Методы очистки иммуноглобулинов

При иммунохимическом исследовании вирусов растений успешно использовались иммунизированные цыплята и яичный желток как источник антител, а не иммунная сыворотка. Этот метод позволяет в короткое время получать значительное количе--ство антител он облегчает очистку иммуноглобулинов IgG позволяет избежать кровопускание у животных [108]. [c.97]

Таким образом, улучшенные матрицы, наличие разнообразных колонок и увеличение их емкостей дают возможность исследователям в области иммунохимии использовать присущие ВЖХ высокую чувствительность, хорошее разрешение и быструю элюцию. В этой главе будут детально обсуждены три типа хроматографических разделений, используемых в нашей лаборатории для очистки иммуноглобулинов и изучения их структуры. Речь пойдет о методах ГП-ВЖХ, ОФ-ВЖХ и ГА-ВЖХ. [c.134]

Определение классов и подкласс ов антител важно для выбора способа их очистки. Классы и подклассы моноклональных иммуноглобулинов, секретируемых специфическими гибридомами, определяют прямым методом ИФА (рис. 41). [c.322]

В случае хранения в замороженном состоянии при —20 °С рекомендуется разделять антисыворотку на партии небольших объемов, чтобы не подвергать ее многократному замораживанию и размораживанию. При использовании некоторых методов необходимо, чтобы иммуноглобулины IgG были отделены от других сывороточных белков. Осаждение сульфатом аммония или комбинирование этой операции с ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе [31, 36] или с аффинной хроматографией при использовании белка А, иммобилизованного на носителе [48], позволяет легко, но более или менее тщательно очистить эти иммуноглобулины. Иммуноаффинная хроматография, используя очищенный иммобилизованный антиген, дает возможность производить очистку специфических антител белка при разделении фракции IgG или даже антисыворотки. [c.97]

Аффинная хроматография высокоспецифичный и эффективный метод выделения специфических белков. Вследствие того что молекулы большинства белков легко разрушаются при использовании для их выделения и очистки многих традиционных методов, применяемых в органической химии, таких, как возгонка и экстрагирование различными растворителями, биохимики вынуждены были разработать для этой цели специальные методы. Нередко удается выделить какой-нибудь один белок, присутствующий в смеси, содержащей несколько тысяч других биомолекул, в концентрации 10 -10 М. Один из таких методов, известный под названием аффинной хроматографии, сыграл решающую роль при выделении и очистке ряда ферментов, иммуноглобулинов и рецепторных белков. В основе метода лежит тот [c.163]

Получение сыворотки представляет собой лишь начальный этап приготовления нужного реагента. Для большинства методов необходима лишь иммуноглобулиновая фракция, остальные компоненты сыворотки могут быть отброшены. Это приводит к снижению отношения общего белка к антителам, уровня неспецифических реакций и к увеличению чувствительности метода. Процесс мечения антител флуорохромом, ферментом или изотопом, а также очистку методом аффинной хроматографии начинают с выделения иммуноглобулинов. [c.34]

Несмотря на сравнительную простоту аффинной очистки антител, обратная процедура, а именно очистка антигена на колонке с иммобилизованными антителами, была, как правило, неэффективной. Дело в том, что для получения специфической антисыворотки обычно требуется чистый антиген, а его легче очистить традиционными методами, чем при помощи колонки с иммобилизованными специфическими поликлональными иммуноглобулинами. Одна из причин неэффективности колоночной очистки в данном случае заключалась в том, что специфические антитела составляют весьма незначительную долю всех иммобилизованных иммуноглобулинов. [c.164]

В нашей лаборатории методы ВЖХ используют для очистки и изучения структуры и функции иммуноглобулинов. Ниже приведены детальные описания применяемых вариантов ВЖХ и примеры их использования. ГП-ВЖХ применяют для разделения легких и тяжелых цепей антител после восстановления и ал-килирования. Этот метод используют также для очистки фрагментов антител после их химического расщепления. ОФ-ВЖХ применяют для пептидного картирования антител. Мы обсудим в этой главе способы улучшения разделения пептидов и повышения чувствительности их детектирования, а также новый вариант очистки моноклональных антител в мягких условиях с помощью ГА-ВЖХ. Этот метод имеет ряд преимуществ, которые помогут повысить чистоту препаратов моноклональных антител. [c.139]

Рассмотрение различных вариантов иммуноэлектрофореза естественным образом завершает начатое еще в предыдущей книге изложение методов фракционирования белков и нуклеиновых кислот в электрическом поле. В любом из вариантов иммуноэлектрофореза обязательно имеет место явление иммунопреципитации. Это явление широко используется и само по себе — как плодотворный способ высокоизбирательной очистки белков, а также для обнаружения иммуноспецифических продуктов фракционирования, проведенного с помощью обычного электрофореза или ИЭФ. Поэтому представляется целесообразным предварить рассмотрение собственно иммуноэлектрофореза описанием механизма и особенностей метода иммунопреципитации. Однако многие из этих особенностей, в частности очень важные явления неоднозначности иммунного ответа и полиморфизма иммунных реакций, нельзя понять без хотя бы беглого, но не слишком поверхностного знакомства С механизмом выработки иммунитета, строением я функцией иммуноглобулинов, природой сил взаимодействия между антителами и антигенами и т. д. Эти же представления окажутся необходимыми в следующей части книги при рассмотрении радиоиммунных методов исследования. Между тем в большинстве случаев биохимики и молекулярные биологи довольно плохо знакомы с современной иммунохимией, претерпевающей к тому же пору бурного развития. [c.81]

Аффинная хроматография используется для выделения таких белков, как ферменты, иммуноглобулины, лектины, рецепторные белки, которые обладают способностью специфически связываться с другими веществами. Несмотря на то что этот метод разработан сравнительно недавно, он уже оказал мощное влияние на развитие методологии очистки белков. Принцип метода состоит в следующем лиганд Ь, который обладает способностью специфически связываться с выделяемым белком, прочно закрепляют иа нерастворимом носителе М. Полученный таким образом адсорбент МЬ суспендируют в подходящем растворителе и переносят в хроматографическую колонку. Затем через колонку пропускают смесь, содержащую выделяемый белок. Белок Р связывается со специфическим адсорбентом благодаря нековалентным взаимодействиям [c.158]

Ионообменная хроматография оказалась чрезвычайно эффективным методом очистки иммуноглобулинов (Peterson, Sober, 1956). Чаще всего используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭЛЭ-целлюлозу). Белки задерживаются анионообменником в результате ионных взаимодействий и могут быть легко элюированы с адсорбента при повышении ионной силы и (или) изменении pH в сторону их изоэлектрической точки. [c.59]

Метод очень эффективно работает для всех антител класса IgG мыши, кроме подкласса IgGl. Эти последние антитела обладают очень низкой аффинностью по отношению к белку А. Поэтому для получения хорошего их выхода метод следует модифицировать. Очистка иммуноглобулинов других классов здесь не рассматривается, поскольку подавляющее большинство гибридом, получаемых в результате гипериммунизации и слияния, проводимых в соответствии с описанными методиками, продуцирует антитела класса IgG. Мы не советуем вам получать антитела нз асцитной жидкости (разд. 6.3.8), поскольку такие же количества антител, причем более чистых, могут быть получены прн использовании методов, описание которых приводится выше. [c.198]

К насыщенному раствору (NH4)2S04 добавляют 2 н. NaOH и доводят pH до 7,8. При постоянном перемешивании медленно, по каплям к 50 мл сыворотки кролика добавляют 80 мл насыщенного раствора сульфата аммония (pH 7,8) и перемешивают в течение 2—3 ч. Центрифугируют суспензию при комнатной температуре 30 мин при 1500 g. Первый осадок содержит все -у-глобулины, другие глобулины и следы альбумина. Растворяют осадок в дистиллированной воде до начального объема сыворотки (50 мл). Очищают фракцию у-глобули-нов вторым и третьим осаждениями. После третьего осаждения растворяют осадок в боратном буфере (pH 8,45) до конечного объема 20— 25 мл. Удаляют сульфат аммония диализом при 4°С против боратного буфера в течение 2—3 дней со сменой буфера утром и вечером. Полученный после диализа препарат иммуноглобулинов обычно содержит небольшой осадок денатурированного белка и слегка опалесцирует. Центрифугируют при 4° С в течение 30 мин при 1400 s. В полученном препарате проверяют содержание белка и титров антител. Определяют белковый состав методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН (с. 119). Если полученный препарат у-глобулинов не отвечает требованиям эксперимента по стоте, проводят дальнейшую очистку с применением ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. [c.308]

B для аффинной хроматографии антител типа IgG и антигенов. Белок А (мол. масса 42 ООО, выделен из Staphylo o us aureus) иммобилизован на поперечносшитом агарозном геле (см. разд. 30) бромциановым методом. Белок специфически взаимодействует с молекулами иммуноглобулинов IgG некоторых подтипов. Так как взаимодействие белка А с IgG не затрагивает у последних той части молекулы, посредством которой связываются антитела, возникает возможность выделения и очистки антигенов на БСС с адсорбированным IgG соответствующего типа. Элюирование комплекса антиген антитело выполняют с помощью 3 М раствора изотиоцианата калия. [c.227]

Гибридный белок САТ-кальцитонин [20] (табл. 4.11) был сконструирован так, чтобы его можно было очистить субстрат-аффинной хроматографией. Когда обнаружилось, что гибридный белок находится в нерастворимом состоянии, стало очевидным, что этот подход неприемлем. Другие гибридные белки, приведенные в табл. 4.11, были также сконструированы с расчетом на очистку с помощью аффинной хроматографии. Для выделения составного белка -галактозидаза-Х использовали -aминoфeнил- -D-тиoгaлaктoзид (субстратный аналог -галактозидазы [27]) и белок А, специфически связывающийся с фрагментом F иммуноглобулина G [28]. Эти гибридные белки, синтезируемые в клетках Е. oli, растворимы метод их очистки описан в разд. 4.4. [c.113]

Знание того, где находится фитохром в растении, конечно,, помогло бы нам понять механизм его действия, и для получения этой информации было использовано несколько методов. Самые подробные данные о распределении фитохрома на уровне световой микроскопии получены нами с помощью метода иммуноцитохимии— с использованием антител, синтезируемых в организме животного после введения ему в кровь чужеродного белка. Кролики, которым вводят выделенный из растительной ткани фитохром, синтезируют антифитохромный иммуноглобулин. Это вещество после очистки специфически связывается с фитохромоМ в срезах растительной ткани. Присутствие здесь иммуноглобулина можно выявить благодаря связыванию другого его конца с ферментом пероксидазой, при действии которого на субстрат образуется нерастворимый окрашенный продукт. Распределение фитохрома в молодых побегах ячменя, выясненное этим методом, показано на рис. 11.15. [c.349]

Создание эффективного метода отщепления остатка нироглу-таминовой кислоты решило проблему секвенирования белков, блокированных вследствие циклизации N-концевых Gin и Glu [136]. Поскольку благодаря реакции деблокирования , протекающей с высоким выходом, становится доступной а-амино-группа последующего аминокислотного остатка, реакцию циклизации следует рассматривать как удобный способ создания защитной группы на стадиях очистки белка. Снятие защиты осуществляют путем двукратной инкубации с пироглутамат-аминопептидазой печени крупного рогатого скота. Метод был впервые использован при анализе легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, а затем при анализе тяжелой цепи гемаг-глютинина вируса гриппа [181]. [c.72]

Получение меченых антител для анализа методически более просто. Методы синтеза и очистки конъюгатов различных ферментов с иммуноглобулинами в настоящее время хорошо разработаны и унифицированы. С помощью имеющихся стандартных методик получают активные и стабильные препараты, что упрощает разработку методов иммуноферментного определения различных соеди-ненцй. В ИФА могут быть использованы меченая глобулиновая фракция или IgG-фракция антител, аффинно выделенные антитела или их РаЬ-фрагменты. Целесообразность применения того или иного препарата следует оценивать применительно к конкретному случаю. Однако необходимо отметить, что применение меченой глобулиновой или IgG-фракции антител приводит к значительному (до 90%) непроизводительному расходу фермента-маркера, вследствие чего возрастает как стоимость анализа, так и вероятность усложнения интерпретации его результатов за счет увеличения вклада неспецифических взаимодействий. [c.101]

При анализе методов, используемых для выделения клеточных рецепторов, обращает на себя внимание стремление к применению максимально щадящих методов на стадии элюции рецептора с сорбента. Так, применение сорбентов с иммобилизованными лактинами для очистки рецептора инсулина продиктовано прежде всего стремлением избежать воздействия на рецепторный белок растворов с низкими значениями pH, концентрированных растворов амидов (мочевина) или других денатурирующих белок веществ. В то же время в кислой среде (или с применением денатурирующих агентов) производится элюция с иммобилизованных лигандов (антигены или гаптены) различных по специфичности антител, не приводящая к их инактивации. Различие подходов к способам элюции клеточных рецепторов и антител (иммуноглобулины) с иммобилизованных лигандов, выбранных эмпирическим путем, связано с конформационнон лабильностью рецепторных белков. Так, для ряда изученных к настоящему времени рецепторов (например, рецептор для эпидермального фактора роста) характерны выраженные изменения конформации при переходе из нейтральной в слабокислую среду (см. гл. 3). [c.11]

Ионообменная хроматография и гель-фильтрация. Эти методы получили в настоящее время наибольщее распространение. Для ионообменной хроматографии, как правило, используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлоза) или ДЭЛЭ-сефадекс. Ионообмеини-ки уравновешивают буферными растворами низкой ионной силы (0,005—0,02 моль) при pH 7,2—8,2 с целью выделения IgG. В указанных условиях наименее заряженная часть молекул IgG не фиксируется на ионообменни-ке, в то время как другие иммуноглобулины и сывороточные белки связаны. Фракционирование можно проводить методом колоночной хроматографии или в объеме. С целью экономии ионообменника для очистки IgG целесообразно выделить первоначально из сыворотки общую глобулиновую фракцию осаждением сульфатом аммония при 50%-ном насыщении. [c.240]

Одна из наиболее трудных проблем при цитометрии связана с неспецифическим окрашиванием. Клеточный сортер с чрезвычайно высокой чувствительностью детектирует флуоресцирующие молекулы — обычно с большей, чем глаз. Поэтому реагенты, используемые при работе с сортером, должны быть более высокой степени очистки, чем для других методов анализа. Как правило, гетерологичные сыворотки должны подвергаться очистке на аффинных сорбентах даже в тех случаях, когда они достаточно специфичны для непосредственного использования при флуоресцентной микроскопии. Моноклональные антитела не всегда требуют очистки. Мы с успехом использовали супернатанты многих продуцирующих моноклональные антитела гибридом, которые культивировали в средах с добавлением и без добавления сыворотки, а также асцитные жидкости (конечно, в соответствующем разведении). В случае непрямых методов флуоресцентного окрашивания влияние контаминирую-щих молекул в культуральных жидкостях сводится к минимуму. Если конъюгированные с флуорохромом антитела строго специфичны по отношению к иммуноглобулинам, то даже при связывании клетками молекул, не относящихся к иммуноглобулинам, эти молекулы не будут детектироваться (по флуоресценции). В случае применения асцитных жидкостей активность моноклональных антител обычно настолько высока, что эффекты контаминирующих иммуноглобулинов и других компонентов чаще всего не выявляются. Однако при прямом конъ-югировании препаратов антител с флуорохромом наличие в них белковых примесей неиммуноглобулиновой природы может стать причиной высокого уровня неспецифического окрашивания. Следовательно, любой конъюгат используемый при сортинге клеток, должен быть тщательно очищен. [c.332]

Разумеется, для получения надежных результатов необходимы высокоактивные и высокоспецифические флуоресцирующие реагенты. Многие из широко используемых реагентов, например антисыворотки к иммуноглобулинам человека, имеются сейчас в продаже, однако выбор их, конечно, весьма ограничен. В настоящей главе мы рассмотрим приготовление, очистку и контроль препаратов антител, меченных флуорохромами, и применение таких антител для анализа мембранных антигенов живых клеток и внутренних антигенов фиксированных клеток. Читатель не найдет здесь полного обзора методов иммунофлуоресцеиции, а познакомится с практическими рекомендациями, помогающими в их освоении. [c.165]

К сывороточным иммунным препаратам относят иммунные сыворотки и иммуноглобулины. Иммунные сыворотки получают из крови гипериммунизированных (интенсивно иммунизированных) животных (лошади, ослы, кролики) соответствующей вакциной или крови иммунизированных людей (используется донорская, плацентарная, абортная кровь). Нативные иммунные сыворотки для удаления из них балластных белков и повышения концентрации антител подвергают очистке, используя различные физико-химические методы (спиртовой, ферментативный, аффинная хроматография, ультрафильтрация). Очищенные и концентрированные иммунные сыворотки называют иммуноглобулинами. [c.191]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология