Детергенты тритон

В зависимости от целей эксперимента в каждом конкретном случае выбирается не только определенный тип детергента, но также подбираются оптимальные условия его действия в отношении мембранного фермента (концентрация, время и температура обработки, количество мембранного материала) При выборе оптимально действующей концентрации детергентов следует помнить, что в определенных условиях они склонны к образованию агрегатов — мицелл, эффективность действия которых отличается от эффективности мономерных форм детергентов. Концентрация, выше которой происходит образование ми-целлярной формы детергентов, называется критической концентрацией мицеллообразования (ККМ). Так, для неионного детергента тритона Х-100 (м. м =643 Да) и анионного детергента дезоксихолата натрия (м. м. = 420 Да) величины ККМ соответственно равны 0,24 и 5 мМ. [c.370]

Рпс. 3.11. Солюбилизация мембраны неионным детергентом тритоном Х-100. Детергент размещается на гидрофобном участке белка и замещает мембранные липиды. Если концентрация детергента ниже его ККМ, белок сам образует мицеллы или агрегаты, которые часто выпадают в осадок, [c.84]

Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи. Метод характеризуется высокой чувствительностью (10—100 мкг белка в пробе). На развитие окраски влияет большое количество веществ компоненты буферных систем (трис-буфер в концентрации 0,2 мМ, глицилглицин), восстановители (цистеин, дити-отреитол в концентрации 0,01—0,4 мМ, аскорбиновая кислота), комп-лексоны (ЭДТА в концентрации 0,5 мМ), детергенты (тритон Х-100 в концентрации 0,1—0,2% вызывает выпадение осадка), сернокислый аммоний в концентрации 0,15%, сахароза в концентрации 10% и др. [c.81]

Детергент (тритон-Х-100) — 10%-ный раствор. [c.444]

Получают митохондрии печени крысы согласно описанию на с. 406. В кювету с постоянным перемещиванием, содержащую 3 мл среды инкубации, помещают К+ Чувствительный электрод и, установив перо самописца на середину шкалы, калибруют чувствительность прибора внесением 4—6 добавок раствора КС1 с точно известной концентрацией (по 20—30 мкМ). В другой пробе в среду инкубации вносят суспензию митохондрий (3—5 мг белка на 1 мл пробы), 5 мкМ ротенон и регистрируют в течение 1—2 мин концентрацию К+ во внешней среде. В пробу добавляют валиномицин (около 0,1 нмоль на 1 мг белка), измеряют концентрацию ионов К+ во внешней среде и рассчитывают скорость его диффузии в стационарном состоянии. Внесением 2,4-динитрофенола (100 мкМ) индуцируют выход ионов К+ во внешнюю среду. Содержание эндогенного К+ в митохондриях определяют добавлением к суспензии митохондрий в среде инкубации раствора детергента (тритон-Х-100) до конечной концентрации 0,1%- Изменения концентрации К+ в среде рассчитывают по калибровочной кривой. [c.444]

К осадку прибавляют дистиллированную воду из расчета 2 мл на 1 мл клеток, добавляют 1 каплю раствора детергента тритон 100 и смесь тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Наступает быстрый лизис эритро- [c.7]

Обычно максимумы можно устранить, добавляя органические поверхностно-активные вещества типа желатины или некоторых красителей. Для подавления максимумов часто используется неионный детергент тритон Х-100 в виде 0,2 %-ного раствора, который обычно добавляют в количестве 0,1 мл к 10 мл исследуемого раствора, находящегося в полярографической ячейке. Не следует добавлять слишком много поверхностно-активного вещества, так как в этом случае возможно искажение или даже подавление волны вместе с максимумом и сдвиг потенциала полуволны на несколько милливольт по сравнению с нормальной величиной. [c.344]

В связи с этим неионные детергенты более удобны для исследования влияния добавок на ККМ и гидрофобные взаимодействия. На рис. 21 показано изменение ККМ неионного детергента тритона Х-100 в зависимости от концентрации нескольких добавок и [c.349]

