Мочевина при электрофорезе

Недавно был описан практический метод определения подтипов гаптоглобинов [976]. С помощью хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе из плазмы выделяют белковую фракцию, обогащенную гаптоглобинами. Остальные белки, присутствующие в этой фр-акции, не мещают определению подтипа гаптоглобина. Белки восстанавливают дитиотреитолом (0,5 мг/мл) в 8 М мочевине. К смеси добавляют инсулин (в качестве белка-маркера с известной подвижностью) и основной фуксин и проводят электрофорез в вертикальных трубках или пластинах геля (7=10%), содержащего одну из буферных систем Девиса [281] и мочевину. Электрофорез продолжают до тех пор, пока основной фуксин не окажется на расстоянии 10 мм от нижнего края геля. Белки окрашивают амидовым черным и определяют подтипы гаптоглобинов путем сравнения полученной картины с электрофореграмм ми белков-свидетелей. [c.344]

С точки зрения биохимии белки клетки и в более широком аспекте белки листьев представляют целое собрание самых разнообразных молекул. Проведенными недавно подсчетами с помош,ью двумерного электрофореза после экстракции в диссоциирующей среде (мочевина — детергент) обнаружено более 300 основных белков в листьях табака [38] и 250 — в листьях шелковицы [45]. [c.236]

Крахмал суспендируют в 270 мл буферного раствора, предназначенного для геля, в котором растворено 40,0 г мочевины. Все остальные процедуры проводят так же, как и при обычном горизонтальном электрофорезе в крахмальном геле (стр. 80). [c.83]

В этой работе.используют два прибора. В первом проводят электрофорез гемоглобина в геле, не содержащем мочевины. Соответственно в трубочки вносят раствор гемоглобина в 0,1 моль/л ЫаС. Во втором приборе [c.39]

После окончания электрофореза полученные образцы окрашивают красителем, отмывают гель 7% Ным раствором уксусной кислоты от избытка красителя (см. работу 19) и сравнивают расположение полос белка в гелевых столбиках, полученных при добавлении в буфер мочевины и без добавления ее (рис. 10). [c.40]

При гель-электрофорезе РНК в качестве денатурирующего агента обычно используют мочевину. РНК и ее фрагменты, в состав которых входит от 12 до 150 нуклеотидных звеньев, можно разделить в высокопроцентных полиакриламидных гелях, содержащих 7 М мочевину [85], а более длинные РНК (состоящие из 1500—4500 нуклеотидных звеньев)—в низкопроцентных полиакриламидных или агарозных гелях, содержащих 6 М мочевину [86, 87]. [c.179]

Одно из серьезных ограничений гель-электрофореза как метода выделения специфических фрагментов ДНК заключается в том, что молекулы, имеющие примерно одинаковую массу, но различную нуклеотидную последовательность, обладают, как правило, одинаковой электрофоретической подвижностью. Один из возможных подходов к решению этой проблемы основан на использовании предложенного в работе Фишера и Лермана [115] метода двумерного гель-электрофореза фрагментов ДНК. Сначала смесь фрагментов ДНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью обычного гель-электрофореза, а затем в перпендикулярном направлении проводят электрофорез в 4%-ном полиакриламидном геле в градиенте концентрации формамида (от 4 до 30%) и мочевины (от 0,7 до 5,25 М). Разделение проводят при повышенной температуре. В этой методике использован эффект резкого уменьшения электрофоретической подвижности в результате денатурации или плавления части нативной молекулы ДНК. В ходе электрофореза во втором направлении фрагменты ДНК подвергаются воздействию все более жестких денатурирующих условий, и плавление части молекулы двухцепочечной ДНК сопровождается скачкообразным изменением ее подвижности. Связь между подвижностью фрагментов ДНК и их нуклеотидной последовательностью носит сложный характер и до сих пор окончательно не выяснена [115], [c.185]

Недавно Спайкер описал систему фракционирования гистонов в двуступенчатом ПААГ с кислой мочевиной . Основной рабочий гель — пластина (толщиной 0,5 мм) 15%-го ПААГ в 0,9 М СНзСООН с 2,5 М мочевины. Над ним полимеризована полоска формирующего геля 7,5% ПААГ в 0,375 М СНзСООК, pH 4, с 2,5 М мочевины. Электрофорез при повышенном напряжении — за 1—2 ч. Качество полос и их разрешение в такой системе сильно выигрывают [5р1кег, 1980]. [c.55]

Длины фрагментов определяют с помощью высокоразрешающего электрофореза в тонком слое пшиакриламидного геля. Электрофорез проводится при повышенной температуре в буферной систе.ме, содержащей 7 М мочевину, что способствует разрушению вторичной структуры фрагментов детекция зон фрагментов на электрофореграмме зависит от способа мечения его конца (если это [c.16]

М мочевины, 1 мМ ДТТ и 0,5% метиламина. На колонке СМ-целлюлозы (1 X 30 см) линейным градиентом концентрации Na l (О—0,4 М) смесь белков удавалось разделить примерно на 20 фракций (рис. 122). Конечно, по своему качеству это разделение уступает двумерному электрофорезу рибосомальных белков, но зато его можно вести в любом препаративном масштабе и нет проблемы элюции белков из геля. [c.311]

Гидролиз примерно 20 мкг Р-РНК рибонуклеазами Т1 или А (1 мкг) воли в капилляре, в объеме 3—5 мкл на старт полоски ацетилцеллюлозы наносили всю иикубацноииую смесь. Электрофорез вели в кислом водио-оргаиическом буфере (pH 3,5), содержащем 0,5% пиридина, 5% СН3СООН и 7,5 М мочевины. Полоску размером 3 X 55 см предварительно замачивали — клали иа открытую поверхность буфера, давая возможность жидкости постепенно впитываться в материал полоски с нижией ее поверхности так удавалось избежать задержания в сетке ацетилцеллюлозы микропузырьков воздуха. Затем один конец полоски подсушивали и наносили нрепарат на старт, в 10 см от конца. По обеим сторонам от препарата наносили маркерные красители (метилоранж, фуксин и ксилепциа- [c.496]

Хюбнер и др. [98] разделяли глютенины после восстановления и алкилирования (Я -глютенины) гель-фильтрацией на сефадексе G 200 (0,03М уксусная кислота, 4М мочевина) на три фракции (А, В, С) равной величины, из которых первая (А) обнаружена в агрегированной форме. Две неагрегированные фракции (В, С) были повторно фракционированы ионообменной хроматографией на сульфоэтилцеллюлозе. В таких условиях фракция В разделяется на 7 фракций, из которых некоторые, хотя состоят из нескольких субъединиц с разными молекулярными массами, при электрофорезе в кислом pH ведут себя как гомогенные. Аналогичные результаты получены [89] при фракционировании на сефадексе G 100. Данно и др. [58] добивались аналогичного разделения путем. избирательного осаждения субъединиц этанолом. Для фракционирования субъединиц глютенинов используются также гель-фильтрация и ионообменная хроматография после избирательного растворения в уксусной кислоте [127]. [c.200]

Данная модель предполагает наличие как дисульфидных мостиков, так и слабых связей в структуре функционального глютенина для обеспечения солюбилизации глютенина в диссоциирующих агентах (мочевина, гуанидинхлорид, смесь УМС) и в мылах, а также для поведения субъединиц при электрофорезе. [c.216]

Для полного восстановления обычно необходимо использовать тиол и реагент, вызывающий разрыв водородных связей, а следовательно, и разделение пептидных цепей. Так, инсулин полностью восстанавливается только тногликолятом в присутствии 8 М раствора мочевины [202], а электрофорез на бумаге в 8 М растворе мочевины позволяет разделить две полипептидные цепи. В отсутствие мочевины цистин восстанавливается не более чем на з- Степень восстановления дисульфидных связей рибонуклеазы [282] также определяется концентрацией мочевины. Тиогликолят при pH 7 в отсутствие поверхностно-активного вещества [209] или гуанидина [171] восстанавливает только одну цистиновую связь из 17 связей, имеющихся в альбуминах человека и быка (мол. вес 65 000). В 0,2 М растворе натриевой соли децилсульфата при pH.7 в течение 1 час при комнатной температуре восстанавливаются все цистиновые связи. [c.172]

