Измерение абсолютных квантовых выходов флуоресценции

В. ИЗМЕРЕНИЕ АБСОЛЮТНЫХ КВАНТОВЫХ ВЫХОДОВ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ [c.636]

Определение абсолютных квантовых выходов флуоресценции представляет собой довольно трудную задачу. Оно требует измерения поглощенных и испускаемых квантов во всей области частот с поправками на рассеянный свет, повторное поглощение и на эффекты преломления. На практике часто используют растворы веществ с известным квантовым выходом флуоресценции. Измеряют интенсивность флуоресценции известного и исследуемого раствора в совершенно идентичных условиях как функцию частоты. Строят кривые зависимости относительного числа излученных квантов от частоты. Площади под этими кривыми пропорциональны квантовому выходу флуоресценции. Зная соответствующее значение квантового выхода для стандарта, определяют величину квантового выхода флуоресценции исследуемого соединения. [c.62]

Определение абсолютных квантовых выходов флуоресценции представляет собой трудную задачу. Оно требует измерения поглощенных и испускаемых квантов во всей области частот с поправками на рассеянный свет, повторное поглощение и на эффекты прелом- ления. На практике часто используют растворы веществ с известным квантовым выходом флуоресценции и определяют квантовые выходы флуоресценции исследуемых соединений по отношению к известным со- [c.158]

Точное определение абсолютных квантовых выходов флуоресценции связано с большими трудностями, поскольку приходится сравнивать число поглощенных квантов от пучка монохроматического света с числом квантов полихроматического излучения флуоресценции, распределение которого в пространстве может быть геометрически сложным. Первые измерения были выполнены Вавиловым [105] в 1924 г., который получил удивительно точные результаты, если учесть несовершенство аппаратуры тех времен. Его метод состоял в сравнении света от облучающего пучка, рассеянного от чистой матовой поверхности, с флуоресценцией от поверхности кюветы с веществом, помещенной в такой же пучок он использовал идеализированные законы рассеяния поверхностью и излучения флуоресценции и учел изменения чувствительности приемника для разных длин волн и другие факторы. [c.636]

Отметим, что Q — безразмерная величина. Так как энергия Е одного фотона определяется уравнением Е = Ы, для измерения числа фотонов требуется измерить величину энергии светового потока и разделить ее на величину Измерение абсолютного квантового выхода — трудный и утомительный процесс, в биохимических целях его проводят крайне редко. (Методики измерений даны в избранной литературе, приведенной в конце этой главы.) При обычном методе измерения Q требуется провести сравнение с флуоресцирующим веществом, Q которого известно готовят два раствора один — образца, другой — стандартного флуоресцирующего вещества — и измеряют интегральную флуоресценцию (т. е. площадь, ограниченную спектром) каждого, используя один и тот же источник возбуждения. [c.420]

В этом случае график Штерна — Фольмера (зависимость 1//иа.г от [М]) будет иметь в точке пересечения значение (1-ЬА1/Л)/ погл и производную ikq[N. ]/A)[ j,onu поэтому kq/A нельзя определить без измерения / эл и /погл. Однако необходимо знать только отношение /изл//погл, а не абсолютные значения интенсивностей. Следует заметить, что если энергетические спектры возбуждения и излучения не идентичны, то необходимо измерять отношение потоков квантов, а не отношение потоков энергии. Отношение /изл//погл есть квантовый выход ф1 процесса люминесценции (фг — квантовый выход флуоресценции, фр — квантовый выход фосфоресценции), поэтому значение модифицированной кривой Штерна — Фольмера 1/ф —[М] в точке пересечения будет определять отношение скоростей радиационных и безызлучательных процессов. Следовательно, в идеальном случае можно определить скорость внутренней и интеркомбинационной конверсии в люминесцирующей системе. [c.88]

Абсолютные значения квантовых выходов флуоресценции или фосфоресценции можно рассчитывать по данным измерений в одних и тех же произвольных единицах интенсивности поглощаемого и испускаемого света. Должны быть сделаны поправки на различия в пространственном и спектральном распределениях возбуждающего света и испускаемого излучения, необходимо также знать кривую спектральной чувствительности фотоприемника. Направленный возбуждающий пучок можно рассеять для сравнения с изотропным испускаемым излучением с помощью матовой поверхности или, лучше, с помощью белкового раствора, рассеивающую силу которого можно рассчитать. Процедура коррекции спектрального распределения испускаемого излучения может быть упрощена. Для этого испускаемое излучение образца и рассеянный возбуждающий свет надо последовательно направить на подходящее флуоресцирующее вещество, которое преобразует все падающее излучение в свой собственный спектр флуоресценции с постоянным [c.192]

Иногда необходимо знать абсолютные квантовые выходы (F) (стр. 169). Прямое определение F требует измерения поглощенных и испускаемых квантов во всей области частот с поправками на рассеянный свет, повторное поглощение и на эффекты преломления. Относительное число квантов, испускаемых за секунду флуоресцирующим раствором, можно определить при помощи счетчика квантов , представляющего собой комбинацию второго флуоресцирующего раствора (например, родамина В в глицерине) и фотоумножителя так как выходы флуоресценции не зависят от длины волны возбуждающего света (выше длинноволнового предела), реакция этой системы зависит от числа поглощенных квантов независимо от длины волны [14, 15]. Число падающих квантов определяется тем же счетчиком квантов после замены второго раствора поверхностью окиси магния, способность которой рассеивать свет известна, или еще лучше очищенным раствором белка, рассеивающую способность которого можно вычислить. Тогда из данных измерения поглощения света можно найти число квантов, поглощенных флуоресцирующим раствором. Отношение числа излученных квантов к числу поглощенных квантов дает величину F. Для бисульфата хинина в воде, например, принято значение 0,55 [15]. [c.158]

Относительные квантовые выходы флуоресценции можно определить более точно, чем абсолютные величины, и, таким образом, если известны относительные значения, их можно коррелировать с известными абсолютными значениями и в конце концов исправлять последние, где возможно. Особенно необходимо исправлять абсолютные значения квантового выхода в случае, если вещество имеет кажущийся выход флуоресценции (измеренный по имеющемуся стандарту) значительно больше единицы. Хотя значения, измеренные для некоторых веществ при тех же условиях, сильно варьируют (табл. 25), маловероятно, что среднее значение для большинства измеренных соединений (например, бисульфата хинина или антрацена) имеет ошибку более 10%. Максимальное значение квантового выхода флуоресценции имеют 9,10-дифенилантрацен (0,76—1,0), щелочной раствор флуоресцеина (0,79—0,92) и перилен (0,87—0,98). Косвенным подтверждением таких высоких значений служат низкие выходы образования триплетов (см. разделы IV, А, 4—6). Например, низкий выход образования триплетов перилена соответствует его высокому квантовому выходу флуоресценции. [c.253]

Спектрофлуориметры используются для выбора условий определения и изучения влияния мешающих веществ, а также для выполнения серийных анализов. В последнем случае для повышения точности результаты следует сравнивать с результатами, полученными на том же приборе для стандартных растворов. Часто спектры, полученные на разных приборах, отличны друг от друга прежде всего вследствие изменения длины волны излучения источника, абсолютной чувствительности детектора и эффективности монохроматоров. Наблюдаемые спектры представляют некую комбинацию спектральных свойств вещества и ложных сигналов, даваемых прибором. Такие отклонения особенно существенны при измерении квантового выхода флуоресценции. [c.157]

Для измерения абсолютной величины локальной вязкости поляризационным ме тодом нет необходимости в определении квантового выхода флуоресценции. Следовательно, измеряемые относительные величины перпендикулярных и параллельных компонентов интенсивности флуоресценции дают степень поляризации р [согласно уравнению (У-6)]. Если графически представить зависимость у от Т/г), при использовании низкомолекулярного растворителя получается прямая, отсекающая на оси отрезок, равный искомой величине ро флуоресцирующего вещества. Наклон В прямой определяется из следующего соотношения [c.180]

Для количественных определений квантовых выходов, необходимых в физической и физико-органической фотохимии, требуется довольно сложное оборудование. При таких измерениях необходимо использовать регулируемый источник монохроматического света, хорошо отлаженную оптическую схему и удобную фотолитическую кювету, через которую проходит пучок света, приспособление для измерения как абсолютной интенсивности падающего света, так и доли этого света, которая поглощается реагентом. Необходимо также количественно определять число молекул образовавшегося продукта или число квантов, испускаемых в виде флуоресценции или фосфоресценции. Мы рассмотрим экспериментальные методы и оборудование для измерения квантовых выходов, а также специальную методику вращающегося сектора, импульсный фотолиз, измерения при низких температурах в матрицах, измерения времени жизни флуоресценции. [c.551]

Выход фосфоресценции измеряется по существу теми же методами, но приемник должен суммировать свет, испущенный в течение всего времени жизни люминесценции. Кроме того, если для отсечки флуоресценции используется вращающийся затвор, то следует принять во внимание эффективную оптическую плотность затвора. Джилмор, Гибсон и Мак-Клюр [100] сообщили об измерениях абсолютного квантового выхода флуоресценции и фосфоресценции некоторых ароматических соединений в ЭПА при 77° К-В их статье подробно рассмотрена конструкция прибора и необходимые экспериментальные поправки. [c.92]

Измерение квантового выхода флуоресценции. Определение абсолютных квантовых выходов флуоресценции представляет собой трудную задачу. Оно требует измерения поглощенных и испускаемых квантов во всей области частот с поправками на рассеянный свет, повторное поглощение и на эффекты преломления. На практике часто используют растворы веществ с известным квантовым выходом флуоресценции и определяют квантовые выходы флуоресценции исследуемых соединений по отношению к известным соединениям. Необходимо работать с очень разбавленными растворами, когда избыточным поглощением возбуждающего света и самопо- [c.68]

Во всех типах флуоресцентных измерений относительные квантовые выходы флуоресценции можно определить с большей точностью, чем абсолютные. Абсолютные квантовые выходы флуоресценции многих соединений ыли определены с достаточной точностью в нескольких лабораториях, и они могут быть использованы как актинометры нри вычислении квантовых выходов других соединений. Например, в отсутствие концентрационного тушения и тушения кислородом в растворах, достаточно разбавленных во избежание перекрывания полос флуоресценции и поглощения, рубрен в гексане или 1-нафтиламин-4-сульфонат натрия в глицерине или этилен-гликоле имеют квантовый выход флуоресценции, близкий к единице, и могут служить хорошими стандартами. [c.637]

Таким образом, если измерять If ъ зависимости от времени I и вычерчивать график 1п (/ ) — 1, наклон прямой линии будет давать —1/т. Среднее время жизни флуоресценции т, измеренное экспериментально, немного меньше естественного излучательного времени жизни То, что обусловлено безызлучательными процессами рассеяния энергии, которые конкурируют с флуоресценцией. То связано с т через абсолютный квантовый выход флуорес-пенции ф/ соотношением [c.641]

В предыдущем параграфе мы показали, как кинетические данные и измерения квантовых выходов можно использовать для оценки величины вклада тех или иных фотохимических процессов (4.10) — (4.17). Однако особенность стационарных кинетических расчетов состоит в том, что они определяют выражения лишь для отношения констант скорости например, выражения интенсивностей или квантовых выходов в уравнениях (4.6), (4.9), (4.18) и (4.19) всюду включают отнощения констант скорости к коэффициенту А Эйнщтейна для скорости спонтанной эмиссии. Абсолютные значения констант скорости могут быть часто определены из сравнения кинетических данных, полученных в стационарных условиях, с их значениями, полученными в нестационарных условиях. В рассматриваемом нами случае нестационарные измерения часто состоят в измерении времени жизни флуоресценции (т() и фосфоресценции [c.89]

При измерениях быстрой флуоресценции и фосфоресценции в жидких растворах не требуется точно знать скорость поглощения Бозб.уждающего света, если только определение выходов флуоресценции не производится абсолютными методами и не изучаются фотохимические изменения. Однако интенсивность некоторых типов замедленной флуоресценции пропорциональна квадрату скорости поглощения света (т. е. квантовый выход пропорционален первой степени скорости поглощения света). Кажущиеся выходы быстрой флуоресценции и фосфоресценции также могут зависеть от интенсивности в твердых средах при низкой температуре, где времена жизни триплетов велики и большая доля растворенного вещества может находиться во время облучения в триплетном состоянии. Для проведения количественных исследований в таких системах необходимо точно измерить скорость поглощения света растворенным веществом. Для этой цели возбуждающий свет фокусируется на отверстие подходящей формы и размеров так, чтобы отверстие равномерно освещалось светом. Четкое изображение отверстия фокусируется затем на ту часть образца, где наблюдается люминесценция. Затем с помощью ферриоксалатного актинометра измеряется общий поток возбуждающего света, проходящий через отверстие. Измеряют площадь изображения отверстия и вычисляют интенсивность освещения образца (эйнштейн/см ). Зная эту величину и измерив оптическую плотность на 1 см при нужной длине волны, определяют скорость поглощения света. Необходимо учитывать эффект внутреннего фильтра, используя фактор (см. раз- [c.267]

Это уравнение дает максимальную яркость флуоресценции для данной величины пт. Абсолютное измерение (бф)макс дает произведение ЛгЛгь все другие параметры хорошо известны. (В принципе плотности частиц, важные для диагностики плазмы, могут быть измерены.) Преимуществом использования уравнения (23) является то, что не нужно знать ни параметры источника, ни температуру атомной системы или значение квантового выхода перехода [20]. [c.206]

Величиной, чаще всего измеряемой при спектрофлуориметрических исследованиях, является квантовый выход фр — доля молекул в возбужденном синглетном состоянии, перешедших в основное состояние в результате флуоресценции. Абсолютное измерение < >р, как это будет видно из дальнейшего, сопряжено с большими трудностями. Число возбужденных молекул при интенсивности падающего света /д пропорционально числу поглощенных квантов. Эту величину, согласно закону Ламберта—Бэра, можно найти, опреде- [c.90]