Поглощение света и количественное определение белка

Для количественного определения аминокислот и пептидов по приведенным выше реакциям требуется колориметр или фотометр, с помощью которых обнаруживают изменения в свето-поглощении, связанные с протеканием реакций. Поскольку нингидрин наиболее широко используется для обнаружения аминокислот и белков, он послужит основой для дальнейшего обсуждения колориметра. [c.26]

Мы рассмотрели только те методы количественного определения белка, которые могут быть особенно полезны для наблюдения за ходом выделения и очистки. Известно немало других, менее универсальных, методов, применяющихся для решения других задач. К ним относится, например, определение концентрации белков в сыворотке крови по удельному весу последней — метод весьма ценный для клинических анализов.. Заслуживает особого упоминания и весьма чувствительный метод определения белка по поглощению ультрафиолетового света с Я = 200 220 ммк (область поглощения пептидными группами белка). Его распространение сдерживается пока крайней дефицитностью соответствующей аппаратуры. [c.34]

Располагая спектром поглощения белка или полипептида и зная групповые частоты, можно установить лишь наличие соответствующих групп в их молекуле. Измеряя оптическую плотность при этих частотах, можно было бы, при соответствующей калибровке, провести количественное определение этих групп. Однако строение белков изучено пока еще недостаточно, что затрудняет точный анализ. Поэтому основным приемом исследования являются количественные измерения поглощения поляризованного инфракрасного света ориентированными образцами полимеров. Эти измерения позволяют определить пространственное расположение химических связей в молекулах белков и полипептидов. [c.109]

Для белков коэффициент экстинкции при 280 нм намного ниже, чем соответствующая величина для нуклеиновых кислот при 260 нм, и зависит от содержания в белках тирозина и триптофана. Поэтому определение белков в УФ-свете по поглощению при 280 нм представляет собой менее чувствительную процедуру, чем методы окрашивания (рис. 70), К тому же для количественной оценки получаемых данных необходимо учитывать, что разные белки имеют неодинаковые коэффициенты экстинкции. Без построения специальных калибровочных кривых денситометрия в УФ-свете не позволяет производить прямое количественное сравнение кривых различных белковых зон. С помощью отдельных денситометров можно выявлять до [c.182]

В этой главе кратко описаны различные определения и уравнения дисперсии оптического вращения, а также показано различие в оптических свойствах олигомеров и полимеров. Для того чтобы проиллюстрировать применение и ограничения метода ДОВ, были выбраны несколько природных и синтетических полимеров. Большинство дисперсионных кривых почти не имеет особенностей и фактически монотонно, причем величина оптического вращения (по модулю) возрастает с уменьшением длины волны падающего света исключение составляет область оптически активной полосы поглощения, в которой проявляется эффект Коттона. При обработке экспериментальных данных важную роль играют два выведенных теоретически уравнения. Большую часть экспериментальных данных, относящихся к области спектра, удаленной от оптически активной полосы поглощения, можно описать простым уравнением Друде с двумя параметрами Яс и к. Это позволяет сравнивать или количественно различать конформации или конформационные переходы, скажем, одних белков от других. Теория Моффита, первоначально развитая для дисперсии а-спирали, позволяет описать сложную дисперсию при помощи трех параметров А-о, о и Ьо- Хотя уравнение Моффита неспецифично, несомненно, установлено, что спиральная конформация вносит свой вклад во вращение. [c.126]

Регистрацию выхода белков можно вести по УФ-поглощению при 280 нм, но не по поглощению пептидной связи (210—230 нм), так как в этой области сам полибуфер сильно поглощает свет. Полибуфер не мешает окраске белка красителями типа СВВ. Для определения концентрации белка во фракциях можно пспользовать количественные методы, основанные на окрашивании такими красителями. Определение белка по методу Лоури в присутствии пол1[буфера проводить нельзя, так как он связывает ионы меди. [c.336]

Для быстрых предварительных и сравнительных оценок может быть полезным определение белка по поглощению ультрафиолетового света при Я = 280 ммк, обусловленному входящими в его состав ароматическими аминокислотами. Чувствительность его довольно велика — около 0,2 мг/мл. Однако в присутствии нуклеиновых кислот результаты существенно искажаются. Частично С1 орректировать эти искажения можно, определяя поглощение не только при 280 но и при 260 ммк — в области максимального поглощения света нуклеиновыми кислотами. Существуют специальные таблицы и формулы, позволяющие по этим данным оценить соотношения содержания белка и нуклеиновых кислот. Однако для точных количественных определений малоизученных белков этот метод не может быть рекомендован. [c.34]

При экспериментальном использовании метода центрифугирования необходимо учитывать следующие особенности для этого метода также существует зависимость определяемых констант седиментации и диффузии от концентрации. В связи с этим (так же как и при измерении осмотического давления) необходимо проводить измерения в наиболее удобном интервале концентраций и экстраполировать полученные результаты к нулевой концентрации. Чем лучше растворитель, тем более вытянуты молекулы и тем круче ход концентрационной зависимости поэтому не следует применять слишком хорошие растворители. Изменение концентрации, состоящее при седиментации в снижении концентрации полимера в растворе в верхней части камеры, а при диффузии — в повышении концентрации полимера в растворителе, часто может быть определено оптически (в корпусе центрифуги имеется окно). Для этого применяются методы абсорбции, рефракции или интерференции. Для определения изменения концентрации может быть использовано поглощение света, если по крайней мере в одной определенной волновой области растворенные или суспендированные частицы поглощают значительно больше света, чем растворитель. Это имеет место для растворов красителей или суспензий пигментов. Различные типы белков также имеют в ультрафиолетовой области спектра сильные полосы поглощения. Полистирол имеет одну полосу поглощения при длине волны менее 290 лщ. Таким образом, по фотометрическим кривым можно сделать вывод об изменении концентрации полимера. Метод рефракции основан на изменении показателя преломления при изменении концентрации в местах изменений концентрации образуются оптические неоднородности, почти количественно определяемые по методу шкалы Ламма. Филпот и Свенсон предложили целесообразное расположение линз, которое так фиксирует изменение показателя преломления, что на экране или фотографической пластинке возникает кривая, которая непосредственно характеризует изменение концентрации. Для полимолекулярных веществ при седиментации концентрационное распределение соответствует молекулярному распределению получающиеся кривые имеют форму, приведенную на рис. 10. Метод интерференции применим только к диффузионным измерениям. [c.156]

Пуриновые и пиримидиновые основания интенсивно поглош,ают свет в УФ-области спектра благодаря наличию тг-электронного сопряжения. Максимум поглощения лежит около 260 нм (для сравнения у белков — около 280 нм). Положение максимума поглощения зависит от химического строения гетероцикла, т. е. от природы заместителей в гетероциклическом ядре. Важно отметить, что максимум поглощения незначительно зависит от структуры углеводного остатка, поэтому спектроскопические свойства азотистых оснований с успехом используются для количественного определения нуклеиновых кислот в растворах и биосредах, для ультрафиолетовой микроскопии живых тканей и для выявления мутагенных эффектов при УФ-облучении. [c.268]

Первичным источником белка на нашей планете являются растительные организмы с их замечательной способностью синтезировать белок из углекислоты, воды и неорганических источников азота. Поэтому понятно, какое большое теоретическое значение имеет исследование генетических и биохимических механизмов процессов, лежащих в основе усвоения азота растениями и его превращений в аминокислоты и белки. Ассимиляция нитрата у большинства культур — это основной способ превращения неорганического азота в органические соединения. При этом нитрат превращается в аммоний за счет действия механизма поглощения нитрата и двух ферментов нитратредуктазы (НР) и нитритредуктазы (НИР). Таким образом, азот становится доступным для многих биосинтетических процессов, наиболее важным из которых с количественной точки зрения является синтез белка. Сейчас известно, что в регуляции процессов на этом пути определенную роль играют доступность нитрата и гормонов, свет и конечные продукты реакции. Данные физиологических и биохимических исследований, однако, почти не раскрывают молекулярные механизмы, лежащие в основе развития и регуляции реакций, входящих в этот процесс. Такая информация очень важна, если ученые стремятся понять, каким образом новые методы молекулярной биологии могут быть использованы для повышения эффективности ассимиляции нитрата и, следовательно, повышения содержания белка в растениях. [c.378]