Апомиоглобин

При анализе свертывания белковой цепи на основе концепции регулярных вторичных структур не учитываются экспериментальные данные о реальном механизме сборки белка. Характерной иллюстрацией такого рода моделирования может служить работа О.Б. Птицына и A.A. Рашина [113], посвященная сборке молекулы апомиоглобина. Авторы использовали модель полипептидной цепи, в которой еще до начала манипуляции с ней были заданы в виде цилиндров все а-спирали наблюдаемой нативной конформации белка. Задача, следовательно, свелась к тому, чтобы, зная реальную структуру молекулы, упаковать заданные цилиндры различными способами и оценить энергию их взаимодействий. Расчет велся вручную, поэтому не были учтены все возможные структурные варианты (а их миллионы). Найденное взаимное расположение спиралей, имеющее минимальную энергию, совпало с нативной конформацией апомиоглобина. Однако здесь и речи не может быть о том, что в результате данного исследования стала ясна функция дальних взаимодействий в структурной организации белка, поскольку в состав наперед заданных а-спиралей входит не менее 75% остатков аминокислотной последовательности, а в этом случае была рассмотрена ничтожная часть возможных структурных вариантов. [c.503]

Для некоторых белков образование нативной конформации зависит от присутствия специфических лигандов, часто ионов металлов или других простетических групп [94, 413]. Наличие лиганда не обязательно приводит к существенно иной конформации свернутого белка, но способствует стабилизации его нативной формы. На основании опытов по водородному обмену [415], а также с помощью кривых денатурации мочевиной [461] апомиоглобина, глобулярного белка с ДОобщ 9 ккал/моль, установлено, что этот белок должен быть на 4 ккал/моль менее стабилен, чем миоглобин. Противоположным примером является цитохром с, присутствие в котором ковалентно связанной группы гема абсолютно необходимо для стабильности белковой структуры. При удалении этой группы белок перестает быть глобулярным [462. Если удалить только ион железа, белок остается глобулярным, хотя и менее стабильным, например, к термической денатурации [463]. [c.190]

Моделирование свертывания основано на иерархии уровней структуры белка. Было предпринято несколько попыток промоделировать процесс свертывания, например, апомиоглобина [470], BPTI [30, 404] и парвальбумина [471]. Все они основаны на предположении о строгой иерархии уровней белковой структуры (разд. 5.6) [c.192]

Свертывание апомиоглобина рассматривалось как сборка а-спиралей. Моделирование свертывания апомиоглобина [470J было выполнено без применения ЭВМ, поскольку использовалась предельно простая модель, в которой были заранее заданы девять спиралей, наблюдающихся в нативной структуре (рис. 8.4, а). Это существенно сузило рассматриваемое конформационное пространство. На начальной стадии процесса свертывания были определены четыре структурные нуклеации, каждая из которых содержала три соседние по цепи а-спирали. В каждой нуклеации спирали располагались различным образом. Свободная энергия этих спиральных образований рассчитывалась исключительно по гидрофобным взаи- [c.193]

Моделирование свертывания апомиоглобина [470]. а —а-спирали, наперед заданные в начале моделирования процесса свертывания. На начальной стадии учитывались четыре отмеченные на рисунке нуклеации, каждая из которых включает три а-спирали. б—результат моделирования свертывания цеии, отвечающий минимальному рассчитанному значению в — модель молекулы мпо-глобина ио данным рентгеноструктурного анализа. [c.193]

Рассматривая этот метод, необходимо сделать следующие замечания а) метод примени,м только к белкам класса I (табл. 5.2), т. е. к белкам, состоящим преимущественно из а-спиралей б) на начальной стадии расчета допускается существование крупных нуклеаций, составляющих одну треть молекулы, хотя экспериментальные данные о таких нуклеациях пока отсутствуют в) предполагалось, что в такие нуклеации входят соседние по цепи спирали, что отвечает низкой энтропии цепи и наличию сильной корреляции по соседним остаткам (разд. 8.3) г) считалось, что нативная структура свертывается прямым путем все промежуточные структуры отбрасывались как неспособные к перегруппировке. Последнее предположение находится в противоречии с опытами по белкам, содержащим дисульфидные связи, которые выявили существование промежуточных форм с геометрией, существенно отличающейся от нативной (рис. 8.1). Однако процесс свертывания апомиоглобина происходит намного быстрее, и поэтому можно предположить его большую направленность по сравнению со свертыванием днсульфидсодержащих белков (разд. 8.2). [c.194]

В BPTI и парвальбумине свертывание упрощенной цепи производилось путем спуска по градиенту энергии. Несколько иной метод был использован для моделирования свертывания цепи BPTI [30, 404] и парвальбумина [471]. В этом случае полипептидная цепь рассматривалась более детально, чем при. моделировании апомиоглобина, однако аппроксимация оставалась грубой, поскольку в качестве независимой переменной использовался только угол вращения вокруг виртуальной связи —Q (рис. 7.10). Виртуальный валентный угол при О -атоме считался функцией торсионного Сц-угла боковые цепи были заданы жесткими сферами (рис. 7.10). [c.194]

Апомиоглобин имеет богатую спиралями глобулярную структуру, подобную структуре миоглобина. В отличие от неустойчивой напоминающей кокон оболочки гема в цитохроме с в гемоглобине полость гема образована из жестких стабильных а-спиралей. Группа гема здесь не является основным элементом, определяющим укладку цепи апомиоглобин, например, образует третичную структуру и в отсутствие простетических групп (гл. 8), однако группа гема увеличивает ее стабильность [415, 461, 645, 646]. Более мягкие структурные требования к взаимодействию гема и белка в гемоглобинах отражает также тот факт, что для членов семейства глобинов [277, 634] инвариантна только общая картина неполярных контактов гема. Структурно эквивалентные положения у них заняты различными аминокислотными остатками. [c.251]

Присутствие гидрофобных областей в структуре белков доказано экспериментально по данным растворимости углеводородов в растворах белков [283—286] и по интенсификации флуоресценции реагентов типа К—О—5 или А—О—5, связанных или сорбированных в этих областях. На большое значение флуоресценции при таких исследованиях впервые указывали Остер и Нишид-жима [287, 288]. Они подчеркивали, что молекула основания со свободно вращающейся группой хромофора начинает сильно флуоресцировать, если вращение заторможено вследствие адсорбции. Тушение флуоресценции вследствие теплого рассеяния энергии возбуждения за счет внутреннего вращения может быть уменьшено при фиксации планарной молекулы на биополимере. В последнее время подобное увеличение флуоресценции исследуется в связи с наличием в белках гидрофобных областей. Например, при адсорбции 1-анилино-8-нафталинсульфокислоты (АНС) на апомиоглобине и апогемоглобине, свободных от группы гема, флуоресценция группы претерпевает изменения добавление гема восстанавливает первоначальную флуоресценцию [289]. При адсорбции полоса флуоресценции 515 нм смещается в область 454 нм, а квантовый выход увеличивается в 200 раз, от 0,004 до 0,98. Вообще я — л возбужденные состояния я-электрон-ной системы стабилизуются по сравнению с основным состоянием за счет воздействия молекул растворителя в относительно большей степени, так что снятие этого эффекта интенсифицирует флуоресценцию и вызывает смещение в длинноволновую часть спектра. Опыты с модельными соединениями в растворителях с различными дипольными моментами свидетельствуют в пользу такого объяснения. Доказательством наличия в бычьем сыворо- [c.378]

Некоторые гемоглобины и миоглобины удалось заставить диссоциировать на апонротеин (глобин) и простетическую группу (железопорфирин), например нри обработке холодным подкисленным ацетоном 6, 192]. Реконструированные белки по своим свойствам неотличимы от исходных. При комнатной температуре в нейтральных растворах можно также наблюдать перенос или обмен железопорфиринов между гемоглобином и апомиоглобином и обратно [15, 191, 215], между различными свободными и связанными с гемоглобином железопорфиринами [90] и между НЬЕ и НЬА, содержащими меченый железопорфирин [43]. Степень лабильности зависит от состояния связанного с белком железа и понижается в ряду Ре ЮН2> >Ре СО, Ре СМ >РеЧ [43, 90, 113]. Инертность последнего состояния не удивительна, поскольку разрыв связи Ре — гистидин должен в этом случае приводить к образованию крайне неустойчивого тетракоординационного интермедиата. [c.156]

Когей и др. [35] получили мессбауэровский спектр лиофильно высушенного метмиоглобина кашалота. Обогащение белка изотопом Ре осуществляли рекомбинацией апомиоглобина с обогащенным Ре протогеминхлоридом. Мессбауэровский спектр состоял из внешней и внутренней пар линий, поведение которых с изменением температуры образца значительно различалось. Параметры мессбауэровского спектра, соответствующего внешней более интенсивной паре линий, и сильное уширение их при температуре 4,6° К совместимы с присутствием низкоспиновой конфигурации трехвалентного железа. Отметим, что в водных растворах метмиоглобина железо находится в высокоспиновом состоянии, и результат исследования мессбауэровских спектров высушенных препаратов оказался весьма неожиданным. Второй дублетный спектр с небольшим квадрупольным расщеплением и меньшей интенсивностью линий, по-видимому, соответствует высокоспиновой конфигурации железа, находящегося либо в свободном гемине, либо в остаточной фракции метмиоглобина, из которой вода не удалена полностью. [c.425]

В связи с тем, что существуют группы белков с преимущественным содержанием а-спиралей и -структур, можно изучать их пространственную организацию, или вовсе не предсказывая конформационных состояний отдельных остатков, что не удается делать правильно, а беря вторичные структуры прямо из опыта, или оценивая брутто содержание последних с помощью известных статистических методов, что автоматически увеличивает точность предсказания на несколько десятков процентов, поскольку в этом случае приходится идентифицировать состояния не 20 аминокислотных остатков, а лишь трех-четырех структурных групп Левитта и Чотиа. При изменении постановки задачи и неизбежном снижении требований к ожидаемой информации появляется возможность решения других вопросов, правда, менее важных. Например, можно сфокусировать внимание на определении общего процентного содержания аминокислотных остатков в последовательности, находящихся в а- и -областях, и полученные результаты сравнивать с аналогичными данными спектральных методов. Можно поставить вопрос о том, каков порядок взаимодействий вторичных структур друг с другом и какие в принципе возможны способы укладки а-спиралей относительно -структур и последних друг относительно друга, и о частоте их встречаемости в белках. Можно, наконец, разрабатывать новые предсказательные алгоритмы, классифицирующие белки по группам (а), ( ), (а + ) и (a/ ). Подобные вопросы, до работы Левитта и Чотиа, представлялись частными случаями. Теперь же анализ укладки, например, полипептидной цепи апомиоглобина — это уже исследование белка, не случайно взятого из множества других, а планомер-316 [c.316]

I7.2.3.3. Эксплуатационные возможности. Для оценки возможностей прибора методом ВЭЖХ определяли выходы ФТГ-производных аминокислот (поста-дийные выходы) для различных количеств апомиоглобина кашалота [4]. Для образцов, содержащих 10 нмоль — 5 пмоль миоглобина (рис. 17.4), выходы составляли 98% (Ю нмоль), 96% (500 пмоль), 947о (50 пмоль) и 92% (5 пмоль). Снижение постадийного выхода, наблюдаемое при уменьшении количества наносимого образца, вероятнее всего, связано с наличием следовых количеств окислителей в реактивах и в самом секвенаторе. На уровне 10 нмоль можно определить последовательность первых 90 остатков миоглобина, на уровне 5 пмоль получены данные о частичной последовательности 22 аминокислот (рис. 17.5). В число остатков, не идентифицированных на уровне 5 пмоль, входят производные аминокислот, хуже других растворимые в 1-хлоробутане (например, ФТГ-His и ФТГ-Arg), и наиболее неустойчивые производные аминокислот (Ser, Thr и Тгр). [c.471]

РИС. 17.4. Зависимость постадийных выходов отщепления аминокислот от количества апомиоглобина кашалота. Показаны (в виде полулогарифмических зависимостей) выходы ФТГ-Val (циклы I, 10, 13, 17, 21), ФТГ-Leu (циклы 2, 9, 11, 29, 32) при использовании 10 имоль, 1 имоль, 100 пмоль, 10 пмоль белка. Постадийный выход в каждом цикле рассчитывался по методу наименьших квадратов. [c.472]

РИС. 17.5. Выходы ФТГ-Val, Leu, Ala при анализе N-коицевои последовательности 10 пмоль апомиоглобина кашалота. Для каждого производного выходы нормированы по стандартной смеси ФТГ-производных аминокислот. [c.473]

Даже незначительные изменения конформации белка способны повлечь за собой ощутимые изменения его антигенной структуры. Так, удаление гема из молекулы метмиоглобина (обработкой на холоду подкисленным ацетоном) приводит к появлению свободного от гема белка — апомиоглобина. Последний отличается от нативного белка уменьшением содержания а-спиральных участков с 56—64 до 42—49%. Одновременно происхо- [c.31]

Во многих лабораториях признано полезным использование при обратнофазовой хроматографии теста на разделение стандартной смеси белков. При разделении смеси шести стандартных белков в системе 1 (рис. 6-4,Л) проверяется не только разрешение колонки, но и работа системы насосов н градиент-смесителя. Степень разрешения апомиоглобина и карбоангидразы Б человека в этой тест-смеси является важным параметром, характеризующим как работу колонки, так и селективность системы колонка — подвижная фаза для белков, более гидрофобных, чем БСА. [c.118]

Рис. 6-4. Обратнофазовая хроматография шести белков-стандартов. Смесь шести белков (/ — апротинин, 2 — инсулин, 3 — бычий сывороточный альбумин, 4 — апомиоглобин, 5— карбоангидраза Б, 6 — овальбумин) в 12 мМ НС1 хроматографировали в системе растворителей 1 (А), 2 ( ) н 3 (В), как описано в разд. У,Б.

Для определения площади пиков при регистрации по поглощению при 280 нм калибровочные кривые получали, используя белки, имеющие средний коэффициент экстинкции Eo.i% = = 1,03 в 12 мМ НС1 (для бычьего сывороточного альбумина 0,60, апомиоглобина 0,95, апротинина 1,27, карбоангидразы Б 1,38, инсулина 0,94). На обратнофазовых колонках, применяя системы 3 и 4 [модифицированный градиент растворителя Б (О—60%), 30 мин] или 6 (разд. V, Б), можно фракционировать от 500 нг до 100 мкг белка. [c.124]

Является ли скручивание апомиоглобина и последующее включение гема спонтанным процессом Если к нейтральному раствору апомиоглобина добавить мочевину или гуанидин, то молекула белка разворачивается (денатурирует). Содержание а-спиралей в этих условиях (т.е. в 8 М растворе мочевины) близко к нулю. После удаления мочевины путем диализа степень а-спирализации возрастает до 60%, т. е. апомиоглобин вновь скручивается. Последующее добавление гема к этому раствору приводит к образованию биологически активного миоглобина (рис. 3.22). При восста- [c.62]

Раскрученный (денатурированный) апомиоглобин (в 8 М растворе мочевины) [c.62]

Образование миоглобина из денатурированного апомиоглобина. [c.62]

Из смеси денатурированного (с развернутой структурой) апомиоглобина и гема можно получить функционально активный миоглобин. Такой опыт по ренату рации показывает, что конформация миоглобина [c.66]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология