методом гель-фильтрации. При проведении гель-фильтрации разбавленный раствор исследуемого полимера заливают в высокие колонки, заполненные предварительно набухшим в том же растворителе сетчатым полимером (гелем) с различной плотностью полимерной сетки. Исследуемый полимер диффундирует вместе с растворителем внутрь набухшего геля. Чем ниже молекулярный вес фракции, тем в более узкие микроканалы она проникает. Одновременно из микроканалов большего диаметра низкомолекулярные фракции вытесняются более высокомолекулярными. После установления равновесного распределения полимера в набухшем геле его смывают растворителем. Первые дозы фильтрата содержат наиболее высокомолекулярные фракции полимера, для которых микроканалы геля оказались слишком малыми, последующие дозы растворителя вымывают полимер все более низкого молекулярного веса. [c.62]

Пять белковых зон, проявляющих ферментативную активность, были выявлены с помощью метода тонкослойной гель-фильтрации через сефадекс С-200. Значения молекулярных весов обнаруженных форм фермента колебались в пределах от 40000—45000 до 280 000—300000. Было показано, что каждая из пяти полученных в результате гель-фильтрации фракций при последующем диск-электрофорезе разделяется на несколько белковых зон, среди которых преобладают зоны с одинаковой электрофоретической подвижностью 0,52, 0,73 и 0,98. Формы с более низким значением Rf обнаружены во фракциях, содержащих высокополимерные белки. Полученные при электрофоретическом анализе и гель-фильтрации экспериментальные данные свидетельствуют о присутствии в препаратах НАД-киназы нескольких форм фермента. Показана возможность перехода одних форм в другие. Иными словами, исследованные препараты фермента содержат равновесную систему множественных молекулярных форм, различающихся по молекулярному весу и способных осуществлять взаимные переходы-В процессе гель-фильтрации эти формы разделяются по молекулярному весу, а последующие процедуры элюции и концентриро- [c.137]

В настоящее время в продаже имеются самые различные гели, их выпускают в виде сухих частиц, а используют после того, как гели набухнут в соответствующем растворителе. Этими частицами заполняют хроматографическую колонку, в которой они выполняют функцию неподвижной фазы. При медленной фильтрации раствора через колонку осуществляется относительное перемещение неподвижной и подвижной фаз. В результате неоднородного распределения молекул между фазами происходит постепенное разделение смеси на компоненты в соответствии с размерами молекул. Компонент с самыми большими молекулами, которые не входят в поры геля и поэтому переносятся без задержки растворителем, выходит из колонки первым. Движение молекул среднего размера, которые в результате диффузии могут частично проникать в неподвижную фазу, несколько замедленно. Малые молекулы свободно переносятся диффузией в поры геля, а их равновесное распределение сдвигается в сторону увеличения концентрации в фазе геля [c.25]

Состояние равновесия в рассматриваемой области системы может отличаться от обычных солевых систем. Гидролиз двойного сульфата титанила и аммония в конечном счете приводит к образованию твердой фазы, которая является по своей природе гелем двуокиси титана. Образование геля проходит через стадию коллоиднодисперсных растворов двуокиси титана. Жидкая фаза, получающаяся при гидролизе, нередко может представлять собой коллоидный раствор. В системе после гидролиза одновременно могут существовать раствор двойного сульфата титанила и аммония в кристаллоидном состоянии, коллоиднодисперсный раствор двуокиси титана и гель двуокиси титапа. В равновесное состояние такая система теоретически не может прийти даже за длительное время, так как коллоиднодисперсный раствор в термодинамическом отношении является неравновесной системой по своей природе. Практически, однако, коллоиднодисперсную компоненту системы можно объединять совместно с кристаллоидным раствором и рассматривать эту часть системы как жидкую фазу, которая путем фильтрации отделяется частично или полностью от твердой фазы, т. е. геля. Имея это в виду, для изучения гидролиза можно применять метод растворимости. Степень гидролиза при таком методе изучения системы определяется выходом геля, рассматриваемого как твердая фаза. Этот выход, а следовательно, и степень гидролиза, определяется, таким образом, степенью коагуляции геля. [c.120]

При проведении равновесной гель-фильтрации колонку уравновешивают раствором лигаида и наносят образец фермента, уравновешенный буферным раствором. Проходя через колонку, белок связывает лиганд и перемещает его с такой же скоростью, с какой движется сам. В результате положение пика, соответствующего выходу лиганда из колонки, совпадает с положением пика, отвечающего белку, тогда как впадина на кривой находится в области, обычно занимаемой небольшими молекулами. Площадь под пиком равна площади впадины и соответствует количеству связанного лиганда. [c.205]

Связывание небольшого полимера с более крупным (например, тРНК с аминоацил-тРНК—сиитетазой) нельзя исследовать методом равновесного диализа, а для равновесной гель-фильтрации требуются относительно большие объемы. В этом случае используют метод аналитического центрифугирования, позволяющий работать с объемами 100—200 мкл. Ячейку центрифуги [c.206]

Жидкость неподвижной фазы, как и прп гель-фильтрации, может быть просто иммобилизована внутри пористых гранул, илп, например, быть прочно связана с волокнами набухшей целлюлозы, илп же покрывать тонкой пленкой гранулы из сплошного материала и поверхность пор внутри них. Покрытие может осуществляться за счет смачивания, сорбции пли химическим путем. В последнем случае нередко пленка жидкости сводится к мономолекулярному слою вещества, способного удерживать близ своей поверхности молекулы колшонентов фракционируелюй смеси в соответствии со степенью их сродства к нему. В этом случае о соотношении растворимостей говорить трудно, так что лучше оперировать только понятиями сродства того или иного компонента к неподвижной и подвижной фазам, что, впрочем, с позиций теории хроматографии сведется к точно такой же, как при истинном растворении, количественной характеристике равновесного распределения фракционируемого материала между двумя фазами. Если в процессе распределительной хроматографии участвуют две истинные жидкости, то для осуществления равновесного распределения вещества они сами тоже должны быть в равновесии между собой, т. е. в случае частичной их растворимости друг в друге должны быть взаилшо насыщенными. [c.8]

В главе 1 понятие коэффициента распределения — основного параметра хрохматографического процесса — было введено через равновесное отношение масс вещества, находящихся в неподвижной (Ms) и подвижной (Mm) фазах К = MJMm- Для идеального процесса гель-фильтрации (в отсутствие какой-либо сорбции молекул вещества) его концентрация в обеих фазах одинакова, так что коэффициент распределения можно представить отношением объемов неподвижной и подвижной фаз в пределах хроматографической зоны К = VJVjn- [c.110]

Что касается самого процесса ТСХ, то здесь можно усмотреть далеко идущую аналогию с жидкостной хроматографией на колонках. Неподвижную фазу образует н идкость, связанная со слоем фиксированного на подложке гранулированного сорбента, свойства и характеристики которого близки, а иногда даже идентичны таковым для материалов, используемых в качестве носителей неподвижной фазы в колоночной хроматографии. Здесь используются те же производные целлюлозы или силикагеля, к которым надо добавить только полоски ацетилцеллюлозы. Подвижную фазу образует жидкий элюент с аналогичными, рассмотренным ранее свойствами. Неизменной остается и сущность хроматографического процесса, базирующегося на равновесном распределении вещества между неподвижной и подвижной фазами. Как и в любом хроматографическом процессе (гель-фильтрация в тонком слое была рассмотрена в гл. 4), для целей хроматографического фракционирования это распределение должно быть сильно сдвинуто в пользу неподвижной фазы. Из всех вариантов хроматографпп для разделения компонентов белков и нуклеиновых кислот методом ТСХ (сами биополимеры очень редко выступают здесь в качестве объектов) практически пспользуют только два нормальнофазовую распределительную и ионообменную. [c.458]

Многие из общих подходов к исследованию механизма действия ферментов также применимы и к изучению роли ионов металлов в ферментативном катализе. Схемы координации, описывающие взаимодействие фермента, металла и лиганда, могут быть изучены методами, применяемыми при определении стехиометрии и сродства связывания белками небольших молекул. Эти методы включают гель-фильтрацию в присутствии или в отсутствие небольших молекул [49], метод скоростного диализа [50], ультрафильтрацию, метод ультрацентрифугирования по Хейесу — Велику [52], равновесный диализ [53], а также методы для измерения только сродства взаимодействия [54—58]. Выбор схемы координации ионов металлов и лигандов с ферментами с помощью этих методов возможен только при отсутствии влияния других факторов. Например, если образуется комплекс Е — лиганд — М +, фермент должен проявлять значительное сродство к иону металла только в присутствии лиганда. И, наоборот, если образуется комплекс Е — М + — лиганд, то не должно происходить значительного связывания лиганда в отсутствие иона металла. Однако практически ферменты часто проявляют склонность к связыванию обоих компонентов комплекса, невзирая на выбранную схему координации. Следовательно, важны данные, полученные с учетом стехиометрических и кинетических критериев. Такие важные типы комплексов, как Е — лиганд — М + и Е — М + — лиганд, обычно содержат все три компонента в эквимолярных количествах. Более [c.449]

Специфика растворов ароматических полиамидов заключается в их чрезвычайно высокой вязкости, достигающей нескольиих тысяч пуаз, что на порядок выше вязкости прядильных растворов промышленных полимеров. Это объясняется, по-видимому, как высокими молекулярными весами ароматических полиамидов, так и структурированием растворов. Высокие вязкости прядильных растворов затрудняют их переработку, в частности это касается процессов фильтрации и обезвоздушивания. Процесс обезвоздушивания растворов играет большую роль в технологии приготовления растворов. Как и включения твердых примесей или гель-частиц, включения пузырьков воздуха в рабочий раствор нежелательны, так как они приводят к нарушению режима формования. Удаление воздуха из рабочего раствора осуществляется отстаиванием в баках, выдерживанием раствора в вакууме и под давлением [37]. При повышенном давлении имеющиеся в растворе мелкие пузырьки воздуха растворяются и если давление при транспортировке прядильного раствора и формовании волокна не снижается, то обеспечиваются условия устойчивого формования. Поскольку скорость дегазации определяется разностью равновесных концентраций газа в жидкости, соответствующих начальному и конечному давлению, для интенсификации процесса обезвоздушивание следует проводить с предварительным насыщением раствора газом [38]. [c.164]

Возможность выполнения этих требований ограничивается возрастанием сопротивления при фильтрации жидкости. В колонку приливают 1.5—3 мл раствора веществ, имеющих различный молекулярный вес. При быстром наступлении равновесного распределения фильтруемых веществ между свободным растворителем Уо и иммобильным растворителем геля в верхнем слое колонки каждая фракция распределяется в грануле в соответствии с величиной своего молекулярного веса, а следовательно, и своей скорости диффузии в набухших гранулах. Проницаемость геля может иметь несколько уровней в зависимости от его строения и степени набухания. Вблизи поперечных связей между продольными цепями полимерной сетки гель ироницаем только для фракций с наиболее низким молекулярным весом. Скорость диффузии каждой фракции в грануле набухшего геля прямо пропорциональна диаметру гранул и степени их набухания и обратно пропорциональна размеру молекул вещества, составляющего данную фракцию. Примером может служить следующее исследование скорости диффузии белков из водного раствора в набухший гидрофильный гель из агара в зависимости от молекулярного веса фракции I ] [c.31]

В 34 главах изложены методы определения, выделения и очистки антител (включая дансилироваиие, двумерную хроматографию, изоэлектрофокусирование, электрофорез в полиакриламидном геле и изотахофорез) методы определения констант равновесия (равновесный диализ, равновесная фильтрация и седиментация) способы маркировки реагентов изотопами и флуоресцентными красителями и определение компонентов клеточной поверхности меры предосторожности при работе в изотопной лаборатории методы химической модификации белков, гаптенов и нерастворимых носителей приемы получения аитн-сывороток к аллотипам и антигенам гистосовместимости и получения антител доминирующего клонотипа методы оценки гистосовместимости и реакций в смешанной культуре лимфоцитов методы разделения клеток на гелях, несу- [c.7]