Введение радиоактивной метки в белки

Введение радиоактивной метки. Каждая субъединица исследуемого белка должна содержать по крайней мере один аминокислотный остаток, по которому можно ввести радиоактивную метку. С целью повышения чувствительности рекомендуется вводить метку по нескольким точкам. Введение метки [c.60]

Введение радиоактивной метки в вирусные белки в зараженных РСВ клетках [c.142]

Итак, из всех рассмотренных химических методов введения радиоактивной метки в белки удобнее всего, эффективнее и безопаснее с точки зрения сохранения активности белка исполь- [c.248]

Предельная чувствительность достигается введением радиоактивной метки в исследуемый образец. После фиксации (обычно путем замораживания геля) полосы белков, содержащие чрезвычайно малые их количества, можно детектировать с помощью методов радиоавтографии в любое удобное для исследователя время. [c.327]

Исследование клеточного метаболизма с помощью радиоактивных предшественников белков и нуклеиновых кислот удобно осуществлять на культурах клеток. Введение метки при этом происходит через питательную среду. Аминокислоты, как правило, хорошо проникают через наружные мембраны клеток и исполь- [c.263]

А. Белки в теле нейрона метят путем одноразового введения меченой аминокислоты (импульсная метка). Б. Некоторые из радиоактивных белков перемещаются по аксону с постоянной скоростью от 1 до 5 мм в сутки. В. Через несколько дней выявляются два пика радиоактивности, содержащие различные компоненты цитоскелета. Более быстрый пик содержит актин, а также много других белков, в том числе такие, которые обычно считают растворимыми белками цитоплазмы. [c.128]

Существуют три основных методических подхода для решения этой задачи. Первый способ — избирательное окрашивание нейронов, выделяющих определенный нейромедиатор, может осуществляться с помощью преобразования естественного медиатора в его флуоресцирующее производное. В этом случае флуоресценция определенных групп клеток поможет выявить специфические связи в структурах мозга. Второй экспериментальный подход связан с введением молекул медиатора, предварительно меченного радиоактивным изотопом. Нейронные окончания, содержащие исследуемый медиатор, способны избирательно захватывать метку. Затем их легко выявить методом авторадиографии. Третий способ обнаружения специфических связей в нервной системе состоит в использовании высоко специфичной способности узнавать либо антигенные детерминанты медиатора, либо определенные ферментные белки, участвующие в метаболизме нейромедиаторов, либо нейрорецептор-ные компоненты на мембране клетки. Последние считаются наиболее убедительным свидетельством в пользу существования конкретных нейрохимических взаимодействий межцу клетками и зонами мозга. Обычно для иммунохимической идентификации используют флуоресцентный краситель или изотоп, который маркирует антитела. В последние годы широко распространились методы, использующие антитела, меченные частицами тяжелых металлов, например коллоидного золота, железа и др. [c.224]

Лучший радиоактивный предшественник для введения метки в белки вируса гриппа — [ 5]-метионин. Если необходимо получить меченые вирионы, клетки перед заражением следует в течение ночи инкубировать в среде без метионина, чтобы обеспечить максимально эффективное включение метки. После заражения к клеткам добавляют среду, содержащую 200 мкКи/мл [ Sj-метионина, и через 24 ч после заражения собирают меченый вирус. [c.195]

Определение и в опытах на животных по сравнению с определением этого параметра в клетках бактерий, культурах клеток эукариотов и бесклеточных системах осложняется следующими обстоятельствами. При введении животным меченой аминокислоты 1) удельная активность аминокислотного пула не сохраняется постоян- ной 2) имеют место большие индивидуальные колебания величин включения радиоактивных предшественников 3) 1м существенно отличается от 1мж. поскольку некоторое время затрачивается на поступление метки во внутриклеточный аминокислотный пул и прекращение синтеза белка после удаления исследуемого органа. Кроме того, хотя это условие не является обязательным, кинетику синтеза полипептидных цепей удобнее исследовать на стационарной стадии мечения (1м 1с). [c.278]

Изучение белка с высокой радиоактивностью, выявляемой после импульсного введения метки в аденому островковой ткани поджелудочной железы, привело к открытию проинсулина (непрерывной линией показана радиоактивность, прерывистой - оптическая плотность при 280 нм). [c.290]

Использование гель-фильтрации для освобождения от радиоактивных предшественников неоднократно цитировалось при описании методов введения радиоактивной метки в белки и нуклеиновые кислоты [Остерман, 1983]. Нередко обессоливание используют и на заключительном этапе очистки для освобождения не только от соли, но и от прочих низкомолекулярных примесей. Например, в одной из работ по выделению РНК-полимеразы очисткой белка на биогеле А-1,5т завершалась целая серия операций, включавшая различные варианты переосаждений белка и ионообмениой хроматографии [Vaisius, Horgen, 1979]. [c.138]

Остерман Л, А. Введение радиоактивной метки в белки//Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэдектрофорезом и радио-иэотопными методами/Под ред. Г. П. Георгиева. М., 1983. С. 236. [c.327]

Белки эффективно концентрируются с помощью электрофореза в ПААГ [63, 196, 276, 277, 382] или изотахофореза [283J. Применение электрофоретической процедуры для концентрирования макромолекул путем осаждения [308] или извлечения белков из неионных растворов с использованием мембран [3] может осложняться необратимой сорбцией белка иа мембране. С этой проблемой сталкиваются также и при работе с жидкими мембранами [384, 385] (см. дальше). Белки из разбавленного раствора (100—800 нг/мл) были выделены осаждением после введения радиоактивной метки с помощью [ Н]-1-фторо-2,4-ди-иитробензола [280]. Для снятия белков с ДЭАЭ-целлюлозы в высококонцентрированной форме использовался карбоксиметил-декстран [367]. [c.246]

До проведения ферментативного гидролиза образец белка должен быть денатурирован и остатки цистеина в нем превращены в гидрофильные производные. С этой целью дисульфидные связи в белке предварительно восстанавливают дитиотреитом [37] и цнстеины модифицируют иодоуксусной кислотой (для введения радиоактивной метки используют [ С] иодоуксусную кислоту), иодоацетамидом [31], этиленимином [66] или окисляют надмуравьиной кислотой [30]. Выбор реагента определяется общей стратегией исследования. Более подробно реакции модификации рассмотрены в гл. 2. [c.349]

Введение радиоактивной метки в белок ферментативным путем удается осуществить в тех случаях, когда он способен фос-форилироваться с помощью соответствующей (чаще всего цАМФ-зависимой) протеинкиназы. Донором радиоактивного фосфора служит [у Ф]-АТФ, который поставляется с УА до 5000 Ки/ммоль. Метод используется не для получения меченого белка, а для исследования самого фосфорилирования. Например, с его помощью недавно было показано, что на один моль суммарного препарата гистонов включается 0,33 моль Р, в то время как для гистона Н1 включение достигает уровня 0,85 моль [Knight, Skala, 1979]. [c.249]

При введении радиоактивного изотопа в виде простого химического соединения в живой организм образуются более сложные продукты, содержащие радиоактивный атом. Биосинтетический способ получения меченых соединений применяют в тех случаях, когда химический синтез этих веществ слишком сложен. Этот способ был использован для метки многих природных соединений, например белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот, пуринов, пиримидинов, витаминов, гормонов, стероидов, алкалоидов, терпенов, карбоновых кислот, аминокислот, жиров и жирных кислот из радиоизотопов чаще всего применяют и Р -. Биосинтезы приводят обычно к неспецифически меченным соединениям с низким выходом требуемого продукта. Однако, если большая часть образующихся меченых соединений может быть использована для различных целей, то их биосинтез экономически выгоден. [c.683]

Эта реакция лежит в основе широко используемого метода обнаружения шиффовых оснований в белках и введения изотопных меток. Например, можно использовать меченный изотопом альдегид или амин либо ввести радиоактивную метку, используя Н-содержащий боргидрид натрия (так называемый бортритид) для восстановления в реакции (7-39). Последующий гидролиз белка (кислотный или ферментативный) позволяет установить, с боковой группой какой аминокислоты был связан субстрат, а частичный гидролиз позволяет локализовать центр связывания в пептидной цепи. [c.144]

Эти два белка можно использовать для получения важной информации о механизме сопряжения между компонентами циклазной рецепторной системы. Благодаря их способности -К ADP-рибозированию удалось идентифицировать Ns и N во многих тканях посредством введения в эти N-белки радиоактивной метки с помощью [ P]NAD в качестве субстрата и их ауторадиографической детекции после электрофореза. [c.279]

При иодировании тирозина последовательно образуются моно- и дииодтирозин (соответственно МИТ и ДИТ). Введение второго атома иода протекает с более высокой скоростью, по этому ДИТ является основным продуктом реакции. Степень замещения и распределение иодтирозина в пептидах, полученных после гидролиза белка, определяют по включению радиоактивной метки, а также методом дифференциальной спектрофото-метрии. [c.353]

В организмах человека и животных происходят процессы синтеза различных органических веществ. Следует, однако, отметить, что процессы синтеза в этих организмах не столь разнообразны, как в зеленых растениях, и известным образом ограничены. Следует подчеркнуть, что животные организмы неспособны использовать энергию солнечных лучей для синтеза органических соединений. Из этого отнюдь не вытекает, что в организме животных не используется для синтеза углекислый газ, вода и аммиак. Уже с давних пор известно, что выделяющаяся нз организмов человека, млекопитающих животных, амфибий и рыб мочевина синтезируется из углекислого газа, воды и аммиака применение метода меченых молекул позволило выявить участие воды, углекислого газа и аммиака в процессах синтеза сложных органических веществ — составных частей организма. После введения в организм животных тяжелой воды можно обнаружить тяжелый водород (дейтерий) в составе жиров, углеводов, белков и других веществ организма. Введение в организм животных карбонатов, меченных i позволяет проследить, как различные органические вещества приобретают радиоактивную метку, благодаря включению в их состав углерода углекислого газа. После введения в организм животных аммонийных солей, меченных стабильным изотопом азота (N ), появляется в составе белков и других азотистых веществ. Все эти данные с несомненностью показывают, что в организме животных для синтеза органических веществ используются минеральные вещества — аммиак, вода и углекислый газ. Было бы, однако, ошибочным считать, что в организмах животных и в зеленых растениях отсутствуют различия в использовании минеральных веществ для синтетических целей. Различия эти прежде всего количественного характера. Объем использования углекислого газа, воды и аммиака для синтеза органических веществ в организмах животных, но сравнению с организмами зеленых растений, незначителен. Далее обращают на себя внимание и различия качественного характера-, ряд веществ, синтезирующихся в растениях, вовсе не синтезируются в организмах человека и животных, и эти вещества должны доставляться человеку и животным в готовом виде с продуктами питания. Так, оргагшзмы человека и животных не способны к синтезу ряда аминокислот, входящих в состав белков, не могут синтезировать различные витамины и т. д. Отсутствие этих веществ в пище приводит к их гибели. [c.235]

Первое затруднение связано с обезличенностью радиоактивного излучения. Например, если в результате некоего эксперимента мы регистрируем излучение радиоактивного изотопа углерода, то само это излучение никоим образом не информирует нас о том, находятся ли атомы радиоактивного углерода в молекулах интересующего нас белка или в каких-то посторонних для данного эксперимента примесях. Природа этих примесей зависит не только от способа очистки препарата, но и от метода введения радиоактивности в интересующие нас биополимеры. Если оно осуществляется естественным путем биосинтеза в организме животного, которому с диетой или в виде инъекции ввели низкомолекулярные радиоактивные предшественники , то не во власти экспериментатора проконтролировать все процессы метаболизма, в которых эти предшественники могут быть использованы. Если же радиоактивная метка вводится в уже очищенный биологический препарат in vitro химическим или энзиматическим путем, то, помимо возможности побочных реакций, всегда существует проблема полного отделения продукта от использованных в реакции исходных радиоактивных соединений. В связи с этим методам введения радиоактивных изотопов в молекулы биополимеров и способам очистки продуктов такого введения от радиоактивных загрязнений будет уделено значительное внимание. [c.155]

В тех случаях, когда желательно свести до минимума разбавление радиоактивной метки в пуле целого организма и неопределенность уровня поступления ее с кровотоком к данному органу, можно воспользоваться перфузией. Например, меченую аминокислоту можно вводить в печень мыши in situ через портальную вену (под наркозом). Спустя определенное время после такого импульсного введения метки всю тушку животного надо быстро охладить в ледяной воде, а затем извлечь печень для анализа включения меченой аминокислоты в белки [Sato et al., 1979]. [c.263]

Лиф [22] показал, что механизм метаболизма 2М-4Х подмаренником цепким Galium aparine заключается в разрушении боковой цепи, хотя только 7% метки из 2М-4Х-1- С или 2М-4Х-1- С, введенной в растение, выделяется в виде СОг. Тем не менее большая часть радиоактивного углерода из боковой цепи 2М-4Х отщепляется от арильной группы и включается в компоненты клетки, например в крахмал, белки и нуклеиновые кислоты. Степень разрушения боковой цепи в результате оказывается большей, чем получается по данным о декарбоксилировании. Вайнтрауб и сотр. [32] показали, [c.13]