Сукцинат убихинон-редуктаза (СУР) катализирует окисление сукцината убихиноном. По данным электрофореза, в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия фермент состоит из 3 —4 полипептидов. Субъединицы с молекулярными массами 70 000 и 28 000 Да представляют собой собственно сукцинатдегидрогеназу, в субстратсвязывающем центре которой происходит дегидрирование сукцината низкомолекулярные компоненты комплекса И (м. м. ок. 15 000 Да) придают сукцинатдегидрогеназе реактивность по отношению к убихинону, чувствительность к специфическим ингибиторам и, по-видимому, принимают участие в связывании фермента с мембраной. Выделение препарата СУР основано на экстракции фермента из мембраны с помощью неионного детергента тритона Х-100 и концентрировании препарата охлажденным ацетоном. Дальнейшее фракционирование сульфатом аммония и очистка на кальдий-фосфатном геле позволяют получить фермент в высокоочищенном состоянии с каталитической активностью около 25 мкмоль окисленного сукцината в 1 мин на [c.423]

Раствор С применяется для экстракции труднорастворимых белков. 10 см неионного детергента Тритон X - 100 растворяют в растворе А и доводят объем до 1 дм . [c.374]

Для выделения внутреннего нуклеопротеида вирионы обрабатывают теми веществами, которые разрушают их внешние оболочки. С этой целью применяют липидные растворители (эфир), анионные детергенты (додецилсульфат и дезоксихолат натрия), неионные детергенты (тритон Х-100 и различные типы твинов). [c.173]

Исследуют влияние детергентов — тритона Х-100 и дезоксихолата натрия —на гидролазную активность глюкозо-6-фосфатазы. Для активации фермента используют детергенты в концентрациях 0,01— [c.373]

Перенос электронов по дыхательной цепи митохондрий завершает цитохромоксидаза (цитохром сЮг-оксидоредуктаза, комплекс IV), катализирующая реакцию восстановления молекулярного кислорода до воды. Донором электронов для фермента служит ферроцитохром с. Реакция специфически блокируется цианид- и азид-ионами, а также окисью углерода. Цитохромоксидаза прочно связана с внутренней мембраной митохондрий и является интегральным мембранным белком в раствор фермент может быть высвобожден лишь после растворения мембраны высокими концентрациями детергентов. В нативной мембране, а также в растворах неионных детергентов (тритон Х-100, твин-80, Emasol-1130) цитохромоксидаза присутствует в виде высокоактивного димера. Некоторые воздействия (рН>8,5, высокие концентрации солей и неионных детергентов) вызывают появление мономерных форм фермента. Каталитическая активность цитохромоксидазы зависит от степени агрегации молекулы фермента. [c.432]

Выделяют митохондрии из печени крысы. В кювету рН-метра наливают 4,5 мл среды измерения активности (п. 2) и погружают отмытый рН-электрод. Через 2—3 мин в кювету вносят 20—50 мкл суспензии митохондрий (2—4 мг) белка. Убеждаются в том, что нативные митохондрии не катализируют реакцию гидролиза АТФ в отсутствие разобщителя. Через 1 мин после внесения митохондрий в кювету добавляют динитрофенол до конечной концентрации, равной 0,1 мМ. Внесение разобщителя приводит к снятию трансмембранного электрохимического потенциала ионов водорода и активации реакции гидролиза АТФ. Измерение повторяют, в кювету после добавления митохондрий вместо динитрофенола вносят детергент тритон Х-100 до конечной концентрации 0,1%- Наблюдают, как и в случае динитрофенола, стимуляцию реакции. Выбирают концентрацию тритона (в интервале от 0,02 до 2%) дегя проявления максимальной ферментативной активности. [c.460]

I или II, получают при обработке хлоропластов не только дигитонином., но и другими детергентами (тритон X-I00, додецилсульфат натрия), воздействием ультразвука, механическим разрушением ( Vernon et al., 1967 Островская и др., 1969 Boardman, [c.191]

Тонг и Глесман [95] исследовали влияние неионного детергента тритона Х-100 на константы диссоциации ряда фенолов 21 и [c.312]

ВОДОЙ (табл. 14). Поскольку значения для 21 и 22 (за исключе-нием 21 в) ближе к соответствующим значениям Ф, был сделан вывод, что нейтральные формы красителей солюбилизуются во внутренних слоях мицеллы, где они находятся в среде, близкой по своим свойствам к н-октанолу. На основании данных о влиянии концентрации К на а, р и Ф можно сделать предположение, что анионы солюбилизуются в слое Штерна, причем противоионы находятся на поверхности мицелл и в объеме растворителя. Данные по влиянию неионного детергента тритона Х-100 на константы диссоциации 21 и 22 приведены в табл. 15. Сопо-0,8 ставление этих результатов с влиянием ионогенных ПАВ на константы равновесия ароматических индикаторов того же типа [97, 104, 243] показывает, что электростатические факторы меньше влияют на распределение этих веществ между двумя фазами в случае неионных ПАВ и что увеличение или уменьшение констант диссоциации связано прежде всего с различиями в характере окружения солюбилизованных частиц, а также с [c.314]

Наши первые исследования белкового состава миелина были посвящены изучению микрогетерогенности белков, извлеченных последовательно неионным детергентом — тритоном Х-100 и анионным детергентом — додецилсульфатом натрия. Приступая к выполнению этих исследований, мы руководствовались следующими соображениями. До последнего времени нейрохимики изучали преимущественно растворимые белки нервной ткани. Очень мало работ было посвящено нерастворимым белкам различных структур нервной ткани, в том числе и такой специфической мембранной структуре, какой является миелин. Между тем роль нерастворимых белков в процессах внутриклеточного обмена веществ и в транспорте ионов и метаболитов через мембраны не менее важна для функций клетки, чем роль растворимых белков гиалоплазмы. [c.24]

Название свободные полирибосомы не совсем точно отражает истинную ситуацию, так как на деле они не могут свободно диффундировать в цитоплазме, поскольку ассоциированы с клеточным цитоскелетом. Если клетки обработать неионным детергентом (тритоном) в гипертоническом буфере, то больщая часть липидов и растворимых белков удаляется, оставляя цитоске-летный каркас , связанный с остатками ядра. Этот каркас представляет собой сложное сплетение фибрилл. Все свободные полирибосомы ассоциированы с цитоскелетом, как это можно увидеть на электронной микрофотографии, приведенной на рис. 9.11, или определить при помощи биохимического фракционирования. [c.127]

Вполне понятно, что легкие и тяжелые фрагменты не представляют собой чистые фотосистемы I и II, а лишь в той или иной мере обогащены ими, чем и объясняется смешанный характер спектров флуоресценции (рис. 17). Вслед за Бордма-ном фрагменты хлоропластов, обогащенные фотосистемами I и II, были получены рядом авторов (Вернон, Митчел, Шлык и др.). Они использовали для дезинтеграции хлоропластов не только дигитонин, но и другие детергенты (тритон Х-100, додецилсульфат натрия), ультразвук, а также простое механическое раздробление хлоропластов. Затем фрагменты разделялись методами гельэлектрофореза или ультрацентрифугирования в градиенте плотности. [c.77]

Классической работой по электрофоретическому разделению белков мембран эритроцитов человека является исследование Фейрбанкса и соавт. (1971), в котором предложена номенклатура полипептидных полос, выявляемых в солюбилизированной с помощью додецилсульфата натрия (ДСН) мембране. Этой номенклатурой пользуется в настоящее время большинство ученых. Наличие сетчатой структуры, выстилающей внутреннюю поверхность мембраны эритроцита, было обнаружено непосредственно с помощью электронной микроскопии после обработки клеток неионным детергентом тритоном Х-100. При определенных экспериментальных условиях (в среде с высокой ионной силой и при низкой температуре) применение этого детергента позволяет полностью солюбилизировать липидный бислой и интегральные белки. При этом остается сеть белков, сохраняющая исходную форму клетки, которая представляет собой мембранный скелет (каркас) эритроцита. Он тестируется в виде двухмерной сети филаментов, длина которых зависит от особенностей приготовления препарата для микроскопии. Необходимо отметить, что белки, близкородственные компонентам цитоскелета эритроцитов, обнаружены в ряде неэритроидных клеток. В связи с универсальностью данной системы следует более подробно рассмотреть структуру и свойства некоторых цитоскелетных белков. [c.31]

Выбор детергента для выделения и очистки определенного мембранного белка осуществляется методом проб и ошибок, однако исследователи стремятся к использованию минимальных концентраций детергента с целью сохранения нативного структурно-функционального состояния изучаемого белка. Наиболее эффективными считают неионные детергенты (тритон Х-100, ок-тилглюкозид), соли желчных кислот (холат, дезоксихолат), цвиттерионные детергенты. [c.225]

Для выделения мембранных белков широко используют детергенты, способные замещать липидную часть липопротеидов. Показано, что дезоксихолат натрия солюбилизирует 60—80% мембранных белков [828]. Миллер [869] сообщил, что в присутствии неионного детергента тритона Х-100 растворяются все белки мембран эритроцитов [869] однако, согласно более поздним данным [287, 761], этот агент освобождает лищь часть мембранных белков. TpHTOii Х-100 не вызывает инактивации ферментов [77, 1190], и в его присутствии можно проводить как ИЭФ [875], так и электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН [287]. [c.316]

К надосадочной фракции прибавляют гель гидроокиси алюминия С р так, чтобы отношение белка к гелю было 1 1. Перемешивают 40 мин, центрифугируют (10000 д, 5 мин). Осадок отбрасывают. Надосадочная фракция, представляющая собой очищенный фермент, содержит около 1 % моноаминоксидазной активности исходного гомогената (табл. 4). Концентрация детергента тритона Х-100 в растворах очищенных ферментных препаратов составляет 0,5—1,0 %, [c.29]

К полученной суспензии митохондриальных мембран добавляют бензиламин НС1 до конечной 3 мМ концентрации и суспензию подвергают действию ультразвука при помощи дезинтегратора УЗДН-1 (Харьковский завод) при 35 кГц при 8°С в течение 6—10 мин. Сразу после окончания воздействия ультразвуком суспензию переливают в охлажденную ступку и по каплям, при тщательном перемешивании пестиком, добавляют 30% водный раствор неионного детергента тритона Х-100 до конечной 1,5% концентрации. После стояния в течение 1 Va ч при комнатной температуре суспензию центрифугируют при. 4°С (160000 g, 100 мин). Полученный солюбилизированный раствор фермента желто-коричневого цвета содержит 70% активности, имевшейся в митохондриях. Процедура солюбилизации сопровождается, как правило, только очень незначительной очисткой, примерно в 1,2 раза (см. табл. 5, стадия 2). [c.31]

Приготовленный таким образом иммуносорбент переводят в 0,01 М фосфатный буфер (pH 7) с 0,15 М Na l, заполняют им небольшую колонку, на которую и наносят антисыворотку или иммуноглобулины, растворенные в том же буфере. Колонку хорошо промывают фосфатным буфером, но с удвоенной концентрацией соли, а иногда и с добавкой 1—2% неионного детергента Тритона Х-100 —все это для снятия неспецифически сорбированных белков. Элюировать антитела с колонки можно 0,1 М уксусной кислотой или 4,5 М раствором Mg b. Затем следуют завершающие операции нейтрализации, диализа и, если надо, концентрирования раствора очищенных антител. Колонку регенерируют, хорошо промывая посадочным буфером, и хранят на холоду с добавкой 0,1% азида натрия. [c.111]

М фосфатный буфер, pH 6.8—7.4, а также 0.001—0.002 М ЭДТА. Концентрацию клеток в суспензии можно варьировать в пределах 5 10 —5 Ю клеток в 1 мл буферного раствора. Разрушение клеток достигается 3-кратным замораживанием—оттаиванием, пропусканием через шприц или введением в пробу за полчаса до нанесения на гель неионного детергента, Тритона Х-100, в концентрации до 1.0% [5]. Процедура замораживания—оттаивания может привести к частичной дезактивации ферментов, однако ЛДГ и Г6ФДГ выдерживают такую обработку, и их пробы могут храниться не менее года при —70 °С [6]. Экстракция детергентом значительно повышает [c.98]

В литературе неоднократно появлялись сообщения об использовании лоаерхностно-активных веществ для деконтаминации клеток. Известно, ЧТО микоплазмы чувствительны к действию катионных и анионных детергентов, однако почти все вещества весьма токсичны для клеток. Из семи наименее токсичных для клеток неиоиных детергентов Тритон WR-1339 оказался наиболее эффективным — клетки оставались свободными от микоплазм в течение 7 мес [72]. Катионные детергенты, испытанные нами, подавляли рост микоплазм в агаре, однако при обработке ими клеток положительные результаты были получены лишь в одном случае (клетки ЗТЗ-Ва1Ь) — при выдерживании суспензии клеток в растворе роккала (1 мг/мл) в течение 7—10 мин. Подобную обработку повторяли на протяжении трех пассажей. [c.120]

Рис. 4.10. Скорость забивания некоторых типов мембран, определяемая по уменьшению скорости потока фильтруемой жидкости с увеличением ее объема. В данном случае фильтруемая жидкость представляла собой 0,01 %-ный раствор детергента Тритон Х-400. А — анизотропная мембрана Б — мембрана из смеси эфиров В — полиамидная (найлоновая) мембрана Г — мембрана из поливинилиденфторида (по-видимому, мембрана Дюрапор из гидрофильного материала). (Из работы [124].)

Справочник химика 21

Химия и химическая технология