Электрофорез в крахмальном гем, содержащем мочевину. Эффективность разработанного Пуликом и Эдельманом [22] метода [c.82]

Диск-электрофорез в акриламидном геле, содержащем мочевину. Раствор А 8М раствор мочевины (24,0г перекристаллизован-ной мочевины растворяют в 50 мл деионизованной воды и муравьиной кислотой доводят pH до 3,2). Раствор Б 30%-ный цианогум. Раствор В 0,12 мл N, N, N, N -тетраметилэтилендиамина (ТЕМЭД) в 25 мл раствора А. Раствор Г насыщенный раствор персульфата калия. [c.92]

Электрофорез проводился в 4%-ном полиакриламидном геле в присутствии 8 моль/л раствора мочевины. Над дорожками, в которых проводилось разделение 32р меченного фрагмента после селективного расщепления по гетероциклам, указано, по каким нуклеотидам проводилось расщепление [c.281]

Почему при электрофорезе в полиакриламидном геле раствора гемоглобина в 8 моль/л растворе мочевины на фореграмме получаются две белковые полосы [c.43]

Лучший результат (6-кратное увеличение активности) был получен при хроматографировании на геле фосфата кальция (рис. 36.5), иногда в сочетании с гель-фильтрацией. Сорбент получали по модифицированной методике Тизелиусй [58, 59]. Фракции, содержаш,ие фермент, объединяли, диализовали в присутствии мочевины и меркаптоэтанола. Данные электрофореза [c.18]

Следует привести еще несколько примеров успешного применения гель-фильтрации в тонком слое. Линк [36] показал, что фракционирование в тонком слое можно проводить в присутствии 8М мочевины или 6,5 М хлоргидрата гуанидина. В этих условиях он сопоставил скорости миграции нативного и модифицированного (восстановленного и алкилированного) р-белка из спинномозговой жидкости. Совпадение скорост-ей миграции обоих образцов указывало на отсутствие в белке субъединиц с различным молекулярным весом. В сочетании с электрофорезом тонкослойную гель-фильтрацию применяли как удоб1у>1й метод контроля при выделении аминоацил-т-РНК-синтетаз [37]. При сопоставлении результатов анализа путем тонкослойной гель-фильтрации на G-200 двух фракций с валил-т-РНК-синтетазной активностью, но несколько различавшихся в функциональном отношении, оказалось, что обе фракции довольно близки по размерам молекул [38]. Радола [67] использовал тонкослойную гель-фильтрацию для решения ряда задач к ним относится анализ сывороточных белков животных и человека, растворимых белков культуры клеток млекопитающих in vitro, растворимых белков из листьев шпината. [c.266]

Электрофорез двух фракций легких цепей свиного иммуноглобулина был проведен с помощью горизонтального метода по Франеку. На рисунке старт указан неясной линией около катода. Слой крахмального геля толщиной 2 мм содержит 0,035 М глициновый буферный раствор с pH 8,8 в 3. 4 мочевине (по данным Коэна и Портера [133). В электродных камерах находится раствор с pH 8.2, 0,3 М по борной кислоте и 0,06 М по ЫаОН. [c.339]

В опытах по регенерации инсулина первостепенное значение имеет предварительное выделение обеих цепей в форме, свободной от взаимного загрязнения. Глицильную цепь очищают методом зонального электрофореза в целлюлозном порошке. Последний сперва промывают 0,1 М лимонной кислотой в 8 7И растворе мочевины, а затем во влажном состоянии выкладывают в виде пластины [c.110]

В гл. 4 и 9 приведены ссылки на некоторые методики хроматографии, где с успехом применяют концентрированные растворы мочевины интересно отметить, что электрофорез в крахмальном геле также проводят в присутствии высоких концентраций мочевины. Пулик [24] недавно опубликовал убедительные результаты фракционирования продуктов, полученных при восстановительном расщеплении з-макроглобулина с применением геля, приготовленного следующим образом. Гидролизованный крахмал (60—65 г) смешивали с 250 г мочевины и смесь добавляли маленькими порциями к 300 мл буфера при энергичном перемешивании. Затем вязкий раствор нагревали при 70° в течение 10 мин, удаляли пузырьки воздуха и гель выливали в лоток для электрофореза. [c.257]

М мочевине ( pH 3,5). Буфер для электрофореза на DEAE-бумаге представляет собой 7%-ную муравьиную кислоту (pH 1,9) для более коротких олигонуклеотидов эффектив- [c.270]

При хроматографии и электрофорезе белков использование органических растворителей исключается из-за их денатурирую щего действия, в результате которого белки переходят в нерастворимое сйстояние. Подобное действие могут оказывать и некоторые органические соединения. Поэтому при разделении белков необходим тщательный выбор селективных водных буферных систем. Однако необходимость солюбилизации белков, в особенности тех из них, которые ассоциированы с биологическими мембранами, привела к введению детергентов — как ионных, так и неионных, а также таких реагентов, как мочевина и гидрохлорид гуанидина, которые разрывают водородные связи и препятствуют гидрофобным взаимодействиям. Даже будучи денатурированными, многие белки остаются растворимыми в присутствии этих соединений, особенно после расщепления ди-сульфидных связей дитиотретиолом или меркаптоэтанолом. [c.105]

Сложные смеси РНК, имеющих одинаковую молекулярную массу, но различную нуклеотидную последовательность, можно разделить с помощью электрофореза в градиенте концентрации денатурирующего агента. Возможности этого метода продемонстрированы Гроссом и др. [88] на примере электрофоретического фракционирования гистоновых мРНК морского ежа в гелях, содержащих мочевину (рис. 10.6). Мочевина оказывает дестабилизирующее действие на систему внутримолекулярных водородных связей, а при низких значениях pH способствует протонированию остатков аденозина и цитозина. Поэтому по мере увеличения концентрации мочевины все более четко проявляется зависимость величины заряда молекул РНК от их нуклеотидного состава и размеров, и эта зависимость находит отражение в изменении подвижности молекул РНК в ходе их электрофоретического разделения. [c.179]

Для фракционирования олигорибонуклеотидов может быть также использован двумерный гель-электрофорез [127]. В ходе первой стадии электрофореза, которую проводят в 0,025 М лимонной кислоте, содержащей 6 М мочевину, происходит разделение олигомеров в соответствии с их размерами и нуклеотидным составом, а вторая стадия представляет собой обычный электрофорез при pH 8 [127].С помощью этого метода можно разделить олигомеры длиной до 80 нуклеотидных остатков. Путем сравнения картин распределения пятен ( отпечатков пальцев ), отвечающих разделенным с помощью двумерного электрофореза [и (или) гомохроматографии] олигорибонуклеотидам двух РНК, нуклеотидная последовательность одной из которых известна, можно оценить степень структурной гомологии этих РНК, а затем отобрать для дальнейшего анализа лишь такие олигорибонуклеотиды второй РНК, которые по подвижности не совпада-чют ни с одним из фрагментов РНК с известной структурой (рис. 10.11). [c.190]

Смотреть страницы где упоминается термин Мочевина при электрофорезе : [c.145] [c.55] [c.54] [c.499] [c.499] [c.111] [c.83] [c.111] [c.118] [c.40] [c.54] [c.411] [c.22] [c.104] [c.110] [c.111] [c.136] [c.94] [c.271] [c.30] [c.468] [c.81]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология