Сывороточные белки определение

I. Определение индивидуальных антигенов в растворе (РИД). Данный -метод обычно используют для определения сывороточных белков, в частности иммуноглобулинов при подозрении на множественную миелому или в случае недостаточности иммуноглобулинов. Можно определять и компоненты комплемента. В основном с помощью РИД определяют любые антигены (при наличии специфических антител), концентрация которых составляет не менее 5 мкг/мл и мол. масса не превышает 10 . Необходим и стандартный препарат антигена. Стан- [c.208]

Пептиды и белки обладают сильным избирательным поглощением в области 210—220 нм. Однако при этом нельзя работать в буферных растворах, включающих карбонил со держащие соединения. Еще более чувствительным является определение пептидов при 192—194 нм, однако при измерении в этой области можно использовать лишь водные растворы фторидов щелочных металлов. По этой причине спектрофотометрическое определение белков в области ниже 210 нм используется крайне редко (лишь в специальных случаях ГПХ). По чувствительности определение белков при 210 нм сопоставимо с колориметрическим методом Лоури, Например, сывороточные белки определяли в концентрации 2 мкг/мл [79]. Поглощение при 210 нм характерно для пептидной связи, и, следовательно, белки имеют одинаковые коэффициенты экстинкции (табл. 35.8). [c.457]

Правда, в белке имеются различные кислые и основные группы, но формула (V. 5) остается приближенно правильной, если отнести значения Ка Кв наиболее сильным группам. Для полного определения молярного содержания различных ионо генных групп в белке и их констант диссоциации измеряют ход поглощения Н+ - и 0Н - ионов в широком интервале pH (примерно, pH 2—12), прибавляя к белковому раствору различные количества кислоты или щелочи и измеряя равновесное pH водородным или стеклянным электродом. При помощи этих кривых титрования белков определяют также максимальную емкость поглощения кислот и оснований, т. е. максимальное число зарядов на белковой молекуле. Например, для сывороточного альбумина человека при pH = 2 эта величина составляет 7]о = 100 элементарных зарядов на молекулу белка. [c.114]

Иммуноэлектрофорез сыграл существенную роль в развитии исследований сывороточных белков. В свое время свободный и зональный электрофорезы позволили проанализировать сравнительно небольшое число индивидуальных белков сыворотки. За исключением 5 классических белков, выявляемых в свободном и зональном электрофорезе, остальные фракции сыворотки не всегда легко поддаются идентификации. Поэтому специальные виды зонального электрофореза с более высокой разрешающей способностью, чем простой электрофорез на бумаге, так и не вошли в повседневную практику клинических лабораторий, сохранив свое значение главным образом для научных исследований. Определение процентного содержания альбумина, а-, р- и у-глобулинов нередко помогает поставить верный клинический диагноз, но мы должны помнить о том, что фракции белков, гомогенные в зональном электрофорезе, могут включать разные белки, образующие одну фракцию только благодаря сходной электрофоретической подвижности. Об этом свидетельствует также окрашивание липо- и гликопротеидов. [c.20]

Область применения фракционирование и определение гомогенности белков (сывороточных белков, ферментов, белковых гормонов и т. д.), нуклеиновых кислот, пептидов и т. д. [c.88]

Белки с определенной молекулярной массой (Да) яичный альбумин (45 000), бычий сывороточный альбумин (68 000), рибо-нуклеаза из поджелудочной железы (12 700), цитохром с (13 000). [c.107]

В практике лабораторно-клинических исследований уксусная кислота применяется для определения сывороточного белка в моче. [c.154]

Определение соотношений между отдельными фракциями сывороточных белков. В ряде случаев уже при просмотре электрофореграмм можно обнаружить значительные различия между пробами. Однако желательно количественно определить соотношения между отдельными белками, что может быть достигнуто следующими способами [c.115]

При определении белка в лекарственных препаратах при помощи колориметрических методов предварительно строят калибровочный график с использованием стандартного образца белка, указанного в частных статьях (бычьего сывороточного альбумина, сывороточного альбумина человека или аминокислоты тирозина). [c.30]

