Гель-фильтрация агароза

При разделении нуклеиновых кислот используют те же методы, что и при фракционировании белков, однако имеются ограничения, обусловленные большим диапазоном величин молекулярной массы (2-10 —Ы0 ° Да), отклонениями от глобулярной формы, различиями в четвертичной структуре (двухнитевые, однонитевые, кольцевые), значительным отрицательным зарядом в нейтральной области pH. Поэтому методы гель-фильтрации и ионообменной хроматографии не получили широкого распространения при фракционировании нуклеиновых кислот и значительно уступают ультрацентрифугированию и электрофоретическому разделению в геле агарозы, полиакриламидном геле или их смеси. Поскольку величина отрицательного заряда нуклеиновых кислот и продуктов их расщепления мало зависит от pH, а отношение заряда к молекулярной массе сохраняется практически неизменным, разделение нуклеиновых кислот при электрофорезе определяется не их зарядом, а размером молекул. При наличии маркеров с известной молекулярной массой возможно определение молекулярной массы препаратов нуклеиновых кислот и их фрагментов. [c.171]

Л. 6 выделяют из микросом путем центрифугирования клеточного гомогената при ускорении 105 000 g с послед, осаждением белков сульфатом аммония. Индивидуальные белки получают фракционированием с помощью хроматографии (в т. ч на гелях агарозы, содержащих ковалентно иммобилизованные фосфолипиды, и гель-фильтрацией на сефадексе), а также изоэлектрич. фокусированием в градиенте pH. Активность Л. б. определяют по перераспределению метки (изотопной, спиновой или флуоресцентной см. Липидные зонды) между донорными мембранами, содержащими меченые липиды, и немечеными акцепторными мембранами. [c.598]

При определении молекулярной массы с помощью гель-фильтрации [70, 73] применяют сефадексы различного типа (0-50, 0-100, 0-150, 0-200), агарозы (сефарозы 2В, 4В, 6В) или полиакриламиды (биогели Р-100, Р-150, Р-300). Процесс проводят как в хроматографических колонках, так и на тонкослойных пластинках. Принцип метода уже рассматривался в разд. 3.3. [c.361]

Рис. 38.12. Гель-фильтрация смеси нуклеиновых кислот КВ-клеток и Р-РНК полиовируса на колонке с 1%-ной агарозой [123].

Рис. 8. Количественный анализ 78 (1) и 115 (2) иммуноглобулина А в геле агарозы после гель-фильтрации на сефадексе 0-200.

Рис. 9. Фракционирование сыворотки человека тонкослойной гель-фильтрацией на сефадексе 0-200 с последующим электрофорезом в геле агарозы, содержащем антисыворотку к а-липопротеину. Направление гель-фильтрации указано стрелкой.

Приведенные примеры ясно показывают, что тонкослойная гель-фильтрация в сочетании с иммунной преципитацией является простым и удобным методом, который может дополнить иммуноэлектрофорез при идентификации белков в биологических жидкостях или при выделении белков. В случае необходимости чувствительность и разрешение метода можно повысить, выполняя электрофорез после тонкослойной гель-фильтрации в геле агарозы, содержащем антитела. [c.275]

Гель-фильтрация восстановленных полипептидных цепей в 6М гуанидингидрохлориде позволяет производить оценки молекулярного веса в диапазоне 80000—1000 [147]. В поддиапазоне 40 000—10 000 точность метода 7% и на краях диапазона — 10%. В качестве среды для гель-фильтрации используют колонку Био-Гель А-5М с номинальным содержанием агарозы 6%. Определение молекулярного веса осуществляется по принципу сравнения с белками-маркерами известного молекулярного веса на полулогарифмическом графике зависимости молекулярного веса от коэффициентов распределения либо от где Ve — объем элюирования и Уо — исключенный объем (см. разд. 5.3 и 5.5). [c.427]

Выбор концентрации агарозы, т. е. пористости ее геля, диктуется размерами фракционируемых макромолекул. Средний размер пор 2%-ного геля агарозы приблизительно соответствует диаметру сферически упакованной молекулы биополимера с массой 50 млн. дальтон. Гели с более высоким содержанием агарозы используют для гель-фильтрации. При электрофорезе поры геля должны быть легко проницаемы для молекул биополимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрическом [c.19]

С помощью гель-фильтрации на сефадексе, агаре или агарозе из раствора вируса удаляют примеси небольших молекул. Экстракт наслаивается иа вершину колонки гранулированного геля, уравновешенного соответствующей средой. Частицы вируса, не проникая внутрь гранул геля, будут двигаться через колонку быстрее, чем низкомолекулярные вещества, которые могут проникать в гранулы. Гель-фильтрацию обычно используют ка последнем этапе очистки вируса. Этот метод удобен также для некоторых вирусов, которые должны быть быстро удалены из первичного осветленного экстракта, так как обеспечивает замену растворителя, в котором находится вирус. Колонка с сефадексом 0-100 диаметром 5 см и длиной 50 ом обладает достаточной емкостью для нанесения 200 мл осветленного экстракта [1671]. [c.43]

Скорость фильтрации на колонках с сефадексами и агароз ными гелями...................... [c.55]

Полученные так суммарные препараты нуклеиновых кислот фракционируют далее, используя более тонкие методы, такие, как хроматография, в том числе аффинная, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, распределение в двухфазных полимерных системах, ультрацентрифугирование, электрофорез и др. Большинство этих методов рассмотрено в гл. II и при работе с нуклеиновыми кислотами отличается лишь в деталях. В итоге получают препараты индивидуальных нуклеиновых кислот. [c.190]

На трех соединенных последовательно колонках того же типа недавно удалось разделить сходные по молекулярной массе и заряду легкие цеии миозина после обработки его 4 М раствором мочевины. Элюцию вели 0,2 М К-фосфатным буфером в присутствии 2 М мочевины со скоростью 67 мл/см -ч разделение занимало 2,5 ч. Для такого же разделенпя гель-фильтрацией на агарозе требуется около 9 сут IWatabe et al., 1983]. [c.156]

Пример 3. Очистка ДНК-полимеразы а из зародыша цыпленка [Yamagu hi et al., 1982]. Аффинной хроматографии здесь также предшествовали четыре стадии ионообменной хроматографии и гель-фильтрация. Сорбция фермента на голубой агарозе в этом [c.421]

Эти ионообменники получают на основе носителей для гель-фильтрации - поперечно-сшитых декстранов (сефадекс) или агароз (сефароза СЬ, биогель А). Они обладают свойствами ионообменников и гель-фильтрующих материалов и гораздо меньшей обменной емкостью к молекулам, превышающим по своим размерам предел эксклюзии ионообменника в условиях эксперимента. Из-за наличия заряженных групп степень набухания таких смол и, следовательно, предел эксклюзии варьируют в зависимости от pH и ионной силы (нехарактерным для гель-фильтрующих материалов образом). [c.437]

Молекулярно-ситовая хроматография. При данном виде хроматографии используется способность материалов с контролируемой пористостью сортировать и разделять компоненты смеси в соответствии с размерами и формой их молекул. Для осуществления процесса гель-хроматографии используются гели поперечно-емкостного декстрана (сефадексы и сефакрилы), поперечно-сшитые полиакриламидные гранулы (биогели), агарозные гели с выраженными в них цепями акриламидного полимера (ультрагели) и более жесткие поперечно-сшитые агарозы (СЬ-агарозы и сефакрилы-8), с помощью которых можно быстро разделить макромолекулы в соответствии с их размером. Степень удерживания растворенного вещества на колонке зависит от его способности проникать в поры геля. Поэтому при гель-фильтрации сначала выходят высокомолекулярные вещества, а затем вешества в порядке убывания их моле- [c.55]

Создание метода гель-фильтрации на гелях сшитого декстрана (сефадекс) дало в руки исследователей новый принцип разделения водорастворимых соединений — фракционирование по величине молекул [1]. Область применения гелей сефадексов охватывает веш ества с молекулярным весом от 100 до 300 000. По-видимому, полиакриламидные гели, введенные в употребление Хьертеном. и Мосбахом [2], обладают аналогичными свойствами. Дальнейшее расширение возможностей метода связано с созданием сферических гелей агарозы различной пористости [3] (см. разд. 5.7.1). В настоящее время гель-фильтрация находит широкое применение, особенно в различных областях биохимии (см. обзор Детермана [4]). [c.256]

К настоящему времени накоплен определенный опыт работы на сефадексах 0-25, 0-200, но совершенно нет данных относительно использования 0-10 и 0-15. Ряд экспериментов на полиакриламидных гелях выполнены Радолой [66, 67]. Так, он показал, что на био-геле Р-300 достигается лучшее разделение фер-ритина, чем на сефадексе 0-200. Особенно интересно расширить область применения тонкослойной гель-фильтрации путем освоения гелей агарозы. В этом случае удалось бы фракционировать вещества с молекулярным весом до 1 000 000 и выше. Предварительные опыты с 4—10%-ной (вес/объем) сферической агарозой показали, что такая методика вполне осуществима [45]. Действительно на геле агарозы были получены очень четкие зоны, к тому же оказалось, что при высыхании на пластинке агароза дает более равномерную пленку, чем сефадексы. [c.268]

Иммунологическая количественная оценка компонентов после гель-фильтрации возможна главным образом при осуществлении несколько модифицированного метода Манчини [58]. В этом случае после гель-фильтрации проводят иммунодиффузию в геле агарозы, содержащем антитела. Существенным моментом в этой методике является создание надежного контакта геля агарозы с гелем сефадекса при сохранении полученной картины разделения. Это удается осуществить, осторожно помещая 1,5%-ный гель агарозы размером 10-10 см на слой сефадекса. По-видимому, этот метод найдет применение при количественном анализе белков, способных к образованию полимеров. На рис. 8 приведен пример количественного анализа высокомолекулярного секреторного JgA в присутствии мономера JgA [59]. [c.272]

Те же авторы [359] проводили на сефадексах 0-100 и 0-200 двумерное разделение соединений, входящих в состав сыворотки крови человека. При этом в одном направлении проводили разделение методом гель-фильтрации, а в перпендикулярном направлении — разделение методом электрофореза. Моррис [360, 361] разделял на сефадексах 0-100 и 0-200 белки с молекулярной массой до 180 000. Он кондиционировал сефадекс в течение 48 ч, а затем выдерживал пластинки в про-явительной камере 18 ч для достижения равновесия. В 1962 г. Доун и Краузе [357] применили сефадекс для тонкослойного электрофореза белков. Сефадекс 0-50 ( тонкий ) смешивали с избытком буферного раствора (1 7,5) и выдерживали в нем 24 ч, после чего буферный раствор отфильтровывали и полученный гель, который был пластичным, но не жидким, переносили на стеклянные пластинки, снабженные бортиками. Фей-зелла и сотр. [362] описали разделение белков на сефадексах 0-25, 0-100 и 0-200. Сефадекс выдерживали при перемешивании 30 мин в подходящем буферном растворе, затем давали смеси отстояться и сливали жидкость. Эту операцию повторяли пять-шесть раз, с тем чтобы общее время контакта с буферным раствором было не менее 48 ч для сефадекса 0-25 и не менее 72 ч для сефадексов 0-100 и 0-200. Вендрили и сотр. [363] увеличивали твердость слоев сефадекса для электрофореза, добавляя к ним агарозу. Для этого 1,25 г агарозы растворяли в 65 мл буферного раствора и осторожно добавляли 4 г сефадекса 0-200, 5 г сефадекса 0-100 или 6,5 г сефадекса 0-75, предварительно приведенных в равновесие с буферным раствором. [c.80]

Для гель-фильтрации используются так называемые молекулярные сита — инертные гидратированные полисахаридные материалы, представляющие собой пористые гранулы. Их получают на основе декстрана (сефадекс — бактериальный полисахарид), агарозы (из некоторых морских водорослей) или полимеризованных акриламид-ных гелей (акрилекс). [c.58]

Молекулярную массу интактного олигомера определяют в неденатурирующих условиях с помощью методов ультрацентрифугирования, гель-фильтрации и электрофореза в градиенте полиакриламидного геля (ПААГ). Устойчивость и растворимость большинства олигомерных белков зависит от ионной силы и pH буферного раствора. В отличие от электрофореза в ПААГ,. где на состав буферных растворов накладываются определенные ограничения, в част1юсти ионная сила не должна превышать 0,1, гель-фильтрацию можно вести в буферных растворах стабилизирующих олигомер (например, в присутствии ионов металлов или кофакторов). Для определения молекулярной массы белков применяют классический вариант гель-фильтрации на сшитых декстранах, полиакриламиде или агарозе. В последнее время получены гели нового типа, позволяющие вести процесс при повышенном давлении, благодаря чему время анализа сокращается с 1—2 сут до 30 мин (гл. 6). [c.17]

В качестве матрицы в аффинной хроматографии наиболее широко используется агароза. Это очиш,енный линейный содержащий галактозу (рис. 1) аэрогель-ксерогелевый коллоид, выделяемый или из агара или непосредственно из содержащих агар морских водорослей. Агароза характеризуется хорошей гелеобразующей способностью она относительно биологически инертна и поэтому удобна в качестве носителей не только для аффинной хроматографии, но также и для гель-фильтрации. Агар и агароза — не синонимы, и различные агарозные препараты также могут значительно отличаться друг от друга по своим физико-химическим свойствам. Некоторые агарсодержащие морские водоросли приведены в табл. 1. [c.11]

В некоторых случаях мы наблюдали утечку МКА с колонки при элюировании антигена. При этом МКА и антиген после элюирования отделялись друг от друга с помощью гель-фильт-рации. Иногда вместо гель-фильтрации элюат пропускали через аффинную колонку с антииммуноглобулиновыми антителами. В последнее время мы используем антитела, присоединенные к сефарозе L-4B, и совсем не наблюдаем утечки антител, вероятно, благодаря применению перекрестносшитого геля агарозы. Вообще в нашей практике утечка антител никогда не была серьезной проблемой. [c.180]

В настоящее время применяют ряд усовершенствованных методов разделения нуклеиновых кислот на фракции из суммарного препарата, полученного описанным методом. Это прежде всего хроматография на геле фосфата кальция, ионообменная хроматография (в качестве адсорбентов используют ДЭАЭ-целлюлозу, ДЭЛЭ-сефадекс и др.), ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, хроматография по сродству на белковых носителях, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, гель-электрофорез и др. [c.97]

За последние десять лет разработан принципиально новый хроматографический метод фракционирования макромолекул, вирусов и компонентов клетки, который широко используется в аналитической и препаративной биохимии, Этот метод основан на способности пористых материалов, работающих по принципу обратных молекулярных СИТ)), разделять смесь веществ по размеру и молекулярному весу компонентов. Эти молекулярные сита почти не обладают сорбционным сродством к фракционируемым веществам. В качестве таких пористых материалов применяют гранулированные гели полисахаридов (сефадексы, агароза), полиакриламида (биогели) и пористое порошковое стекло. Метод подобного фракционирования обычно называют молекулярно-ситевой хроматографией, молекулярной фильтрацией или гельфильтрацией. [c.125]

Физические и химические свойства агарозы. Агар, т. е, агар-агар, согласно Араки [168, 169], состоит из двух компонентов агаропектина и агарозы. Агаропектин — это полисахарид, содержащий 6% сульфатных групп, виноградную и глюкуроновую кислоты. Агаропектин образует гель при концентрации 1,1%, Содержащиеся сульфатные группы в агаропектине придают агару ионообменные свойства. Поэтому, чтобы исключить нежелательные побочные эффекты при гелевой фильтрации, агаропектин должен быть [c.141]