Белки коэффициент поглощения

Возможно прямое определение белка путем измерения оптической плотности (поглощения) при 280 нм, основанное иа присутствии в белке остатков тирозина и триптофана. Зная удельный коэффициент экстинкции е (оптическая плотность 1%-иого раствора белка при 280 им и длине оптического пути 1 см), можно, исходя из измеренной экстинкции раствора белка неизвестной концентрации, установить содержание белка (в мг/1 мл). [c.356]

Недостаток спектрофотометрического метода определения белков состоит, очевидно, в том, что содержание тирозина и триптофана (от которого зависит величина е) в разных белках варьирует. Этот метод дает хорошие результаты с гетерогенной смесью белков, а также с достаточно чистыми препаратами индивидуального белка, коэффициент поглощения которого может быть точно измерен или вычислен исходя из аминокислотного состава (при условии, что последний известен). [c.56]

Ароматические аминокислоты ответственны за свойство большинства белков поглощать УФ-излучение (с максимумом между 275 и 285 нм). Из всех ароматических аминокислот наиболее значительным поглощением обладает триптофан (рис. 4.4). Знание молярных коэффициентов поглощения для разных белков оказывается полезным при фотометрическом определении их концентрации в растворе. [c.108]

Пептиды и белки обладают сильным избирательным поглощением в области 210—220 нм. Однако при этом нельзя работать в буферных растворах, включающих карбонил со держащие соединения. Еще более чувствительным является определение пептидов при 192—194 нм, однако при измерении в этой области можно использовать лишь водные растворы фторидов щелочных металлов. По этой причине спектрофотометрическое определение белков в области ниже 210 нм используется крайне редко (лишь в специальных случаях ГПХ). По чувствительности определение белков при 210 нм сопоставимо с колориметрическим методом Лоури, Например, сывороточные белки определяли в концентрации 2 мкг/мл [79]. Поглощение при 210 нм характерно для пептидной связи, и, следовательно, белки имеют одинаковые коэффициенты экстинкции (табл. 35.8). [c.457]

ЭКСТИНКЦИИ нуклеиновых кислот примерно в 30—60 раз больше коэффициента экстинкции белков. Это свойство было использовано для фотографии в ультрафиолете и измерения поглощения в ультрафиолете (гл. VI). [c.36]

Спектры растворов или неориентированных пленок не дают информации о поляризации колебаний. Напротив, при исследовании белков или полипептидов в анизотропных средах (в ориентированных пленках и волокнах) с помощью поляризованного ИК-излучения поляризация колебаний наблюдается непосредственно. Измеряется инфракрасный дихроизм, характеризуемый отношением коэффициентов поглощения, измеренных для излучения с направлением электрического вектора световой волны, параллельным и перпендикулярным выделенному направлению. [c.165]

Элюат (фракции по 20 мл) анализируют на присутствие белка на спектрофотометре при 280 нм. После того как весь белок нанесен на колонку, ее промывают 1,5—2,0 л 1 М раствора хлористого натрия в течение 48 ч. По истечении этого времени оптическая плотность элюата при 280 нм не должна превышать 0,05. Конканавалин А элюируют 0,10 М раствором о-глюкозы в 1,0 М растворе хлористого натрия. Фракции с оптической плотностью не ниже 0,10 собирают и диализуют против большого объема 1,0 М раствора хлористого иатрия, причем последний несколько раз меняют. Концентрацию конканавалина А рассчитывают исходя из коэффициента поглощения при 280 им в 1,0 М растворе хлористого натрия —11,4 0,1. [c.91]

И сразу добавляют 0,4 мл реактива 4. Смесь вновь перемешивают и измеряют поглощение при 515 нм (оптимальное поглощение наблюдается через 20 сек после добавления реактива 3). Хотя 5 мкг хлоргид-рата аргинина дают поглощение в 0,2 единицы, молярный коэффициент поглощения для аргинина, входящего в состав пептида, может быть значительно ниже, чем для свободного аргинина. Например, выход брадикинина, определенный по цветной реакции, составил лишь около 70% от ожидаемого, а для некоторых белков выход, определенный по цветной реакции, равнялся 20% от действительного количества. [c.130]

Для белков коэффициент экстинкции при 280 нм намного ниже, чем соответствующая величина для нуклеиновых кислот при 260 нм, и зависит от содержания в белках тирозина и триптофана. Поэтому определение белков в УФ-свете по поглощению при 280 нм представляет собой менее чувствительную процедуру, чем методы окрашивания (рис. 70), К тому же для количественной оценки получаемых данных необходимо учитывать, что разные белки имеют неодинаковые коэффициенты экстинкции. Без построения специальных калибровочных кривых денситометрия в УФ-свете не позволяет производить прямое количественное сравнение кривых различных белковых зон. С помощью отдельных денситометров можно выявлять до [c.182]

Пептиды обладают избирательным поглощением в области 200— 220 ммк. Очень сильное поглощение белков при этих длинах волн некоторые исследователи используют для определения белков. Несовершенство приборов, используемых для этого, ограничивает точность измерений поэтому большое значение приобретает задача устранения рассеянной радиации. При желании ее можно контролировать обычным путем [9], следует лишь подобрать водородную лампу, имеющую максимальную интенсивность испускания при данной длине волны. Для установления прибора на нуль может оказаться необходимым заменить нагрузочное сопротивление. Гольд-фарб и др. [10] определили удельные коэффициенты экстинкции прн 205 и 210 ммк у некоторых белков и пептидов. В табл. 39 приве- [c.269]

Как и при интерпретации влияния солей на водные растворы, основное внимание следует обращать на изменение свободной энергии системы при добавлении неполярных веществ к водным растворам интерпретация этого явления непосредственно с точки зрения структурной модели может оказаться ошибочной. Так, структурная модель дает приемлемое объяснение солюбилизации гидрофобных соединений под действием спиртов алкилзамещенных аминов и мочевин. Если одно растворенное вещество увеличивает структурированность раствора, можно было бы ожидать, что оно должно облегчать введение молекул другого подобного вещества. С другой стороны, структурирующая способность вещества совершенно необязательна для того, чтобы оно было в состоянии солюбилизировать гидрофобные соединения в воде. Уже отмечалось, что один из возможных механизмов денатурации белков и нуклеиновых кислот под действием мочевины заключается в стабилизации гидрофобных боковых цепей аминокислот и оснований нуклеиновых кислот при увеличении их контакта с растворителем, что проявляется в увеличении растворимости и уменьшении коэффициента активности этих групп в присутствии мочевины [31, 32, 35]. Спирты, ацетон и подобные им вещества разрушают гидрофобные связи и способствуют денатурации аналогичным образом. Однако мочевина, вероятно, не обладает структурирующим действием, по крайней мере в том смысле, как это понимается для неполярных молекул мочевина очень слабо влияет на большинство свойств воды и либо практически не изменяет структуру воды, либо, из данных по поглощению ультразвука, несколько ее разрушает [85]. Данные по энтальпии и теплоемкости растворов веществ с гидрофобными группами, а также исследования спектра ультразвуковой релаксации полиэтиленгликоля в воде и растворах мочевины указывают на то, что энергетически более благоприятное взаимодействие гидрофобных групп с мочевиной, чем с водой, связано с уменьшением структурированности воды вокруг гидрофобных групп [85, 86]. Таким образом, разрушение гидрофобных связей под действием мочевины или спирта нельзя объяснить одним и тем же механизмом с точки зрения структуры растворителя, хотя по свободной энергии эффекты соединений этих двух типов одинаковы. Возможно, что мочевина создает более благоприятное окружение для гидрофобных групп, находящихся в пустотах струк- [c.328]

Теперь мы обратимся к краткому рассмотрению того, как описанные фотохимические изменения превраш,аются в электрический импульс, который стимулирует мозг. Существуют доказательства, что одиночный квант света может вызвать раздражение палочки сетчатки. Однако поглощение одного кванта еще не создает эффекта зрения. Для этого требуется попадание нескольких квантов (согласно разумной оценке, от двух до шести квантов) в одну и ту же палочку в течение относительно короткого временного промежутка. Но даже в этом случае процесс весьма эффективен, а энергия конечной реакции существенно превосходит энергию, поглощенную зрительным пигментом. Поглощение света инициирует цепь реакций, черпающих энергию из метаболизма. Тем самым зрительное возбуждение является результатом усиления светового сигнала, попадающего в сетчатку. Фоторецептор служит биологическим эквивалентом фотоумножителя, который преобразует кванты света в электрический сигнал с большим усилением и низким шумом (см. гл. 7). И фоторецептор, и фотоумножитель достигают большого коэффициента усиления с помощью каскада стадий усиления. Зрительные пигменты представляют собой интегральные мембранные белки, которые находятся в плазме и мембранах дисков внешнего сегмента фоторецептора. Фотоизомеризация ретиналя вызывает серию конформационных изменений в связанном с ним белке и тем самым образует или раскрывает ферментативный активный центр. Следует каскад ферментативных реакций, которые в конце концов дают нервный импульс. Электрический ответ начинается с кратковременной гиперполяризации, вызванной закрытием нескольких сотен натриевых каналов в плазматической мембране. Таким способом молекулы-посредники (мессенджеры) передают информацию от диска рецептора к мембране плазмы. Вероятным кандидатом на роль мессенджера является богатый энергией циклический фосфат цГМФ (гуанозин-3, 5 -цикломонофосфат), возможно, в сочетании с ионами Са +. Было показано, что катионная проводимость плазматических мембран палочек и колбочек прямо контролируется цГМФ. Таким образом светоиндуцированные структурные изменения диска активируют механизм преобразования, который сам генерирует потенциал, распространяющийся по плазматической мембране. В настоящее время детали механизмов преобразования и усиления продолжают исследоваться. Была предложена схема, основной упор в которой делается на центральную роль фосфодиэстеразы в процессе контроля за кон- [c.241]

При помощи метода спектрофотометрического дифференциального титрования можно определить число фенолятных анионов и число —5 -групп, содержащихся в молекуле белка. Для этого устанавливают в кюветодержателе двухлучевого спектрофотометра две кюветы с денатурированным белком (на месте образца и на месте кюветы сравнения), причем рн раствора, находящегося в канале образца, делают равным И,О, а в канале сравнения — 7,5. Наблюдаемое в этих условиях различие оптической плотности при длине волны 295 нм связано с тирозином (фенолятная форма). При длине волны 243 нм различие в оптической плотности образцов будет уже обусловлено оттитрованными формами как тирозина, так и цистеина. В приведенной ниже таблице указаны значения молярных коэффициентов экстинкции для тирозина при обеих длинах волн и для цистеина при более короткой длине волны (анионные формы поглощают, тогда как протонированные формы не поглощают), Раствор белка имеет концентрацию 5,5-10" М. Различие в поглощении при 295 нм составляет 0,013, а при 243 нм—0,185. Определите число титрующихся тирозиновых и цистеиноБых остатков. Считайте, что толщина слоя всех растворов равна 1,00 см. [c.533]

Определение белка. Для определения белка используют микро-биуретовый метод (см. с. 81). В случае сиектрофотометрического определения концентрацию белка рассчитывают с учетом коэффициента поглощения Л " 1см=13,2 при 280 нм. [c.234]

Кюветы спектрофотометра заполняют средой, содержащей фосфатный буфер (pH 7,4), 1 мМ K N, 1 мкМ ротенон, 1,5 мМ НАДН, 10—20 мкМ цитохром с. Устанавливают длину волны 550 нм (точно ). Для этого кювету помещают в кюветное отделение, устанавливают длину волны по шкале прибора на отметке 550 нм и добавляют к среде нейтрализованный (pH 7,4) раствор аскорбиновой кислоты (конечная концентрация — 5—10 мМ). Цитохром с немедленно восстанавливается, и раствор меняет цвет от красновато-оранжевого до ярко-розового. Устанавливают шкалу длин волн на 550 нм по максимальному поглощению раствора восстановленного цитохрома с, при дальнейшей работе установку длин волн не меняют. Реакцию начинают внесением препаратов в кювету, содержащую окисленный цитохром с, и регистрируют увеличение поглощения при 550 нм. Рассчитывают удельную активность препаратов в микроэлектронэквивалентах за 1 мин в расчете на 1 мг белка. Коэффициент миллимолярной экстинкции для цитохрома с Активность фермента, характерного для внешней мембраны, определяют по разнице скоростей реакций в присутствии и в отсутствие ротенона. [c.412]

ТОД широко применяют для обнаружения в элюатах белков и крупных пептидов, но он недостаточно универсален. Более общим методом анализа, не зависящим от аминокислотного состава пептидов, является измерение поглощения в области 180— 220 нм, где пептиды и белки характеризуются высокими коэффициентами поглощения [1] (например, поглощение при 210 нм в 10—20 раз выше, чем при 280 нм). Однако здесь имеются определенные технические трудности. Кроме того, в этой области интенсивным поглощением обладают почти все известные буферные растворы исключение составляют нелетучие буферы на основе неорганических солей. Можно также вести анализ по флуоресценции ароматических группировок. Этот метод обладает более высокой чувствительностью по сравнению со спек-трофотометрией при 280 нм, но область его применения также ограниченна. [c.391]

В форме волокна один и тот же полимер часто может быть ориентирован гораздо лучше, чем в форме листа или пленки. Это объясняется, возможно, отсутствием резаных и рваных краев. Вместе с тем волокно является не очень-то удобным объектом для инфракрасной спектроскопии. Однако волокна имеют исключительно большое технологическое значение, и исс,ледовать их приходится в той форме, в какой они есть, несмотря на то что получаемые при этом результаты обычно менее точны, чем в случае пленок. Спектр моноволокна при не слишком высоких коэффициентах поглощения может быть получен с помощью микроспектрометра, тогда как в случае сильных полос поглощения (таких, как амидные полосы белков и других волокон) толщины объектов оказываются слишком бoльши ш, для того чтобы люгли быть использованы подобные приборы. В таких случаях использовались сетки из тонких волокон и было описано простое дополнительное при- [c.272]

Этот способ стал использоваться для определения количества белка с тех пор, как Варбург и Христиан 174] сообщили о методе, основанном на измерении оптической плотности при 260 и 280 нм, что позволяет ввести поправку на содержание в препаратах нуклеиновых кислот и нуклеотидов. Такая поправка очень важна, когда работают с сырыми экстрактами, но становится менее существенной по мере очистки белков и удаления мешающих веществ. В этом случае достаточно просто определить оптическую плотность при 280 нм. Белки поглощают при 280 нм единственно из-за присутствия в их молекулах остатков тирозина и триптофана (если только они не содержат поглощающих в УФ-свете простетических групп). Так как содержание этих двух аминокислот в белках очень сильно варьирует, коэффициент поглощения, выражаемый обычно как 280 или 280 также варьирует в значительной степени. У большинства белков величина 280 лежит в интервале 0,4—1,5, но имеются белки, занимающие по этому показателю крайние положения в ряду всех известных белков — это некоторые пар-вальбумины и сходные с ними Са +-связывающие белки (0,0), с одной стороны, и лизоцим (2,65) — с другой. Поглощение при 280 нм дает лишь приблизительное представление об истинном содержании белка исключение составляют чистые белки. Если точно известен коэффициент экстинкции чистого белка (он должен быть стандартизирован относительно сухого веса или по крайней мере относительно поглощения при 205 нм — см. ниже), то величина поглощения при 280 нм позволяет точно определить его содержание. По существу, это самый точный метод для определения чистых белков, поскольку в этом случае не требуется производить с ним никаких манипуляций, за исключением соответствующего разбавления. Разумеется, растворитель не должен поглощать при 280 нм, а если он поглощает — необходим точный контрольный опыт. Во время измерений белки не подвергаются никаким вредным воздействиям и не ра зрушаются, поэтому, хотя для точного определения нужно около 1 мг бел- [c.312]

Суспензию митохондрий (1,5 мг митохондриального белка) добавляли (точка М) к раствору, содержащему 0,,3 М маннит, ОмМ калий-фосфатный буфер, pH 7,2, 5 мМ Mg U и 10 мМ K I. После добавления в суспен.зию малата и АДФ устанавливается некоторая скорость поглощения кислорода. Очень четко проявляется контроль скорости дыхания со стороны АДФ. Отношение скоростей иоглощения кислорода в состояниях 4 и 3 называется коэффициентом дыхательного контроля (в данном случае он равен примерно 6). На основании полярографической записи можно рассчитать величину отношения АДФ О, которое эквивалентно отношению Р 0. Общий объем реакционной смеси 3 мл. [c.61]

Удельное и, следовательно, молярное вращение зависят от длины волны света. Это явление называется дисперсией оптического вращения. Его изучение позволило обнаружить конформащюнные изменения белков в процессе их денатурации. В последние годы для изучения конформационных изменений в белках, синтетических полипептидах и нуклеиновых кислотах применяют метод оптического кругового дихроизма. Этот метод основан на различии коэффициентов поглощения левого и правого циркулярно-поляризованного света в зависимости от длины волны. [c.205]

НЫХ значениях pH обнаружены полосы поглощения при 295 нм, которые очень похожи на полосы в спектре п-ацетил-ь-тирозина при pH 10,8 по сравнению с его спектром при pH 7, т. е. на полосы ионизированной фенольной ОН-группы в сравнении с неионизиро-ванной [64]. Таким образом, различия в спектрах белков объясняются ионизацией тирозина. Молярный коэффициент поглощения дифференциальной полосы можно получить из спектра поглощения полностью денатурированного щелочью белка по сравнению со спектром нативного белка, приняв во внимание число тирозильных остатков в молекуле или из измерений, выполненных на модельных соединениях. Существуют некоторые расхождения между значениями, полученными дифференциальным методом, и значениями, сообщенными для различных белков, и эти расхождения трудно объяснить [64, 76]. Кроме того, значение молярного коэффициента поглощения, сообщенное для случая щелочной денатурации, возможно, нельзя прямо применять к измерениям на нативном белке [76]. По-видимому, изменения, наблюдаемые при связывании металла с сидерофилинами, действительно, связаны с изменениями в тирозильных остатках, несмотря на то, что не существует зависимости от числа этих остатков в молекуле белка. Тан и Вудворт [c.347]

Множество проблем, описанных выше для алкогольдегидрогеназы, не являются особенностью этого фермента. Аналогичные трудности могут встретиться для любого металлофермента, если не применять со всей строгостью критерии Вейлли [4], предложенные для идентификации таких ферментов, а именно 1) прочное связывание иона металла белком 2) ловышение -соотношения металл — белок и специфической активности фермента в ходе его очистки 3) постоянное число грамм-атомов металла на моль очищенного фермента и 4) постоянное соотношение между содержанием металла и содержанием кофактора (или его связыванием). Хотя эти критерии вполне применимы для идентификации простых металлоферментов, например алкогольдегидрогеназы из дрожжей, в которой связанный металл и активные центры присутствуют в эквимолярных количествах, они могут привести к ошибкам в более сложных случаях, примером чего может служить история исследований алкогольдегидрогеназы из печени. В последнем случае получению ошибочных результатов также способствовала неопределенность в молекулярной массе и молярном коэффициенте поглощения фермента [91], и надо заметить, что неточность в определении этих параметров также приводит к ошибочному определению соотношения металл — белок. [c.459]

При изучении биологических действий излучения очень важно учитывать различие в пространственном распределении рассеянной энергии при облучении ультрафиолетовым светом и ионизирующим излучением, таким, как рентгеновы лучи. Для ультрафиолетового света коэффициент поглощения зависит от молекулярной структуры поглощающей среды и различен, например, для нуклеиновой кислоты и для белка. Поэтому доза поглощенной энергии в эргах на 1 сл может быть совершенно различной в разных частях облученной хромосомы в зависимости от количества содержащейся в них нуклеиновой кислоты и от стадии цикла деления. Для рентгеновых лучей указанные различия не существуют, так как их поглощение атомами вещества не зависит от типов химических соединений, в которых участвуют эти атомы значительное поглощение рентгеновых лучей в костной и некоторых других тканях связано с тем, что в состав последних входят соединения, содержащие атомы с большими атомными номерами. [c.10]

Большая часть зрительных пигментов содержится в наружных члениках палочек и колбочек, которые можно отделить от остальной части сетчатки путем мацерирования и разделения центрифугированием в растворе сахарозы. При этом пигменты часто выделяются в виде комплексов с дигитонином. Последние состоят из белка, связанного с простетической группой. Окрашенные пигменты в результате освещения могут совершенно выцвести и разложиться на белковый компонент и желтый ненасыщенный альдегид. Собирательное название первого—опсин выделенный из родопсина палочек опсин называется скотопсином. Выделенный из родопсина альдегид называется ретиненом. По оценке Хаббарда, основанной на значении коэффициента поглощения для родопсина (40 600 при 5000 А), пигмент палочек составляет приблизительно 20% всей массы белка его молекулярный вес—40 ООО. [c.184]

Исследования показали, что коэффициент поглощения дез-оксигенированного гемоглобина человека (молекулярная масса равна 64 600) в водном растворе при pH 7 и длине волны 430 нм равен 53,2 м моль . Оптическая плотность [i)=-lg(///o)] при пропускании света той же длины волны через кювету с толщиной исследуемого раствора белка 1 см равна 0,108. Определите концентрацию дезоксигенированного гемоглобина в растворе. [c.158]

Это наиболее простой и быстрый метод измерения количества белка в содержаищх его нерассеивающих растворах. Преимуществами метода является быстрота и неизменность пробы до и после анализа. К недостаткам следует отнести то, что метод не является строго количественным, так как основан на поглощении тнрозиновых, фенилаланиновых и триптофановых остатков. Поэтому различные белки имеют разные коэффициенты поглощения, а если белок не содержит вышеуказанных аминокислот, то он не будет поглощать при 280 нм. Метод применим для измерения концентраций белка и в растворах смесей белков. [c.139]

Ошибки измерений количества белка по поглощению в УФ-области (при определении площади пиков на профиле элюции) были Оценены для 10 различных белков. Каждый из белков (10 мкг) хроматографировали на колонке 10-мкм Aquapore RP300, определяли площадь пиков, а затем количество белка по калибровочным кривым (разд. VI, В), причем предполагалось, что выход белка составляет 100%. Ошибки в определении, которые можно было ожидать для каждого белка, исходя из его коэффициента экстракции, сопоставляли с реальными ошибками для каждого определения (табл. 6-1). Реально полученные значения ошибок отражают в основном потери белка при хроматографии. Оценки выхода белка, сделанные по количественным определениям при обоих длинах волн, хорошо совпадали для БСА, карбоангидразы Б, каталазы и цитохрома с (разница <11%). Для остальных белков различия выхода составляли 25—54%. Небольшие расхождения значений могут иметь место из-за небольших неточностей при определении площадей пиков. Более значительные несоответствия могут объясняться различиями коэффициентов экстинкции белков в растворителях, используемых для элюции (H l/2-пропанол или ТФК/ацетонит-рил, pH 2), и в 12 мМ НС1, pH 2. [c.125]

Максимум поглощения о-дианизидина, ковалентно связанного с белками, лежит в области минимального поглощения гемсодержащих белков, что уменьшает ошибку при расчете малых степеней модификации СООН-групп. Кроме того, для гемопротеинов молярный коэффициент поглощения в области полосы Соре после присоединения о-дианизидина не изменяется. Это позволяет определять концентрацию модифицированного белка, как и нативного, спектрофотометрически по поглощению в области полосы Соре. [c.116]

Определение белка проводят спёктрофотометрически, учитывая, что поглощение раствора фермента при 280 нм зависит от количества НАД+, связанного с белком. Существуют следующие соотношения между Л280М260 и коэффициентами экстинкции [c.254]

Изменения активности некоторых белков коррелируются, как правило, с изменениями ряда физических свойств. Так, изменение формы белковой молекулы можно установить по изменению некоторых гидродинамических характеристик (например, коэффициента трения, инкремента вязкости), по изменению светорассеяния, поверхностных свойств, диффузии через полупроницаемые мембраны и скорости седиментации [90]. Изменения термодинамических свойств (энтальпии и энтропии), объема, растворимости, оптического вращения, поглощения в инфракрасной области, дифракции электронов, а также некоторые другие характеристики, приведенные Каузманом [90], используются для Оцейки изменений формы белковых молекул. Большинство этих измерений было проведено па макромолекулах неизвестной структуры, для которых не была установлена последовательность аминокислотных остатков. В настоящее время благодаря усовершенствованию методов деградации белков, аналитического определения Концевых групп, методов разделения и идентификации отдельных фрагментов можно успешно изучать белки с молекулярным весом порядка 20 ООО. Хотя эта работа еще не достигла молекулярного уровня, тем не менее она дает возможность лучше использовать значения физических констант белковой молекулы известной структуры для объяснения механизма взаимодействия фермента с субстратом. Структура такого белка, как фиброин (белковое вещество натурального шелка), в настоящее время хорошо изучена благодаря сравнению рентгенограммы и ИК-спектров нативного волокна с рентгенограммами [35, 38, 108, 140] и ИК-спектрами [168] небольших фрагментов белка известной структуры, полученных при деградации, а также синтетитегаихпмшнептидо [c.386]

Спектрофотометрическое обнаружение белков и пептидов в растворах заключается в измерении поглощения при длине волны, соответствующей максимальному поглощению. Большинство белков содержит остатки тирозина, фенилаланина и в меньшей степени остатки триптофана, характеризующиеся максимумом поглощения в коротковолновой части спектра. В этой же части спектра располагаются полосы поглощения, характерные для пептидной связи, а-спирали пептидной цепи, дисульфидных связей, остатков цистина и др. На практике наибольший интерес представляет широкая полоса поглощения в области 275— 280 нм, характерная для остатков тирозина и триптофана. Поглощение белков в области выше 280 нм сильно зависит от pH среды, что связано с ионизацией гидроксильных групп остатков тирозина в сильнощелбчной среде, вызывающей изменение коэффициента экстинкции и сдвиг максимума поглощения в более длинноволновую часть спектра. Изменение коэффициента экстинкции тирозина в зависимости от pH среды приведено в табл. 35.7. [c.456]

В видимой области поглощают только хромопротеиды, т. е. белки, о содержащие в своем составе пигмент. Примерами хромопротеидов являются белки, содержащие так называемый гем — порфириповое кольцо с ПОНОМ железа. Все эти белки — красные пли ярко-оранжевые. Сюда относятся гемоглобин, миоглобин, цитохромы, каталаза и перокспдаза). В ультрафиолетовой области все белки, кроме протами-нов, имеют широкую полосу поглощения вблизи 275—278 т х. Эта полоса целиком объясняется поглощением света сопряженными ядрами тирозина, фенилаланина, триптофана. Коэффициент экстинкцпи каждого данного белка вблизи 280 Ш ,1 зависит от содержания в нем хромофорных групп, содержа- [c.61]

Хьюм и др. [38] показали также, что окислительная активность митохондрий, выделенных из яблок (особенно из ткапи кожицы), повышалась на протяжении климактерического периода, причем это повышение начиналось за несколько дней до того, как усиливалось выделение СО2 в целом плоде. (Митохондриальную активность измеряли по поглощению кислорода и выделению углекислоты при добавлении сукцината и малата.) Это наблюдение наряду с тем фактом, что во время климактерического периода несколько возрастало содержание белка, привело Хьюма и его сотрудников к предположению, что в этот период происходит синтез ферментов (пируватдекарбоксилазы и малик-фермента), причем энергия, необходимая для этого синтеза, поступает за счет повышенной митохондриальной активности. Исследователи предположили, далее, что причиной конечного падения интенсивности дыхания до величины, которая остается затем почти постоянной (пока не наступит полный распад ткани), является недостаток кислотного субстрата, необходимого как для цикла Кребса, так и для малик-фермента. Нил и Хьюм [64] показали, что дыхательный коэффициент у дисков из сильно перезревших [c.488]

Взаимодействие белков с лигандами, как правило, существенно изменяет физико-химические характеристики компонентов системы наблюдаются изменения в спектрах поглощения и флуоресценции лиганда и белка, изменения спектров кругового дихроизма. В этом плане достаточное развитие получили хромофорные метки центров связывания. Перенос молекулы из водной сферы в сферу центра связывания сопровождается изменением сольвата-ционных взаимодействий переносимой молекулы. Кроме того, лиганды могут образовывать специфические комплексы, сопровождающиеся существенными изменениями спектральных характеристик, например комплексы с переносом заряда. Как правило, коэффициенты экстинкции этих комплексов достаточно высоки (10 —10 М" см ). Это позволяет хорошо спектрофотометрически детектировать их концентрации [c.213]

Изучение ультрафиолетового поглощения также позволяет предположить, что РНК в рибосомах имеет вторичную структуру, сходную со вторичной структурой нуклеиновой кислоты в свободном виде. Коэффициенты экстинкции (рассчитанные но отношению к молярному содержанию фосфора) как свободной РНК, так и рибо-нуклеонротеида при 255 m i (при этой длине волны поглощением белка можно пренебречь) равны между собой (e jj — 8100) и увеличиваются при возрастании температуры до 85° [339, 365]. Далее, гиперхромные эффекты, наблюдаемые при гидролизе рибосом и РНК щелочью или ферментом до нуклеозид-З -фосфатов, идентичны и их величина равна 41% при 260 мц [341]. Нагревание свободной РНК приводит к увеличению оптического поглощения на 29 о, причем это возрастание происходит обратимо. Идентичность гиперхромных эффектов у рибосом и изолированной РНК является веским доводом (но не доказательством) в пользу того, что конфор- [c.629]

ПЛОТНОСТИ при длине волны 295 нм, при которой коэффициент экстинкцин увеличивается при ионизации на 2300 см ммоль [45]. Это изменение вызвано смещением максимума и увеличением интенсивности длинноволновой полосы поглощения. Поскольку кривая титрования гидроксильной группы фенола может быть определена спектрофотометрически, кривую титрования аминогруппы определяют при вычитания кривой титрования фенольной группы из кривой суммарного титрования фенольной и аминогрупп. Этот же спектральный метод был применен для определения степени титруемости тирозиновых остатков в различных белках [46]. Аналогичную процедуру, основанную на спектральных изменениях, сопровождающих ионизацию меркаптанов, можно использовать для титрования цистеина (см. разд. 4.5), Если хромофор, измененный в результате присоединения или отщепления протона, приобретает способность поглощать в видимой области спектра и соответственно изменять цвет, то это позволяет использовать соединение, содержащее такой хромофор, в качестве цветного индикатора pH (см. разд. 4.3). [c.526]

Присутствие белков в высоких концентрациях усиливает поглощение при 492 ммк, но максимум поглоп1,ения соответствует большим длинам волн. Влияние этих примесей можно почти полностью исключить для этого после завершения реакции реакционную смесь встряхивают с равным объемом хлороформа. Чтобы удалить эмульгированный х горо-форм из водной фазы, жидкость центрифугируют или оставляют на ночь для отстаивания [9] и спектрофотометрпруют водную фазу. Оптическая плотность, обусловленная гексозамииом, возрастает примерно на /3 по сравнению с первоначальной. Точность количественного определения увеличивается при применении дихроматических измерений при 492 и 520 ммк. Разность />490 — -Опго только на 25% меньше, чем 492, и является линейной функцией концентрации гексозамина. Величина коэффициента экстинкции для п-галактозамина на 5%1 меньше его величины для ю-глюкозамина. Окраска раствора устойчива. [c.51]

Следующие данные полезны для характеристики фракции PP-L. Раствор в воде (10 мг в 3 мл) поглощает при 280 ммк (0,50 0,05) отношение поглощения при 255 ммк к поглощению при 280 ммк равно 0,7. Препарат осаждается как однородное вещество, седиментациопный коэффициент его в 0,15 М растворе хлористого калия 5°,, 10,5 содержит 4,2% азота, 27% п-галактозамина и 15% белка при электрофорезе по методу свободной границы или в крахмальном блоке движется как однородное вещество и легко разрушается щелочью с образованием хондрои-тинсульфата. [c.345]

Поглощение ультрафиолетового излучения. Большинство белков поглощает ультрафиолетовое излучение с длиной волны около 280 тр. Было показано1 [91—94], что это поглощение обусловлено тирозином, триптофаном и (в меньшей степени) фенилаланином. Таким образом, величина поглощения зависит от содержания этих аминокислот в белке. Измерение оптической плотности белкового раствора при 280 пу служит удобным и точным методом определения концентрации белка [95], если известен коэффициент экстинкции и в растворе нет других веществ, поглощающих свет с этой длиной волны. Рассматриваемый метод можно также применять для приближенного измерения общего содержания белков в смеси в тех случаях, когда допустимо использование среднего коэффициента экстинкции. Метод имеет то преимущество, что на поглощение света не влияют растворенные соли и многие другие вещества и что, следовательно, определение можно производить на образцах белковых фракций без всякой специальной их подготовки, Анализ производится быстро, причем требуются всего лишь доли миллиграмма белка. [c.20]

В литературе имеются сведения о коэффициентах экстинкции ряда очищенных белков [85, 95—99]. Необходимо всегда указывать условия проведения измерений, особенно ширину полосы поглощения, которая несколько влияет на значение коэффициента эк-е-тинкции. Длина волны, соответствующая максимуму поглощения, также незначительно изменяется от белка к белку. [c.21]

Из общих соображений предполагается, что полоса поглощения хромофора при уменьшении поляризуемости среды будет сдвигаться в область более коротких волн (голубой сдвиг). Это дает основание предположить, что процесс денатурации, вызывающий перемещение хромофора из внутренней части структуры нативного белка в более водоподобную среду с меньшим коэффициентом преломления, обусловит сдвиг в область более коротких волн [498]. Такой результат можно было бы ожидать, если заряженный ион образовывался бы (как это было показано на соответствующим образом выбранных модельных системах) вблизи [c.174]