Необходимость наличия определенной, устойчивой структуры для сохранения антигенных свойств подтверждается тем фактом, что эти свойства теряются при действии на белки высокого давления. Так, например, сывороточные белки теряют свои антигенные свойства после выдерживания под давлением 6 000 атм [28]. [c.333]

Число исследуемых вариантов трансферрина больше числа вариантов любого другого сывороточного белка человека. Генетический локус, контролирующий синтез трансферрина, может существовать во многих мутантных формах, причем ни одна из таких мутаций не ведет к какой бы то ни было клинической патологии. Новые варианты, особенно те, которые встречаются относительно часто в отдельных популяциях, необходимо тщательно сравнивать с известными вариантами. При отсутствии какого-либо общего селективного преимущества или химически обусловленного предрасположения к возникновению определенной мутации маловероятно, что один и тот же [c.129]

Материал для гель-фильтрации должен иметь интервал фракционирования, соответствующий данной цели. Для полного исключения исследуемого вещества используют гель с интервалом фракционирования, верхний предел которого значительно ниже, чем молекулярная масса этого вещества, например, для исключения большинства белков применяют сефадекс u-25 (интервал фракционирования для молекулярных масс от 100 до 5000), а для веществ с молекулярной массой выше 3000 — сефадекс G-10 (интервал фракционирования для молекулярных масс от О до 1500). Для полного уравновешивания анализируемого соединения с жидкостью во внутреннем объеме геля (К,) и последующего элюирования его с солевым объемом (Ko+ i) выбирают гель с интервалом фракционирования, нижний предел которого превышает молекулярную массу данного соединения. При фракционировании вещества (или веществ) гель должен иметь такой интервал фракционирования, при котором это вещество (или вещества) элюировалось бы с некоторой задержкой, например, для фракционирования сывороточных белков используют сефадекс G-200 (предел исключения 200 000), а для определения их молекулярных масс — биогель А, 0,5 М (предел исключения 500 ООО), [c.226]

II. Антитела. Обычный тест на определение специфичности антисывороток (рис. 6.12,Л). В качестве контроля эффективны антисыворотки против суммарного пула сывороточных белков. [c.217]

Содержимое белка в испытуемых пробах устанавливают по калибровочному графику, который строят на основе чистого белка точно известной концентрации. Метод дает абсолютные данные только в том случае, если калибровочный график построен по тому же самому белку, определение которого ведут посредством этой цветной реакции. В случае определения концентрации мембранных белков калибровочный график строят по бычьему сывороточному альбумину готовят серию растворов белка с содержанием от 20 до 400 мкг в 1 мл. С каждым из указанных растворов производят не менее пяти раз реакцию Лоури, применяя весь ход определения, описанный выше. Строят калибровочную кривую (рис. 80). [c.224]

Для построения калибровочной кривой при определении молекулярных масс используют белки-стандарты тропонин С (18 000 Да), тропонин I (24 000 Да), тропонин Т (38 000 Да), яичный альбумин (42 000 Да) и бычий сывороточный альбумин (68 000 Да), а также стандартный набор для определения молекулярной массы белков. При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия препарат миозина дает расположенную почти у старта интенсивную полосу тяжелых цепей с м. м. ок. 20 ООО Да и три слабые, но отчетливые полоски легких цепей с м. м. ок. 20 ООО Да для самой тяжелой из них и около 16 000 Да — для самой легкой. Подвижность этих полос в описанных выше условиях высока, поэтому при достаточно большой продолжительности электрофореза эти полоски могут обнаружиться почти у фронта красителя (бромфенолового синего). [c.397]

Для количественного определения может быть использована биурето-вая реакция, хотя в случае пептидов также наблюдается положительный результат. Реакция основана на образовании фиолетового медного комплекса, интенсивность окраски которого (540 — 560 нм) может быть измерена колориметрически. Гораздо более высокую чувствительность имеет метод Лаури [62], в котором при участии остатков Тгр, Туг и Су8 образуется комплекс белка с фосфомолибденовой кислотой и медью. Это наиболее часто применяемый колориметрический метод определения малых количеств белка. Образующийся голубой комплекс (максимум абсорбции при 750 нм) достаточно устойчив для количественного определения. В качестве стандартного белка служит сывороточный альбумин. Предел обнаруживания 5 — 10 мкг/мгл раствора. Определению по методу Лаури мешают трис- [c.355]

При высоких концентрациях полимеров скорость образования адсорбционного слоя несколько увеличивается. С этими результатами хорошо согласуются литературные данные, по которым минимальное значение межфазного поверхностного натяжения водных растворов белков и полимеров на границе с предельным углеводородом достигается в течение нескольких часов [149 . Однако следует отметить, что равновесное значение поверхностного натяжения, измеренное методом висящей капли, устанавливается раньте достижения предельного значения межфазной прочности. Например, для сывороточного альбумина, яичного альбумина и лизоцима равновесное значение поверхностного натяжения достигалось примерно через 30 жик, а предельное значение прочности— через 2—3 час. Это указывает на то, что метод определения Ps более чувствителен к изменениям, происходящим в межфазных слоях, чем метод измерения поверхностного натяжения. [c.213]

Исследование равновесия в растворах между сывороточными белками и различными лигандами, особенно фармакологически активными соединениями, показало значительное различие в константах связывания соответствующих энантиомеров [82, 83]. Этот эффект, однако, более надежно был зафиксирован с помощью хроматографической техники. Так, в 1973 г. ранее известное высокое сродство I -триптофана к бычьему сывороточному альбумину (БСА) было использовано для разделения энантиомеров на колонке, заполненной гелем БСА—сефарозы [84]. Элюирование о-формы проводилось боратным буфером (рН9), а элюирование ь-формы — разбавленной уксусной кислотой. Этот метод был в дальнейшем использован для определения сродства ряда лекарственных препаратов к сывороточным альбуминам [85, 86]. В последние несколько лет аналитические методы хиральной ЖХ, основанные на использовании иммобилизованных белков в качестве неподвижных фаз, развивались очень быстро и нашли применение для решения широкого круга задач. [c.132]

На САМ удобно оценивать количественно содержание фракций. САМ, предназначенную для колориметрических определений, пропитывают парафиновым маслом, например Shell Whitmore Oil 120, или уксусной кислотой, при этом САМ становится прозрачной, и на ней можно измерять поглощение и отражение. Поскольку САМ растворима в ряде органических растворителей, при проведении некоторых количественных определений можно использовать это ее свойство. Полученные растворы можно анализировать, колориметрически или сцинтилляционным методом. Для иммуннодиффузии и иммуноэлектрофореза САМ можно применять даже без агара. Разделяемые на САМ соединения, как правило, дают узкие зоны, что позволяет для большинства типов разделений уменьшить общую длину пути до 6—12 см. Миграция на меньшее расстояние приводит к сокращению длительности электрофореза и меньшему уширению зон под влиянием диффузии. В результате разделение, например, сывороточных белков можно осуществить при градиенте поте.ч-циала в 20—25 В/см за 60—90 мин. [c.293]

При пo юш,и метода Эдмана был изучен порядок чередования аминокислот в пептидах, однако до последнего времени использование этого метода для количественного анализа концевых аминокислот в белках с высоким молекулярным весом имело лишь частичный успех. В результате очень интересной модификации метода Эдмана, осуществленной Эриксоном и Шеквистом [52], оказалось возможным достигнуть количественного выхода при определении М-концевых аминокислот различных сывороточных белков. [c.169]

Любой из природных белков обладает антигенной специфичностью. Антитела, возникшие в ответ на введение определенного белка, образуют преципитаты только с этим белком, но не с другими белками. Перекрестная реакция наблюдается только в тех случаях, когда исследуемый антиген очень близок к антигену, применявшемуся для иммунизации. Так, например, антитела, образующиеся при инъекции сывороточных белков лошади, преци-питируют также и сывороточные белки осла яичный альбумин утиных яиц преципитируется антителами, образовавшимися при иммунизации яичным альбумином куриного яйца [4]. С другой стороны, серологические свойства миоглобина резко отличаются от свойств гемоглобина, хотя оба вещества содержат один и тот же гемин [5]. Очевидно, в данном случае специфичность обусловливается белковым компонентом, а не гемином. Гемоглобин человека серологически отличается от гемоглобина быка. Однако при помощи реакции задержки комплемента можно установить наличие некоторого родства между этими двумя веществами [6]. [c.330]

В 1828 г. (по данным И. Гмелина — в 1827 г. [233]) вышла из печати диссертация Ф. Михаэлиса [322], посвященная исследованиям составных частей артериальной и венозной крови. Специальный раздел диссертации был отведен анализам сывороточных белков и сравнительным определениям содержания в них углерода, водорода, азота и кислорода. Свои анализы Михаэ-лис проводил по методу Ж. Гей-Люссака и И. Доберейнера, прокаливая исследуемые вещества с окисью меди. Для того чтобы можно было составить представление о первых методах элементарного анализа белковых веществ, вкратце опишем способ анализа, использованный Михаэлисом. Этот способ состоял в следующем 1 г размельченного вещества высушивали над серной [c.28]

Измерения с помощью ультрацентрифуги, произведенные Гейдельбергом, Педерсеном и Тизелжусом, послужили доказательством того, что антитела являются видоизмененными сывороточными белками. С тщательно очищенными препаратами были получены константы седиментации, подобные константам, определенным для сывороточного глобулина кроме того, иммунная активность оказалась связанной с тем веществом, константа седиментации которого измерялась. В сочетании с электрофоретическими измерениями оказалось возможным разделить глобулины с одинаковым молекулярным весом, но с различными электрохимическими свойствами. Оказалось, что фракция -глобулина, выделенная из сыворотки кролика, несет функции антител [84]. Пневмококковые антитела человека также связаны с фракцией -глобулина и по форме молекул значительно отличаются от сферической формы [85]. Зайберт, Педерсен и Тизелиус [86] показали, что полисахариды и белковые фракции, выделенные из различных фильтратов туберкулезных бацилл, имеют одинаковые константы седиментации (около 1,7 10" ). Они по существу однородны и имеют молекулярный вес около 9000. Для белков туберкулезных штаммов быка и человека было найдено, что молекулярные веса равны соответственно 10 000 и 32 000. [c.547]

IV. Распределение препаратов на пластине. Для количественного определения антигенов и антител в лунки той же пластины необходимо. внести контрольные антитела известной специфичности и стандартные антигены. Таким образам, при оценке чистоты фракции сывороточных белков методом ИЭФ реагирующие друг с другом контрольные сыворотку и антисыворотку следует расположить в верхней части пластины, а исследуемые антигены чередовать со стандартными. Примеси легко определить по расположению дуг преципитации, а для -подтверждения инородности каких-либо молекул используют соответствующие специфические сыворотки. Аналогично и при исследовании антисывороток для контроля используют сыворотки с известной специфичностью. [c.221]

Для определения аномалий сывороточных белков очень важно стандартизировать эксперимент и использовать высоко-, качественную сбалансированную полиспецифическую антисыворотку. [c.227]

Антигены, значение р1 которых при pH 8,6 больше, чем у антител, находясь в геле, обладающем высокими электроэндосмотическими свойствами, способны достаточно быстро мигрировать к аноду навстречу антителам, которые перемещаются из противоположной лунки к катоду. Использование этого явления позволяет быстро получить линии преципитации между лунками с антигенами и антителами при условии, что они внесены в соответствующих пропорциях. Встречный ИЭФ — очень чувствительный и быстрый метод определения как антигенов, так и антител 16]. Он широко применяется для выявления инфекционных антигенов в физиологических жидкостях (например, антигенов вируса гепатита В), изменений концентрации сывороточных белков (например, а-фетопро-теина), а также для тестирования антител к целому ряду антигенов, мигрирующих к аноду. Чувствительность метода достигает 400 нг/мл. [c.228]

Чувствительность спедп рофотометрических методов, описанных выше, достаточна для количественного определения белка в сыворотке, если его концентрация превышает 10 мкг/мл. Хотя многие сывороточные белки, представляющие интерес с клинической точки зрения, встречаются именно в. таких концентрациях, существуют также белки, для анализа которых нужна гораздо более высокая чувствительность. [c.110]

Количественный спектрофотометрический анализ. Ряд важных биологических соединений можно полуколичественно изучать с помощью спектрофотометрии в видимой и ультрафиолетовой областях, например, измеряя поглощение белков при 280 нм, а нуклеиновых кислот при 260 нм — длинах волн, соответствующих максимуму поглощения этих соединений. Экстинкция белка при 280 нм зависит от содержания в нем ароматических аминокислот — тирозина и триптофана, поэтому значения молярной экстинкции при 280 нм для всех белков различны, и для определения содержания каждого из них требуется индивидуальная калибровочная кривая. Как правило, биохимики работают со смесью белков, и тогда можно пользоваться градуировочной кривой, полученной для белка или смеси белков со средним содержанием тирозина и триптофана. Это может быть, например, сывороточный альбумин или смесь сывороточных белков. Таким образом, для контрольных измерений надо выбирать соответствующий белок. Проводя измерения при длинах волн, где примесь поглощает больше исследуемого вещества, можно с помощью соответствующих формул оценить количество примеси в образце. Так, пользуясь методом Мортона и Стубса, определяют содержание витамина А в омыленных экстрактах природных масел, а по соотношению экстинкций при 260 и 280 нм (Еш/хо) находят содержание белка в препарате нуклеиновых кислот. [c.155]

Определение с помощью ультрацентрифуги дает для различных белков сильно отличающиеся величины молекулярного веса 70 000 для сывороточного альбумина, 38 000—41 000 для лактальбумина, 41800 ДЛЯ лактоглобулина, 44 ООО для яичного альбумина, 167 ООО для глобулина сыворотки крови, 208 000 для легумина, 75 000—375 000 для казеина, 2 000 000 для гемоцианина из O topus vulgaris, 6 650 000 для гемоцианина улитки. Насколько эти данные соответствуют истинному молекулярному весу, а не весу мицеллы, судить трудно. [c.396]

Было проведено исследование восстановления свойств сывороточного альбумина под давлением. Б данном исследовании раствор альбумина предварительно нагревался, вследствие чего мутнел, из-за частичной денатурации белка. Приложение давления свыше 100 МПа к этому раствору вызывало возрастание его прозрачности, что свидетельствовало о превращении денатуриро ванного продукта в нормальный белок. Степень осуществления процесса оценивалась оптическим путем по изменению плотности света, проходящего через реакционную среду. При давлении выше 500 МПа мутность раствора белка снова возрастала, что свидетельствовало о нарушении строения нормального белка. Такое явление восстановления свойств белка при определенном давлении и повторном денатурировании его при более высоком давлении не получило пока научного объяснения. [c.110]

Большое значение для растворимости белка имеет концентрация электролита. Белки с ярко выраженным асимметрическим распределением заряда, как, например, сывороточные глобулины, требуют для растворения или стабилизации раствора определенной концентрации соли. Этот солевой эффект основан на снижении ассоциации или агрегапии белковых молекул, вызванном присоединением низко молекулярных противоионов. Результатом являются повышенная гидратация и улучшение растворимости белка, его реассоциация при этом затруднена. Высаливание, ведущее к осаждению белка, основано на понижении гидратации белка за счет гидратации ионами электролита. Так как для различных белков необходима различная высаживающая концентрация электролита, высаливание относится к важным и удобным методам грубого фракционирования белков. [c.358]

Попытаемся на основе энергетических оценок процесса солюбилизации углеводородов в водных растворах белков разобраться в механизме этого явления. Рассмотрим результаты определения связывания углеводородов белками при разных температурах. Независимость от температуры процесса связывания углеводородов предельного ряда сывороточным альбумином показывает, что энтальпия связывания мала и, следовательно, повышение растворимости этих углеводородов обус.тювлено возрастанием энтропии [c.32]

Подобно аффинной хроматографии, аффинный электрофорез в геле можно применять для определения констант диссоциации комплексов белок — лиганд. Принцип метода заключается в изучении зависимости подвижности данного белка от концентрации связанного лиганда в геле. Этот лиганд может быть либо ковалентно связан с гелем, либо только включен в гель (последнее обусловлено высокомолекулярными свойствами лиганда). Впервые такое использование электрофореза описано Такео и Накамурой [50], (хотя в этой работе еще не введен термин аффинный электрофорез ) константы диссоциации комплексов фосфорилаза— полисахарид определены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем различные концентрации ковалентно связанного полисахарида. Бег-Хансен [9] применил электрофорез на сефарозе с ковалентно связанным конканавалином А для определения констант диссоциации комплексов конканавалина А с сывороточными гликоиротеинами. [c.168]

Общий вид спектра радикала АХЦ14), связанного с сывороточным альбумином (рис. IV.21), соответствует изотропному вращению радикала при частотах, лежащих на границе областей быстрого и медленного вращения (см. раздел II.5, рис. 11.13), однако в низкопольной части спектра заметно усложнение формы спектра, свидетельствующее о двух типах мест посадки радикала АХ1(14) на молекуле белка, отличающихся временами корреляции. Так как наиболее интенсивным является спектр, соответствующий более быстрому вращению радикала, то параметры спектра, определенные без разделения спектра на составляющие, характеризуют прежде всего именно этот тип комплексов зонда с белком. [c.190]

Существует значительный разрыв между числом статей, описывающих газохроматографические методы, и числом работ, посвященных приложению этих методов. Качественные анализы или же анализы, ограничивающиеся измерением лишь нескольких аминокислот пептидных или белковых гидролизатов . были выполнены уже давно [25, 69, 88, 147]. Наиболее полными являются данные Герке проведенное им газохроматографическое определение аминокислот в гидролизатах бычьего сывороточного альбумина, каппа казеина, белка бобов [41] и рибонукле-азы [43] прекрасно согласуется с результатами, полученными на ионообменниках. В табл. 5, 6 и 7 приведены некоторые экспериментальные данные, полученные ГХ н-пропиловых эфиров ацетиламинокислот из нескольких пептидных гидролизатов. Для гидролизатов фибриноиептидов те же молярные соотношения (табл. 6) найдены на ионообменниках [62]. С помощью ГХ контролировался синтез брадикинина (табл. 7). [c.130]

Поскольку при элюировании фронт растворителя неразличим, скорость движения растворителя определяют и регулируют с помощью соединений-маркеров. Для этой цели служат окрашенные белки природного происхождения, например гемоглобин и цитохром с [9] или же белки с флуоресцентной меткой, присоединенной, например, с помощью флуоресцеинизотиоцианата [8]. Однако наиболее подходящими и хорошо различимыми маркерами являются, по-видимому, бычий сывороточный альбумин и альбумин человека, окрашенные амидо-черным В [14]. Декстра-новый синий, применяемый в гель-фильтрации на колонках для определения свободного объема, является плохим маркером, поскольку при фракционировании он имеет обыкновение давать хвосты . В зависимости от скорости движения маркеров регулируют угол наклона пластинки, задавая тем самым скорость движения элюента. При работе на сефадексе 0-200 скорость веществ, мигрирующих со свободным объемом (т. е. не проникающих в гранулы геля), не должна превышать 2 см/ч на гелях сефадекса с более высокой степенью сшивки скорость может быть несколько больше. Указать заранее оптимальный угол наклона для данного типа геля невозможно, поскольку он зависит от многих факторов, например от свойств партии геля и консистенции суспензии. Пробег для веществ, мигрирующих со свободным объемом, должен составлять не менее 15 см. При большем пробеге (до 30—40 см) наблюдается лучшее разрешение и вместе с тем не происходит заметного размывания зон. [c.260]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология