Бляшки метод

Для скрининга библиотек на основе фага X можно использовать ДНК-зонды или иммунологические методы. Зоны лизиса (бляшки) переносят на фильтр и соответствующим образом тестируют. Если используется ДНК-гибридиза-ция, то вначале удаляют фаговые белки, затем ДНК денатурируют и фиксируют на фильтре. При тестировании иммунологическим методом белки, кодируемые клонированными генами. [c.74]

В 60-х годах были достигнуты важные успехи, открывшие новые пути изучения В-клеток. Первым из ннх была разработка метода локального гемолиза, который позволил идентифицировать и подсчитывать индивидуальные В-клетки, вырабатывающие антитела к определенному антигену. В простейшем варианте этого метода берут лимфоциты (обычно из селезенки) у животного, иммунизированного бараньими эритроцитами (БЭ). Их помещают затем в агар вместе с избытком Ю. В результате на чашке получается газон из иммобилизованных БЭ с вкраплением лимфоцитов. В этих условиях клетки не могут передвигаться, но любые выделяемые В-клеткой антитела будут диффундировать и покрывать поверхность всех БЭ, находящихся поблизости. Такие покрытые антителами эритроциты можно лизировать, добавив комплемент (разд. 17.5). Таким образом, присутствие каждой выделяющей антитела клетки обнаруживается по прозрачному пятну ( бляшке ) в темном слое БЭ. Аналогичный метод можно использовать для подсчета клеток, вырабатывающих антитела к другим антигенам, таким как белки или полисахариды, если присоединить эти антигены к поверхности бараньих эритроцитов. [c.20]

Этот метод используется для количественного учета энтеровирусов в культурах ткани. Термин бляшкообразующая единица , или БОЕ, соогветствует наименьшей концентрации вирусов, которая образует 1 бляшку на монослое клеток. [c.279]

Практически все генетические эксперименты с фагами выполняются без непосредственного наблюдения над родителями и потомством. Для определения фенотипов изучаемых генетических вариантов используют косвенные методы. Как уже говорилось в гл. 4, присутствие фагов обычно устанавливают по их способности убивать заражаемые ими бактерии. О присутствии фагов свидетельствуют стерильные пятна (их называют также негативными колониями или бляшками) в сплошном слое бактериальных клеток на поверхности чашки Петри (рис. 6.1). Видимое на поверхности чашки прозрачное пятно - результат гибели бактериальных клеток-хозяев, зараженных потомством этого фага. Следовательно, прежде чем рассматривать генетику фагов, нам надо познакомиться с методами описания фенотипов мутантных фагов. Более углубленно генетика фагов будет рассмотрена в следующей главе. [c.160]

В основе метода лежит заражение небольшого числа клеток в полном монослое. Вирус, образующийся в зараженных клетках, распространяется вертикально, заражая соседние клетки известны различные способы предотвращения дальнейшего распространения вируса. Дегенеративный эффект вирусов на клетки распространяется до тех пор, пока не обнаруживается видимая область погибших клеток (бляшка). Окрашивание клеточного пласта позволяет легко визуализировать бесцветные бляшки. [c.204]

Наложите исходную чашку с бляшками на пленку. Отберите уколом платиновой проволочкой до восьми бляшек с той области чашки, в которой проявилась гибридизация. Рассейте их методом штрихования сверху до отдельных бляшек, используя по 1/8 чашки для рассева каждой бляшки. Переколите таким образом до четырех обнаруживших гибридизацию областей. Инкубируйте при 37°С в течение по.крайней мере 6 ч. Переколите отдельные бляшки по шаблону, инкубируйте в течение ночи при 37°С. [c.48]

Примерно через 6 ч проявите пленку, экспонированную с фильтром II. Выявите бляшки, соответствующие гибридизации. Отберите их уколом и приготовьте препараты фага на чашках. Используйте чашки с агарозой и следуйте методике 11-П быстрого выделения фаговой ДНК. Выращивайте по одной чашке каждого фага (от одного до шести). После выращивания в течение 6 ч налейте на чашку 5 мл среды для разведения фага Я"и инкубируйте при 5°С в течение 2—12 ч. Если позволит время, то, используя быстрый метод, выделите ДНК из этих препаратов фага. [c.48]

Следует заметить, что при суспендировании отдельной бляшки фага Р22 в 4 мл бульона LB получается суспензия с концентрацией около 10 частиц фага в 1 мл. Поэтому такую суспензию можно использовать как источник фага для получения препарата из отдельной бляшки любого фага Р22 описанным выше методом. [c.63]

Показано, что во многих случаях культуры клеток беспозвоночных более чувствительны к альфа- и флавивирусам, чем новорожденные мышата или культуры клеток позвоночных В особенности это относится к первичному выделению вирусов Если в лаборатории имеются условия для культуральной ра боты, клетки беспозвоночных можно легко нарастить и исполь зевать для постоянной работы с тогавирусами. Для некоторых линий клеток комаров характерна высокая чувствительность к переносимым комарами альфа- и флавивирусам [3, 4], причем многие из этих вирусов способны образовывать бляшки, хотя результаты, по-видимому, до некоторой степени зависят от конкретных условий эксперимента [5], Если какой-либо конкретный метод не дал хороших результатов, имеет смысл попытаться применить другой. Например, обычно клетки комаров для культивирования и выделения вирусов инкубируют при 27—28°С, но в случае вируса денге лучшие результаты получают при повышении температуры до 32 °С [6]. Имеется ряд стандартных клеточных линий, и если размножение вируса не удается в одной из них, имеет смысл испытать другую. Подробные сведения об используемых средах приведены в при ложе- [c.73]

Титром ГА считается максимальное разведение, при котором образующаяся бляшка еще видна невооруженным глазом. Оптимальным значением pH считается то, при котором ГА имеет самый высокий титр. Типичный результат титрования,, проведенного описанным здесь методом, показан на рис. 3.9, [c.93]

Время бляшкообразования под бентонитовым покрытием для различных вирусов неодинаково. Результаты образования бляшек для энтеровирусов, например, учитывают через 36 — 48 ч. Культуральные сосуды переворачивают монослоем вверх, смывая средой дегенерировавшие клетки. Бляшки, образуемые различными типами энтеровирусов, отличаются по величине, интенсивности развития и характеру краев. Поскольку одна вирусная инфекционная частица (вирион) образует одну бляшку, метод бляшкообразования позволяет точно определить количество инфекцио чных единиц в материале, а также измерить нейтрализующую активность вирусных антител. [c.268]

С середины 20-го века начала активно развиваться молодая наука иммунология. Поворотным моментом в ее формировании стали 50-60-е годы, когда бьшо признано, что основным клеточным элементом иммунной системы является лимфоцит. Наиболее плодотворными для иммунологии стали 60-70-е годы, когда на основании многочисленных экснериментальных исследований бьшо сформулировано определение иммунной системы как "совокупности взаимодействующих клеток лимфоцитов, макрофагов, ряда сходных с макрофагами клеток селезенки, организованных в тканевые и органные структуры". Центральными органами иммунной системы признаны костный мозг и тимус, периферическими -селезенка, лимфатические узлы, нейеровы бляшки кишечника, миндалины [1]. С внедрением специфических иммунологических методов исследования в медицинскую практику, созданием клинической иммунологии начали существенно меняться представления о причинах и особенностях патогенеза многих заболеваний. Так, бьшо установлено, что аллергии, некоторые виды анемии, заболеваний щитовидной железы, многие хронические воспалительные заболевания, папилломатоз и многие другие являются следствием нарушений в иммунной системе. Соответственно, начали меняться и подходы к выбору методов лечения заболеваний и направления поиска новых лекарственных средств. Эпидемиологи- [c.394]

Модифицированный метод Илека. К 2,5 мл расплавленной и остуженной до 45 °С основы среды Илека добавляют 0,5 мл стерильной телячьей сыворотки, тщательно перемешивают и выливают в стерильные пластиковые чашки Петри диаметром 45 мм. После застывания агара на его поверхность бляшками засевают испытуемые и контрольные (заведомо токсигенные) культуры коринебактерий. В центр чашки (на расстоянии 9 мм от краев бляшек) на поверхность агара помещают бумажный диск, пропитанный противодифтерийной антитоксической сывороткой (10 МЕ) в другом варианте ту же сыворотку (4,5 МЕ) вносят в лунку, вырезанную в центре агаровой пластинки. После инкубирования при 37 °С в течение 24 —48 ч в агаре между бляшками токсигенных коринебактерий и диском (лункой) отмечают появление тонких линий преципитата (см. рис. 1.26). [c.203]

Определение колифагов. Присутствие колифагов (бактериофагов, паразитирующих на Е. соИ) определяют в воде поверхностных источников и питьевой воде, подготовленной из нее, а также в сточных водах. Они являются индикаторами эффективности охраны грунтовых вод и очистки питьевой воды. Исследование проводят методом агаровых слоев по Грациа (см. рис. 1.10 и цв. вклейку, рис. 12). Для титрования колифагов исследуемую воду смешивают с расплавленным и остуженным питательным агаром, куда вносят также индикаторный штамм Е. соИ. Полученную смесь выливают вторым слоем на питательный агар в чашке Петри и после застывания среды чашку инкубируют при 37 °С 24 ч. В результате индикаторная культура образует равномерный сплошной рост, а при наличии колифагов в этом газоне образуются прозрачные бляшки ( негативные колонии бактериофагу 419 [c.419]

Метод определения ферментации углеводов (сорбит, маннит, арабиноза, раффиноза, лактоза и др.). Агар с соответствующим углеводом и индикатором бромтимоловым синим разливают в чашки Петри толстым слоем, подсущивают, чтобы на поверхности среды не было следов влаги чашку со дна делят на квадраты (по 15—20 квадратов на одной чашке). Испытуемые щтаммы засевают уколом и небольшой бляшкой вокруг него. Инкубируют 18 ч при 37°С. Положительный результат отмечают в случае изменения бутылочного цвета среды в желтый в месте укола и посева. [c.219]

Существует косвенный метод подсчета вирусных частиц в образце, который позволяет определить массу каждой частицы. Этот подход особенно полезен в том случае, когда нет строгого соответствия между числом частиц и их способностью образовывать бляшки . Молекулярный вес вирусных частиц определяют методами седиментации — диффузии и светорассеяния. Умножив его на процентное содержание ДНК в вирусной частице, получают молекулярный вес ДНК. Среди методов, которые используются для определения содержания ДНК в вирусной частице, можно назвать определение фосфора (колориметрически или по величине радиоактивности P ) определение связанной с пуринами дезоксирибозы (колориметрическое) определение тимипа (но радиоактивности Н ) [16] опре-делепие ультрафиолетового поглощения (при этом допускается, что вклады ДНК и белка аддитивны) 1 109] и определение плавучей плотности ви-вируса (исходя из того же предположения). Общее содержание вируса в препарате можно определить по сухому весу, по инкременту показателя преломления [110] и исходя из суммарного содержания белка и нуклеиновой кислоты. [c.238]

Уже в самых первых своих опытах с фагом Д Эррель наблюдал на плотном газоне бактериального роста на поверхности питательного агара стерильные пятна- , или бляшки. Он установил, что такие стерильные пятна представляют собой участки, где бактерии были разрушены колониями бактериофага, развившимися из родительских фаговых частиц, присутствовавших в бактериальном инокулуме. Д Эррель понял, что образование таких легко распознаваемых стерильных пятен может служить для определения числа инфекционных единиц, содержащихся в суспензиях фага. Поэтому он разработал след ющий метод подсчета стерильных пятен, который широко используется и сейчас на поверхность твердого слоя питательного агара в чашке Петри наносят примерно 10 клеток бактерии-хозяина и суспензию фага в соответствующем разведении, которую необходимо протитровать, и чашку инкубируют. [c.254]

Инфекционность облученных нуклеиновых кислот была изучена в экспериментах с ДНК и РНК, изолированных из бактериофагов. Термином инфекционность обозначают способность вирусной ДНК или РНК индуцировать образование бактериальной клеткой новых полноценных фагов. Методически эксперимент выглядит так бактерии обрабатывают лизоцимом, и они теряют часть клеточной стенки — образуются сферонласты, которые можно инфицировать нуклеиновой кислотой, выделенной из бактериофага. Если в инфицированной бактерии возникают новые полноценные фаги, то бактериальная стенка разрывается и из лизировавшей бактерии высвобождается 100—200 бактериофагов количество вирусных частиц, высвободившихся из лизированных сферопластов, в определенных пределах пропорционально количеству молекул ДНК или РНК, сохранивших инфекционные свойства. Так как высвободившиеся фаги лизируют новые сферопласты вблизи места своего -возникновения, то на сплошном газоне бактериальных клеток, выращенных на агаре, образуется пятно лизиса — бляшка (количество бляшек можно подсчитать визуально), — их число служит количественным критерием инфекционности вирусной нуклеиновой кислоты. Этим методом определяют инактивацию вирусной ДНК в результате облучения. Результаты одного из таких экспериментов приведены на рис. 1П-3. [c.63]

Для идентификации и выделения интересующих исследователя клонов разработан метод гибридизации в бактериальных колониях или фаговых бляшках. На колонии бактерий, выращенные на твердой среде, сначала накладывают нитроцеллюлозный фильтр. Бактерии прилипают к фильтру. После лизиса и денатурации под действием NaOH и фиксирования денатурированной ДНК прогреванием фильтр инкубируют в растворе с радиоактивно меченным зондом. По окончании гибридизации фильтр отмывают от избытка зонда и выявляют образовавшийся меченый гибридный комплекс путем контакта с рентгеновской пленкой. Сравнивая положение пятна на радиоавтографе с положением колоний на чашке, выбирают ту из них, которая дала положительный сигнал. Аналогичным образом поступают и при идентификации клонов на основе фаговых векторов. Результатом этих манипуляций является вьщеление искомых индивидуальных клонов (бактериальные колонии или фаговые бляшки). [c.43]

Разработка метода бляшек для вирусов гриппа в клетках фибропластов куриного эмбриона ( EF) [111 117] позволила идентифицировать одношаговые мутанты и установить частоту реверсии [117]. Она привела также к подтверждению более ранних исследований по кросс-реактивации вируса, инактивированного УФ-луча-ми [4, 19, 32, 64J, и, что особенно ван<но, к основанию методов клонирования некоторых бляшкообразующих штаммов вируса 1111]. Позднее использование перевиваемых человеческих клеточных линий расширило перечень вирусов, для изучения которых можно было применять метод бляшек и готовить рекомбинанты, различающиеся по типу образующихся бляшек [121, 122]. Только значительно позднее было установлено, что загадочная неспособность вирусов гриппа образовывать бляшки обусловлена главным образом необходимостью обязательного расщепления вирусного НА эндогенными протеазами клетки хозяина, без чего невозможны инфицирование клетки и репликация вируса [67, 76]. Возможность применения только тех нескольких вирусов (в основном WSN и RWS — вариантов оригинального штамма WS), которые образовывали отчетливые бляшки, значительно ограничивала проведение генетических экспериментов. К настоящему времени установлено, что образование бляшек вирусом WSN, по крайней мере [c.15]

J. Almond [4] выделял мутанты FPV методом увеличения бляшек или спонтанно (Sp-серии), выращиванием с 5-ФУ (mF- e-рии), обработкой вируса дикого типа 100 мкг/мл NTG (inN-серии) или 50 мкг/мл NTG (без обозначения). Он выделил также 5-ФУ-индуцированные мутанты путем сбора и исследования каждой бляшки (US-серии). Его результаты исследования 49 мутантов сводятся к следующему [c.193]

К фенотипическим особенностям вирусов гриппа относятся различия биологической активности в разных клеточных системах хозяина, включая различия в ареале хозяев, органоснецифично-сти и распространенности среди животных, а также в бляшко-образовании в разных культурах клеток. Разработаны надежные лабораторные методы, позволяющие определить происхождение отдельных сегментов РНК у реассортантных вирусов, возникших в естественных условиях или полученных в лаборатории. Это позволило получить ранее недоступную информацию о роли отдельных генов или их комбинаций в возникновении некоторых биологических различий, а также приступить к изучению ряда фундаментальных вопросов сложных молекулярных механизмов, [c.296]

Более точным количественным методом учета от-дега>ных вирусных частиц является метод бляшек (рис. 33). Культуру клеток заражают вирусом и покрывают тонким слоем агара. После инкубирования посевов в течение нескольких суток на агаровом покрытии появляются просветленные участки определенной формы (бляшки), представляющие собой участки погибших клеток в сплошном монослое клеточной культуры. Каждая бляшка образуется при размножении одной вирусной частицы и хорошо заметна в виде круглого светлого участка на красном фоне клеток, прижизненно окрашенных нейтральным красным. Титр вируса, установленный этим методом, выражают числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл. Размеры, морфология и сроки появ- [c.59]

Молекулярное клонирование [34, 39]. Ключевым методом явилось молекулярное клонирование фрагментов ДНК, или генная инженерия в узком смысле слова. Этот метод, впервые описанный П. Бергом в США, позволяет нарабатывать большие количества любого отрезка ДНК, встраивая его в ДНК бактериальной плазмиды или бактериофага и заражая такой рекомбинантной ДНК бактерию-хозяина. Чаще всего в плазмиду или фаг встраивают либо фрагменты эукариотической геномной ДНК, либо кДНК, полученную в результате обратной транскрипции мРНК. Когда работают с плазмидами, то обычно используют такие, которые несут ген устойчивости к какому-либо антибиотику В результате на среде с антибиотиком растут и дают колонии лишь те бактерии, в которые проникли рекомбинантные плазмиды. Когда работают с фагом, то следят за возникновением бляшек, т. е. очагов размножения фага, ведущего в лизису (разрушению) бактерий. Каждая колония или бляшка, полученная из одной исходной клетки, содержит один тип плазмиды [c.30]

Третий метод состоит в использовании хромогенного субстрата с р-лактамовым кольцом (87/312 или нитроцефина). Им можно действовать непосредственно на бляшки или колонии. [c.38]

II. А. Фаг рассеивают штрихом точно так же, как культуры бактерий. Используйте для этого либо чашку для фага Я, либо чашку ЬВ. На чашках для фага к бляшки получаются большего размера. Размер бляшек увеличивается также, если использовать для газона меньше клеток. Поскольку предадсорбция фага не проводится, то акты, инфицирования, приводящие к образованию бляшек, могут быть сильно растянуты во времени. Поэтому размер бляшек может варьировать. В данном случае вариабельность размера бляшек не обязательно указывает на гетерогенность генотипа фага. Этот метод очень удобен для тех, у кого мало опыта, однако он имеет тот недостаток, что на каждой чашке можно провести очистку лишь одного фага. [c.59]

Это одна из наиболее сложных операций. Рекомендуем пользоваться вторым методом (5, б). При расщеплении Xgal -галактозидазой образуется соединение голубого цвета. Фаг, который несет область la , образует в присутствии Xgal голубые бляшки. Такие бляшки остаются голубыми в течение по крайней мере нескольких дней. Так как Xgal не является индуктором, то большинство клеток газона окраски не дает. Фаг с областью la индуцирует синтез -галактозидазы потому, что репрессор этого оперона титруется большим числом копий оператора. [c.119]

Проведите скрининг библиотеки стандартным методом. Целесообразно провести скрининг примерно 20 ООО клонов, используя в качестве зонда рВН322, чтобы определить, не содержат ли некоторые бляшки примесей плазмидных последователь- [c.110]

Сравнение методов определения инфекционности по T IDso и по бляшкам [c.54]

Хотя во всех описанных ниже методах в качестве тест-культуры взяты клетки Vero, однако можно использовать с этой целью ВНК-21, LL MK2, РК15 и другие линии клеток млекопитающих. Первый метод оптимален при исследовании большого числа образцов его легко адаптировать для работы с микропланшетами для титрования, как описано здесь, или с планшетами или чашками большего размера, например для определения морфологии бляшек. В этом случае для титрования используют карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ). Далее описан еще один метод, предполагающий использование агарозы и окрашивание клеток нейтральным красным. Он особенно полезен при работе с вирусными клонами, когда необходимо, чтобы бляшки содержали инфекционный вирус. [c.85]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология