Мочевина денатурация белков

Как уже указывалось выше (см. стр. 223), сравнительно мягкие воздействия на белок, не разрывающие пептидных связей, могут привести к утрате биологической функциональности — происходит денатурация белка. Она может быть вызвана нагреванием, механическим воздействием (ультразвук), изменением pH, действием различных химических агентов (например, мочевины). Денатурация состоит в разрушении пространственной структуры белковых молекул при сохранении первичной структуры цепей. Денатурированная молекула белка оказывается в состоянии статистического клубка с ограничениями, налагаемыми дисульфидными связями, или без них. Для глобулярных белков процесс денатурации сводится к переходу глобула — клубок. [c.242]

Интересно, что процесс денатурации белков, вызванный всеми перечисленными органическими веществами, не зависит от температуры и, для мочевины например, может иметь отрицательный температурный коэффициент. Этим они существенно отличаются от органических растворителей — таких, как, например, спирт или ацетон. Последние денатурируют и необратимо осаждают белок из растворов при комнатной и более высоких температурах. При критической температуре, лежащей около 65°, осаждение белка происходит при относительно невысоких концентрациях органических растворителей. Тем не менее, как уже указывалось в гл. I, нри температурах, близких к точке замерзания, можно производить фракционирование белков добавлением различных количеств растворителей, не вызывая их денатурации. Полагают, что осаждающее и денатурирующее [c.185]

При нагревании белков до 100°С или при воздействии на них других веществ (кислот, щелочей, мочевины, солей тяжелых металлов и т. д.) белковые растворы свертываются— коагулируют—и образуются осадки, больше не способные к обратному растворению. При этом в белке происходят внутримолекулярные изменения, ведущие к изменению его физических, химических и биологических свойств. Белок, потерявший свои первоначальные свойства, называется денатурированным белком, а изменение свойств белка под влиянием различных внешних воздействий называется денатурацией. Обычно денатурация — необратимый процесс. [c.210]

Необратимое свертывание белка яиц при нагревании — явление хорошо известное. Подобное изменение в состоянии указанного белка может быть вызвано и действием ряда других физических и химических агентов сильным встряхиванием, облучением ультрафиолетовыми лучами, действием ультразвуковых волн, кислот, щелочей, органических растворителей, солей тяжелых металлов, мочевины, гуанидина, салицилатов и многих других веществ. При всех этих воздействиях белок теряет свою первоначальную растворимость и в большинстве случаев становится нерастворимым при изоэлектрической точке. В отличие от других белков коллаген при нагревании в воде растворяется. Измененные под влиянием всех указанных воздействий нативные белки получили название денатурированных белков. часто сопровождается потерей биологической активности белков. Так, например, ферменты теряют свою каталитическую активность, гормоны — физиологическую функцию, антитела — способность соединяться с антигеном. Эти изменения не всегда протекают параллельно изменениям физико-химических свойств белков. Денатурация, очевидно, представляет собой комплексное явление. Вряд ли можно думать, что действие столь различных соединений, как мочевина и серная кислота, а также влияние нагревания обусловливают одно и то же изменение белков. Нельзя поэтому просто говорить о денатурации белков, например яичного альбумина необходимо всегда указывать, какой именно агент вызвал денатурацию. [c.147]

Для получения растворимых денатурированных субъединиц апо-фермент глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы из дрожжей в концентрации 2,5—3,5 мг/мл инкубируют в течение 1 ч в 8 М растворе мочевины (за полнотой денатурации следят по изменению активности фермента). Полностью денатурированные субъединицы добавляют к суспензии иммобилизованных мономеров в 8-кратном избытке по отношению к связанному с сефарозой белку. Эту процедуру проводят трижды с 30-минутными интервалами между добавками при постоянном перемешивании и температуре 25° С. Несвязавшийся белок отмывают 0,1 М Ма-фосфатом. Определяют содержание белка и активность в препарате после реассоциации. [c.303]

Денатурированные белки обычно менее растворимы, чем нативные формы, их физиологическая активность при денатурации теряется. Вероятно, теряется и способность существовать в кристаллическом состоянии, так как ни один денатурированный белок не был выделен в кристаллической форме. Во многих случаях эти изменения сопровождаются увеличением количества сульфгидрильных групп, как, например, это наблюдается при восстановлении кератина. Молекулярный вес IB большинстве случаев, но не всегда, остается неизменным Так, гемоцианин улитки Helix pomatia) в изоэлектрической точке имеет молекулярный вес 6 740 000, но с из менением. pH распадается на фрагменты, составляющие половину, четверть восьмую части исходной молекулы. Такой же эффект наблюдается и при обработке мочевиной. Например, гемоглобин расщепляется на две равные идентичные части, эдестин — на четыре. Имеются указания на то, что количество кислотных или основных групп уменьшается при денатурации, вероятно, вследствие внутримолекулярных реакций. [c.688]

При предельных значениях pH молекула белка начинает разматываться и, как говорят, теряет свои естественные свойства. Этот процесс может быть либо обратимым, либо необратимым в зависимости от природы белка и его обработки. Денатурация (потеря естественных свойств) часто необратима, так как она сопровождается значительным уменьшением растворимости, и белок осаждается из раствора. Белки можно также денатурировать нагреванием, даже при нейтральных pH, либо добавлением мочевины (НгЫ)2С0 или других веществ, которые ослабляют связи, удерживающие белок в глобулярной форме. [c.603]

Как уже отмечалось выше, при облучении белков в сухом состоянии (стр. 251) часть радиационного повреждения, состоящая в деструкции белковой цепи, не обязательно проявляется сразу же вследствие упорядоченной структуры молекулы. Однако при нагревании поврежденный белок коагулирует намного легче, чем нативный белок [F8], Поврежденный белок также более чувствителен к денатурации мочевиной [М28]. При дальнейшем изучении физической химии процесса тепловой коагуляции оказалось, что после облучения белок существует в различных состояниях денатурации [F36, F37]. Возможно вследствие этих обстоятельств, действие излучения зависит от физического состояния белка. Например, предварительная обработка азотным аналогом иприта увеличивает действие излучения [К41], [c.258]

Биологические агенты. Наконец, денатурация белков, по-видимому, происходит и при- действии протеолитических ферментов. Известно, что последние хорошо расщепляют только денатурированные белки. Это позволяет допустить, что первый этап действия Этих ферментов на белок состоит в денатурации его молекул или в таком изменении его структуры, которое открывает расщеплению наиболее важные пептидные группы. Признаком денатурации на первом этапе протеолиза служит увеличение отрицательного оптического вращения и уменьшение объема раствора, наблюдаемое в той же мере, как и при денатурации белка мочевиной. [c.187]

Мерой относительной эффективности действия различных химических соединений в качестве денатурирующих агентов служит их влияние на константу равновесия между нативным и денатурированным состояниями (при условии, что процесс денатурации является обратимым). Действие данного денатурирующего агента может быть связано либо с дестабилизацией нативного состояния, либо со стабилизацией денатурированного состояния,. либо и с тем и с другим. Если исходить из данных по денатурации миоглобина, приняв этот белок в качестве модели, то можно сделать вывод, что большинство полярных групп как в нативном, так и в денатурированном состоянии обращено в сторону растворителя, тогда как полипептидная цепь и неполярные группы контактируют с растворителем только в денатурированном состоянии, а в нативном они в значительной мере изолированы от него-Депатурирующее действие таких агентов, как мочевина и родственные ей соединения, долн но, по-видимому, обусловливаться их стабилизирующим [c.115]

Денатурация и свертывание некоторых белков могут быть предотвращены прибавлением концентрированных растворов глюкозы или других сахаров [177]. Свертывание сывороточного альбумина при нагревании тормозится также щелочными солями жирных кислот [178], кислыми красками, например конго красным [152], мочевиной и некоторыми другими соединениями. Действие всех этих веществ, возможно, обусловлено тем, что они адсорбируются на глобулярной молекуле белков, в связи с чем белок представляет собой центр большого растворимого комплекса. В некоторой степени денатурация белков может быть заторможена повышением вязкости растворителя, так как высокая вязкость замедляет движения пептидных цепей и затрудняет их развертывание. В этом же направлении действует и повышение давления [179]. [c.155]

Работы Тенфорда и его школы [2, 20] специально посвящены исследованию денатурации белков различными физическими методами. Денатурированный белок приобретает конформацию статистического клубка в таком растворителе, взаимодействие которого со звеньями полимерной цепи сильнее, чем внутримолекулярные взаимодействия. Найти такой растворитель непросто, так как одна и та же молекула белка содержит и гидрофильные, и гидрофобные группы. Тенфорд с сотрудниками показал, что среди различных денатурирующих растворителей концентрированные водные растворы гуанидин-хлорида обычно приводят к максимальным изменениям физических и химических свойств белка для некоторых белков в той же степени эффективна также мочевина. Для. разрушения дисульфндных связей и предотвращения их образования использовали умеренные концен- [c.144]

Сильнощелочные или сильнокислые среды также оказывают мощное воздействие на поведение белков. В этих условиях кислые или основные группы макромолекулы ионизируются в такой степени, что а-спираль переходит в разупорядоченный клубок. Этот процесс также называется денатурацией белка. Кроме того, денатурировать белок можно повышением температуры (вследствие интенсивных тепловых колебаний цепи спираль разрывается) или добавлением мочевины (ослабляется гидрофобное взаимодействие, поддерживающее упорядоченную структуру белка). Денатурированный белок утрачивает свои специфические функции (например, фермент становится неактивным), его растворимость в воде уменьшается и происходит коагуляция. [c.69]

Влияние тепла проявляется, как полагают, в сокращении протяженности этой структуры если повышение температуры оказывается недостаточным, чтобы нарушить конфигурацию полипептида, то после охлаждения может произойти восстановление первоначальной структуры. При снижении pH размеры льдоподобной оболочки в некоторых случаях увеличиваются [3861. Влияние электролитов и неэлектролитов зависит, вероятно, от того, в какой степени они способны вызвать переориентировку в льдоподобной оболочке. Мочевина, например, с ее выраженной способностью воздействовать на водородные связи может разрушать льдоподобную структуру водной оболочки белковых молекул. Некоторые ионы, наоборот, вероятно, способствуют стабилизации структуры и защищают белок от денатурации, вызываемой другими агентами [90]. Данных о том, как влияет на структуру оболочки само понижение гидратации, сравнительно мало. Известно, однако, что при недостатке влаги изменяется вязкость протоплазмы, и эти наблюдения позволяют предположить, что в диапазоне значений водного потенциала, обычном для завядающих растений, т. е. примерно от —50 до —10 бар (что в общем соответствует активности воды от 0,96 до 0,99), могут происходить заметные изменения структуры. [c.302]

Специфические биологические функции белков, например ферментов пли гормонов, зависят от их конформации, нарушения которой могут вести к потере биологической активности. Поэтому о белке, обладающем нормальной конформацией, говорят, что ои находится в нативном (естественном) состоянии, а нативный белок—это белок, который обладает конформацией, обусловливающей специфическую биологическую функцию молекулы. Довольно мягкие изменения физических условий, в том числе изменение pH, температуры или обработка водными растворами некоторых органических веществ (детергентов, этанола, мочевины или гуанидин-гидрохлорида), могут нарушить эту конформацию. В белках, подвергнутых таким воздействиям, происходит денатурация. Денатурированный белок существенным образом отличается по своей конформации от нативного белка и лишен биологической активности. Процесс денатурации схематически показан а рис. 4.3. [c.99]

Для некоторых белков образование нативной конформации зависит от присутствия специфических лигандов, часто ионов металлов или других простетических групп [94, 413]. Наличие лиганда не обязательно приводит к существенно иной конформации свернутого белка, но способствует стабилизации его нативной формы. На основании опытов по водородному обмену [415], а также с помощью кривых денатурации мочевиной [461] апомиоглобина, глобулярного белка с ДОобщ 9 ккал/моль, установлено, что этот белок должен быть на 4 ккал/моль менее стабилен, чем миоглобин. Противоположным примером является цитохром с, присутствие в котором ковалентно связанной группы гема абсолютно необходимо для стабильности белковой структуры. При удалении этой группы белок перестает быть глобулярным [462. Если удалить только ион железа, белок остается глобулярным, хотя и менее стабильным, например, к термической денатурации [463]. [c.190]

С повышением темпердтуры падает вязкость подвижной фазы, а следовательно, и гидродинамическое сопротивление столбика сорбента соответственно сокращается время достижения равновесия. Теоретически верхним пределом температуры в колонке служит та величина, при которой наступает тепловая денатурация белков. На практике приходится работать при более низкой температуре, в особенности при наличии в исследуемой смеси протеаз и других гидролаз. В ряде случаев, в частности при обработке тканевых экстрактов, рекомендуется работать при температуре близкой или ниже О °С и в буфере, содержащем несколько процентов изопропанола. В этом нет необходимости, если рн среды не совпадает с оптимальной областью действия гидролаз, или в среде присутствуют ингибиторы протеаз, или выделение ведут в присутствие денатурирующих агентов, таких, как солянокислый гуанидин или мочевина, наконец, когда исследуемый белок отделяют с помощью специфического сорбента (например, при аффинной хроматографии) [1]. [c.422]

Еще одно важное следствие денатурации белка заключается в том, что белок почти всегда утрачивает характерную для него биологическую активность. Так, если водный раствор фермента кипятить в течение нескольких минут, а затем охладить, то фермент, как правило, становится нерастворимым и, что особенно важно, уже не обладает каталитической активностью. Денатурацию белков вызывает не только нагревание, но и воздействие экстремальньк значений pH, добавление к раствору белка некоторых органических растворителей, таких, как спирт или ацетон, обработка мочевиной или детергентами и даже сильное взбалтывание бежевого раствора на воздухе до тех пор, пока он не вспенится. Каждый из этих способов денатурации можно рассматривать как относительно мягкую обработку. В самом деле, прямые эксперименты показывают, что денатурация не сопровождается разрывом ковалентных связей в полипептидной цепи. Следовательно, аминокислотная последовательность белка после денатурации не изменяется тем не менее большинство белков при этом утрачивает биологическую активность. Отсюда [c.159]

Существуют две группы данных, которые с очевидностью свидетельствуют о том, что полипептидные цепи глобулярных белков плотно свернуты и что такая конформация важна для вьшолнения этими белками их биологических функций. Первая группа данных касается денатурации нативньк глобулярных белков, происходящей при их нагревании, воздействии экстремальными значениями pH или при обработке их мочевиной (разд. 6.12). В процессе денатурации структура ковалентного остова глобулярного белка остается неповрежденной, но полипептидная цепь развертывается и принимает беспорядочную, нерегулярную и подверженную изменениям пространственную конформацию. Денатурированный глобулярный белок, как правило, становится нерастворимым в водных системах при pH около 7 и обычно утрачивает свою биологическую активность. [c.187]

Белок может стать устойчивым к тепловой денатурации или денатурации новерхностноинактивным соединением, например мочевиной [1901. Возможна также стабилизация белка по отношению к различным факторам, вызывающим его осаждение например, в присутствии поверхностноактивных веществ многие используемые в иммунологии реакции осаждения не имеют места. [c.261]

Большинство белков содержит тиольные группы цистеиновых остатков. Такие группы, присоединенные к малым молекулам, легко окисляются под действием большого количества окислителей. Однако в нативных глобулярных белках такие тиольные группы часто настолько замаскированы , что их реакционная способность проявляется лишь при денатурации белка. Обширная литература, посвященная этому эффекту, была рассмотрена Барроном [1026]. Типичным примером таких исследований является исследование Гринштейна [1027], который обнаружил, что яичный альбумин не восстанавливает типичный тиольный реагент — краситель порфиридин, пока белок не будет денатурирован такими реагентами, как мочевина или солянокислый гуанидин. Число тиольных групп, доступных для реакции, увеличивается со временем воздействия денатурирующих агентов и достигает четко оиределенного предела, который зависит от концентрации этих реагентов. В миозине [1028] некоторые тиольные группы реакционноспособны даже в нативном белке, однако число реакционноспособных тиольных групп после денатурации возрастает на 150%. [c.346]

Денатурация может быть обратимой и необратимой. Известно, что если белок денатурирует в концентрированном растворе мочевины (8 М), то после диализа его первоначальные свойства, как правило, восстанавливаются. Напротив, тепловая денатурация является необратимым процессом. Любая денатурация сопровождается потерей биологическо активности белка. Большинство исследователей считают, что денатурация связана с дезорганизацией пространственной структуры белковых цепей (вторичной и третичной структуры). Это подтверждается появлением в белке после денатурации ранее скрытых функциональных группировок SH, ОН, NHg (см. раздел Пространственная структура белков ). [c.24]

Встречаются случаи, когда белок сохраняет устойчивость к действию протеаз после денатурации с 8 М мочевиной, 6 М гуа-ПИДИН-НС1, кипячения или выдерживания в кислой среде. Подход к анализу таких белков разработан в работе [5]. Хотя токсин В-1У (нейротоксин, селективный к ракообразным) оказался чрезвычайно устойчивым к, протеолизу как в нативном, так и в денатурированном состоянии, его производные (малеил-и сукцинил-) были чувствительны к действию трипсина. [c.172]

Одна из наиболее трудных и интересных задач биохимии — это выяснение физических основ строения белковых молекул, отличающихся тонкой организацией и высокой специфичностью. Эта задача приобретает особое значение из-за того, что биологическая активность таких макромолекул чувствительна к изменениям их пространственной конформации. Так как биологические полимеры способны разворачиваться (например, при нагревании или обработке мочевиной) и затем снова сворачиваться, возвращаясь в исходное состояние, разумно предположить, что в основном конформации, принимаемые различными биополимерами, наиболее выгодны термодинамически. Некоторые данные, подтверждающие эту гипотезу, были получены в серин экспернмеитов, выполненных Анфинсеном и др. (1961 г.). Эти исследования показали, что даже при разрыве всех четырех дисульфидных связей рибонуклеазы и полной ее денатурации мочевиной после удаления мочевины и реокисления дисульфидных мостиков белок снова приобретает правильную нативную конформацию [c.237]

Наиболее распространенные денатурирующие агенты — гуани-дингидрохлорид и мочевииа. Большинство белков оказываются полностью денатурированными в водных 6—8 М растворах гуанидингидрохлорида и в 8—10 М растворах мочевины. В этих условиях натпвная конформация обычно полностью разрушается и белок принимает конформацию неупорядоченного клубка, в которой отсутствуют нековалентные взаимодействия между атомами и группами, а все пространственные формы молекулы оказываются легко взаимопревращающимися и способными вступать в контакт с растворителем. Гидрофобные R-группы белков в концентрированных растворах мочевины и гуанидингидрохлорида становятся менее экранированными, и, следовательно, денатурация такого рота вызывает нарушение гидрофобных взаимодействий. Это согласуется с фактом повышенной растворимости гидрофобных соединений в концентрированных водных растворах мочевины и гуанидингидро-хлорида. [c.204]

Лауфер показал, что диссоциация полимеризованного белка ВТМ в 0,2 М мочевине нри pH 6,5 и температуре около 2 °С происходит боло интенсивно, чем в отсутствие мочевины [1045. Под действием 1,8 ikf мочевины при pH 6,6 и температуре 23 °С происходит очень быстрая деполимеризация с последующей медленной и необратимой денатурацией белка. Базел [309, 310] провела детальные исследования процесса деградации ВТМ в присутствии 6 М мочевины при О °С и показала, что при этом образуются два основных типа палочкообразных частиц — длиной около 160 им и 60—80 нм. С помощью седиментациоиного анализа и электронной микроскопии было установлено, что более длинные палочки имели хвосты РНК, выступающие с одного конца. Это в свою очередь позволило предположить, что под действием мочевины белок отщепляется с одного конца вирусиой частицы. Небольшая часть палочкообразных частиц ВТМ в этих препаратах обладала значительно большей устойчивостью к мочевине, чем основная их масса. [c.338]

Помимо суперпродукции, повышенной гидро-фобности и неправильного образования дисульфидных связей формированию водонерастворимых конгломератов чужеродных белков в Е. со// способствуют и другие факторы, которые пока точно не известны. Однако совершенно ясно, что в нерастворимых включениях белок, по крайней мере частично, денатурирован, а для его перевода в растворимую форму требуется полная денатурация с разрушением дисульфидных связей. Для растворения белковых телец включения их обрабатывают в жестких денатурирующих условиях додецилсульфатом натрия, гуа-нидингидрохлоридом, мочевиной и т. п. с добавлением 2-меркаптоэтанола, дитиотреитола и др. Заключительным этапом очистки таких белков является их ренатурация, необходимая для получения функционально активного продукта. Удельная активность ре-натурированного генно-инженерного белка при этом часто не достигает уровня, свойственного природной форме. Получаемый таким образом препарат содержит балласт в виде измененных форм целевого белка, который может вызывать негативные эффекты при попадании в организм человека или животных. Поэтому при конструировании бактериальных штаммов — продуцентов эукариотических белков медицинского назначения необходимо стремиться к получению целевого белка в растворимом виде и не допускать его преципитации. Наиболее просто добиться высокого уровня продукции эукариотического белка без формирования телец включения можно, создавая штаммы, секретирующие этот белок в окружающую среду. Продуктивен также подход с использованием экспрессирующих векторов широкого круга хозяев и последовательным введением полученных на их основе гибридных плазмид в разные бактерии для поиска оптимальной пары. [c.284]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология