Колориметрические методы количественного определения белка

Для количественного определения белка используют колориметрические и спектрофотометрические методы, в некоторых случаях пользуются определением белка по содержанию общего азота в препарате. [c.29]

Для количественного определения может быть использована биурето-вая реакция, хотя в случае пептидов также наблюдается положительный результат. Реакция основана на образовании фиолетового медного комплекса, интенсивность окраски которого (540 — 560 нм) может быть измерена колориметрически. Гораздо более высокую чувствительность имеет метод Лаури [62], в котором при участии остатков Тгр, Туг и Су8 образуется комплекс белка с фосфомолибденовой кислотой и медью. Это наиболее часто применяемый колориметрический метод определения малых количеств белка. Образующийся голубой комплекс (максимум абсорбции при 750 нм) достаточно устойчив для количественного определения. В качестве стандартного белка служит сывороточный альбумин. Предел обнаруживания 5 — 10 мкг/мгл раствора. Определению по методу Лаури мешают трис- [c.355]

Интегрирование кривых поглощения при 280 нм является несколько менее надежным методом количественного определения белка из-за значительных вариаций коэффициентов экстинкции белков при этой длине волны. Если исключить из рассмотрения данные для лизоцима, который имеет исключительно высокий коэффициент экстинкции при 280 нм, среднее значение отклонений для измерений при 280 нм снизится до 38%, что укладывается в среднее значение ошибок (в процентах) для трех колориметрических тестов. Тем не менее наиболее точным методом количественного определения белков при ВЖХ следует признать регистрацию поглощения при 205 нм. Определение площади пиков на профилях, полученных при длине волны 280 нм, можно использовать при больших количествах наносимого белка или в тех случаях, когда применяются растворители, имеющие высокое поглощение при 205 нм. [c.127]

Вводные пояснения. Существует несколько методов количественного определения белков в растительных и животных тканях колориметрический, спектрофотомет-рический, а также по количеству азота, содержащегося в чистом препарате белков после минерализации последнего. [c.175]

Разработанные впоследствии (к 1930 г.) методы количественного определения аминокислот, главным образом колориметрические, позволили определить до 100% аминокислотного состава белка. В последнее время для исследования состава белка стали применять новые методы химические, микробиологические, энзиматические и т. д. Среди них особое значение приобрел метод распределительной хроматографии . [c.705]

Определение азота трудоемко и требует особого оборудования, поэтому для количественного определения белка был разработан ряд колориметрических методов. В тех случаях, когда необходимо определить общее содержание белка во многих образцах, обычно применяют методы, в основу которых положены биуретовая и нингидриновая реакции. [c.323]

Триптофан обычно определяют в белках, которые пе подвергались гидролизу [165, 186]. Однако в последнее время были сделаны попеки стабилизации его молекулы, а также молекулы тирозина, цистеина и метионина при помощи реакции восстановления, которой предшествовала реакция десульфурации [92]. Кроме того, был разработан количественный метод колориметрического определения аминокислот в гидролизатах, полученных при действии селенитов щелочных металлов [56]. [c.392]

Для установления количественного состава входящих в гликопротеин моносахаридов и аминокислот биополимер подвергают полному кислотному гидролизу, и состав гидролизата определяют обычными методами количественного анализа. Пептидные связи устойчивее гликозидных по отношению к кислотам, поэтому для полного расщепления на мономеры гликопротеины приходится гидролизовать в более жестких условиях, чем обычные полисахариды (6 н. НС1, 100—ПО °С, 24 ч) . Нужно иметь в виду, что как сахара, так и аминокислоты могут частично распадаться в условиях кислотного гидролиза, причем в ряде случаев можно с помощью ХОЛОСТЫХ опытов внести соответствующие поправки при анализе. Специфической для гликопептидов побочной реакцией в условиях кислотного гидролиза является возможная конденсация сахаров с аминокислотами, приводящая к окрашенной сложной смеси различных веществ, в том числе простейших карбонильных соединений (так называемая реакция Майяоа). Например, по данным Готшалка , потеря аминокислот при кислотном гидролизе богатых сахарами гликопротеинов может составлять до 30 %. Количественное определение моносахаридов проводят с использованием хроматографии, спектрофотометрической и колориметрической техники (см. гл. 14). Для анализа аминокислот применяют обычно методы, хорошо известные из химии белка. Так, количественный анализ аминокислотного состава проводят в автоматических анализаторах или с помощью газо-жидкостной хроматографии . [c.567]

Определение сахаров в гликонротеине нуждается в подходе, несколько отличающемся от того, который используется при анализе аминокислотного состава белков. Во-первых, все методики количественного определения данного сахара требуют освобонедения моносахарида из его глпкозида либо в отдельной предварительной стадии, либо в общей части используемой аналитической процедуры. Это объясняется тем фактом, что, вообще говоря, единственными функциональными группами, присутствующими в углеводной части гликопротеинов и обнаруживаемыми физическими или химическими методами до гидролиза, являются гидроксильные группы, общие для всех типов сахаров. Конечно, имеются также карбоксильные группы сиаловых кислот, обусловливающие сильно кислотный характер гликопротеинов, содержащих остатки сиаловых кислот. С другой стороны, боковые цепи аминокислотных остатков обычно свободны, сильно отличаются по структуре и реакционной способности и многие из них могут быть обнаружены и определены количественно физическими или химическими методами. Так, измерение поглощения в ультрафиолете применяется для определения тирозина и триптофана с помощью специальных методик можно отличить цистеин от цистина, а аргинин и гистидин можно определить колориметрическими методами, причем все это выполняется на интактном белке. [c.195]

Содержание общего белка в сыворотке крови практически здоровых людей составляет у взрослых — 65-85 г/л, у детей до 6 лет — 56-85 г/л, у новорожденных— 53-89 г/л. Из колориметрических методов количественного определения белка особого внимания заслуживает биуретовый метод, основанный на биуретовой реакции. В щелочной среде ионы меди образуют с белками комплексы фиолетового цвета. Интенсивность окрашивания в определенных пределах пропорциональна концентрации белка. Содержание белка устанавливается по интенсивности светопоглощения при 540-560 нм фотометрически. Для расчета количества белка в исследуемом растворе необходимо пользоваться калибровочным графиком, построенным по стандартным растворам белка. [c.42]

Доступность функциональных групп белка по отношению к химическим реагентам широко обсуждалась в связи с явлением денатурации. Так как в настоящей статье рассматриваются лишь реакции неизмененных белков и преимущественно реакции очищенных нативных белков, то этот вопрос возникает вновь. Прежде для модификации белка применялись относительно жесткие условия обработки, приводившие к денатурации, а часто и к сопутствующему ей возрастанию числа реакционноспособных групп. В настоящее время разработаны такие методы замещения, которые предотвращают это явление. Однако при определении кажущейся степени замещения важно обеспечить именно полную денатурацию. Примером может служить работа Миллера, посвященная исследованию значения денатурации вируса табачной мозаики для определения числа фенольных групп в различных производных указанного вируса [34]. В этом случае при определении хромогенной способности оказалось необходимым добавлять мочевину для уменьшения мутности раствора. Однако было найдено, что обычный и ацетилированный вирусы более чувствительны к денатурации мочевиной, чем фенилуреидо-, карбобензокси-, га-хлорбензоил- и бензолсульфопроизводные вируса. Натрийдодецилсульфат обусловливает равномерную скорость денатурации, но в случае некоторых производных достигается гораздо меньшая степень замещения по сравнению со степенью замещения, получаемой при применении мочевины. Результаты этих наблюдений заставляют обратить особое внимание на вопрос о надежности колориметрических методов количественного определения фенольных групп. Указанная проблема обсуждалась различными авторами (см. статью III) [18, 19, 35]. [c.275]

Онределение тирозина стандартным ионообменным методом обычно не вызывает больших затруднений, не считая возможности разложения тирозина в процессе гидролиза, особенно в присутстви углеводов (см. стр. 128). Было показано, что для белков с очень низким содержанием тирозина, таких, как коллаген и желатин, нужны специальные методы количественного определения, так как наблюдается недостаточное разделение тирозина и фенилаланина [371. Кобетт и сотр. [1121 сравнили величины, полученные нри ионообменной хроматографии, с данными двух других методов — специально модифицированного колориметрического метода, включающего реакцию с а-нитрозо-р-нафтолом, и метода прямого поглощения в ультрафиолетовой области. Последний метод был осуществлен так, как описано для триптофана, причем белок растворяли в щелочи и измеряли оптическую плотность раствора при двух длинах волн. В случае желатина, не содержащего триптофана, оптимальными длинами волн для определения тирозина служат 292 и 304 ммк. Вводится поправка на мутность раствора. [c.149]

На САМ удобно оценивать количественно содержание фракций. САМ, предназначенную для колориметрических определений, пропитывают парафиновым маслом, например Shell Whitmore Oil 120, или уксусной кислотой, при этом САМ становится прозрачной, и на ней можно измерять поглощение и отражение. Поскольку САМ растворима в ряде органических растворителей, при проведении некоторых количественных определений можно использовать это ее свойство. Полученные растворы можно анализировать, колориметрически или сцинтилляционным методом. Для иммуннодиффузии и иммуноэлектрофореза САМ можно применять даже без агара. Разделяемые на САМ соединения, как правило, дают узкие зоны, что позволяет для большинства типов разделений уменьшить общую длину пути до 6—12 см. Миграция на меньшее расстояние приводит к сокращению длительности электрофореза и меньшему уширению зон под влиянием диффузии. В результате разделение, например, сывороточных белков можно осуществить при градиенте поте.ч-циала в 20—25 В/см за 60—90 мин. [c.293]

Работы ло качественному и количественному определению аминокислот, входящих в состав белка, проводились в течение многих лет. Большинство классических методов, основанных на оригинальных исследованиях Косселя, Фишера, Осборна, Форе-мана и других, были правиметрическими и требовали выделения аминокислоты ли одного ив ее производных. Обширная литература по этому вопросу свидетельствует о громадных трудностях, сопутствующих таким исследованиям. Применение классических методов ограничивалось в значительной степени тем, что для исследований требовались большие количества белка (100 г или более). Существовавшие в то время колориметрические методы нельзя было проверить путем анализа аминокислотных смесей, составленных специально для данной цели ввиду отсутствия чистых аминокислот (не было методов для надежной оценки их чистоты). [c.209]

С нингидрином реагируют не только а-, но и р- и у-аминокислоты, а также аминосахара, пептиды, белки, амины, аммиак, мочевина, креатин и другие ампносоединення. Кроме того, разные аминокислоты дают окрашивание различной интенсивности. Поэтому колориметрический нин-гидринный метод применим для количественного определения только индивидуальных аминокислот и не пригоден для суммарного определения смеси аминокислот, а также в случае сложных биологических смесей, где могут присутствовать аммиак и другие аминосоединештя. В помет,епии, где проводится определение, не должно быть следов аммиака. [c.44]

Для микроопределения триптофана в белках и бактериях предложена модификация колориметрического метода Сюлливана и Гесса [397]. Образование соединения с желто-зеленой флуоресценцией при действии на триптофан непосредственно в белках хлорной кислоты в присутствии бихромата при комнатной температуре является, повидимому, специфической реакцией [401]. Описано применение этой пробы в более ранней модификации для количественного определения триптофана в негидролизованных белках, дающее результаты с точностью до 5% [350 а]. Определение лизина по окраске, образуемой фенольным реагентом после бромирования, хотя и не специфично, однако было использовано с соответствующей поправкой на гистидин при исследовании основной фракции, выделенной на пермутите [360]. [c.162]

Впервые у-карбоксиглутаминовая кислота Gla была обнаружена в протромбине, позже — в других белках и моче для ее количественного определения были предложены различные методы аминокислотный, анализ [134, 145, 146, 179, 182, 234, 361], ГЖХ [247], колориметрический анализ (в интервале 0,5-10 5х Х10-4 моль/л) [290] и ВЭЖХ [205, 206]. [c.264]

Для определения качественного и количественного состава аминокислот белка дрожжей, активного ила и других биомасс предназначен метод, основанный на колориметрическом определении количества каждой аминокислоты, выделенной хромато-графией на бумаге. Мономерные аминокислоты определяют после их экстракции из пробы горячей водой. Полимерные аминокислоты, составляющие макромолекулы белка, предварительно гидролизуют [75]. Для выделения аминокислот проводят нисходящее, многократное хроматографирование двумя растворителями. Проявителем служит слабокислый раствор нингид-рина, который с аминокислотами дает сине-фиолетовое соединение (ДИДА) по уравнению [c.217]