ДНК-синтезаторы

Следует обратить внимание еще на один, очень важный методологический аспект в новом подходе при систематизации. Сегодня является распространенным выражение "строить систему (атомов, химических элементов и т. д.). Но мало кто обращает внимание на некорректность его. Мы строим не систему, а ее модель, более или менее адекватно отображающую главные закономерности строения последней. Сама Система объективно существует в природе. С помощью моделирования мы познаем, как она устроена. Моделирование сегодня является одним из самых плодотворных методов обобщения знаний. К сожалению, модельные представления еще недостаточно используются в познании естественного множества атомов вещества, как системы природы. Мне, по крайней мере, не приходилось слышать о модели системы атомов или модели системы химических элементов . Модель является как бы наглядным накопителем и синтезатором знаний о природном объекте. По мере накопления экспериментальных данных о нем, меняется и облик модели и, как следствие, на модели выявляются новые закономерности и связи, которые позволяют глубже понимать сам моделируемый объект. В этом свете можно сказать Д. И. Менделеев построил модель системы химических элементов , представляющую собой таблицу. Она, как модель, отображает одну из главных закономерностей в строении оригинала — повторяемость свойств химических элементов в их естественном ряду. Это была, конечно, примитивная модель, но и она путем различных модернизаций смогла отобразить основные закономерности системы природы и долгие годы удовлетворяла ученых. [c.146]

Для перемешивания предлагались различные способы встряхивания реакционного сосуда. Процесс можно вести и вручную, и автоматизировать, применяя доступный продажный синтезатор (см. ниже). Перед началом синтеза необходимо аналитически определить количество присоединенной аминокислоты. Практически достаточно содержания 0,1—0,5 ммоль ами- [c.186]

Рис. 2-20. Схема первого синтезатора Меррифилда [440].

Этот синтезатор состоит из двух главных частей системы контроля и системы реактора. Система реактора включает реакционный сосуд, набор вентилей для подачи растворителей и реагентов, а также резервуары для зтих жидкостей. Встряхивающее устройство для реакционного сосуда, а также различные вентили и иасосы управляются программирующим устройством. [c.191]

Если проанализировать все проведенные синтезы Меррифилда (табл. 2-9), то станет ясно, что это в основном работы в период между 1968 и 1972 гг. В это время во многих новых лабораториях — а их количество в США со времени опубликования концепции Меррифилда увеличилось в десять раз — начали проводить синтезы пептидов на носителях, чему в значительной степени способствовала коммерческая доступность синтезаторов. Очевидно, разочаровывающие результаты при попытках синтеза белков привели к реалистической оценке возможностей метода. Попытка синтеза лизо-цима привела, например, к смеси полипептидов, которая обладала 0,5—1% специфической активности [455]. Гораздо успешнее был синтез рибонуклеазы А [449], хотя и в этом случае выход составлял всего 16%. На этом ферменте с помощью твердофазной техники проведено интересное изучение взаимосвязи строения и активности [467]. Несомненно, что биологическая активность не является критерием гладкого течения твердофазного синтеза. Синтез белка, состоящего из 188 аминокислот, который сначала считали гормоном роста человека, дал смесь белков с заметной биологической активностью. Несколько позднее было, однако, показано, что положенная в основу синтеза первичная структура не подтвердилась [453, 468]. Синтез длинноцепочечных пептидов и белков по методу Меррифилда в настоящее время и в обозримом будущем уже не может отвечать тем высоким требованиям, которые предъявляются к синтезу биологически активных соединений. [c.193]

Блок-схема спектрометра непрерывного типа. Блок-схема спектрометра ЯМР непрерывного типа приводилась ранее (тл. 1, 4 рис. 1.11), и в целом она не претерпела принципиальных изменений. В- современных спектрометрах используются высокостабильные генераторы частоты и синтезаторы частоты, позволяющие получить любые стабильные частоты в некотором диапазоне частот. [c.117]

Твердофазный анализ удалось автоматизировать, в результате появились автоматизированные синтезаторы пептидов, которые с успехом используются в промышленности и лабораторной практике. [c.25]

Синтез пептидов на полимерном носителе, при этом растущая полипептидная цепь ковалентно присоединена к нерастворимому или растворимому полимеру и отделение ее от полимера осуществляется на завершающей стадии синтеза. При использовании нерастворимого носителя принято говорить о твердофазном синтезе, существующем в настоящее время в полностью автоматизированном варианте. Созданные для этих целей приборы получили название синтезаторов. В некоторых случаях оказывается целесообразным использовать жидкофазный синтез иа основе растворимых полимеров. [c.127]

Автоматический твердофазный синтез пептидов осуществляется иа специальных приборах, называемых синтезаторами (рис. 78). [c.147]

После заверщения синтеза получают полистирол с привитыми полипептидными цепями заданного состава. Такой привитой сополимер обрабатывают смесью РзССООН и НВг, что приводит к отщеплению синтезированного полипептида, выделению изобутилена и СО2, а также к регенерации матричного полимера. Этот процесс синтеза автоматизирован, и современные аминокислотные синтезаторы могут присоединить к растущей полипептидной цепи до 6 аминокислотных звеньев в сутки. [c.354]

Твердофазная техника приводила к существенной экономии труда и времени, необходимых для пептидного синтеза. Так, например, ценой значительных усилий Хиршмен с 22 сотрудниками [5f] завершили вьщающийся синтез фермента рибонуклеазы (124 аминокислотных остатка) с помошью традиционных жидкофазных методов. Почти одновременно тот же белок был получен путем автоматизированного твердофазного синтеза [5g], Во втором случае синтез, включающий 369 химических реакций и 11 931 операцию, был вьшолнен двумя участниками (Гатте и Меррифилд) всего за несколько месяцев (в среднем до шести аминокислотных остатков в день присоединялись к растущей полипептидной цепи — фантастический темп ). Последующие усовершенствования позволили построить полностью автоматический синтезатор. Таким образом, дерзновенная и волнующая проблема пептидного синтеза, решение которой ранее требовало огромных затрат труда и времени, теперь может считаться практически решенной (по крайней мере, для не слишком сложных пептидов). [c.302]

Неоспоримое преимущество этого метода по сравнению с классическими методами синтеза пептидов состоит в том, что ни на одной из стадий он не требует выделения растущей полипептидной цепи. В силу чрезвычайно низкой растворимости аддукт пептида и полимера легко отмывается после каждой реакции от побочных продуктов, растворителей и избытка реагентов без потери пептида, после чего аддукт готов к следующей реакции- В настоящее время метод автоматизирован, и запрограммированные аминокислотные синтезаторы без труда могут присоединить шесть аминокислот к растущей полипептидной цепи за 24 ч. Эти приборы добавляют реактивы в падлен<ащей последовательности, меняют условия реакций, обеспечивают необходимое время реакции, отмывают побочные продукты, после чего начинают всю операцию сначала. При помощи метода ТФСП были синтезированы инсулин и фермент рибонуклеаза, состоящий нз 124 аминокислот. [c.406]

Как мы вндим, децибелы характеризуют отношение величин. Поэтому их обычное использование в качестве некоторой абсолютной величины в выражениях типа громкость звука излетающего самолета превышает 150 дБ или в более важном для ЯМР (если, конечно, ваша лаборатория находится не возле аэропорта) выходная мощность синтезатора составляет + 10 дБм может несколько озадачить. Фокус состоит в том, что в этих выражениях говорится об отношении интересующей нас величины к некоторой стандартной последняя, как предполагается, всем известна. Для обычиых едини ( измерения радиочастотной мощности (дБм и дБВг) эта величина составляет 1 мВт и 1 Вг соответственно. Обычные генераторы прямоугольных сигналов имеют иа выходе мощ ность в несколько дБм, а обычные импульсные передатчики спектрометров ЯМР могут давать +20дБВт. [c.219]

Стандартность операций в твердофазном синтезе олигонуклеотидов явилась основой для автоматизации процесса. Принцип работы автомата-синтезатора основан на подаче в реактор с помощью насоса (под контролем микропроцессора) защищенных нуклеотидных компонентов реагентов и р-рителей по заданной программе в колонку, содержащую полимерный носитель с закрепленным на нем первым нуклеозидом. После окончания синтеза и отделения полностью защищенного олигонуклеотида от полимерного носителя проводят деблокирование, очистку и анализ синтезир. фрагментов ДНК. Так, с помощью гидрофосфорильного метода [c.300]

Благодаря этому способу удалось заменить весьма сложные и трудоемкие процедуры разделения и очистки промежут. пептидов простыми операциями промывки и фильтрования, а также свести процесс пептидного синтеза к стандартной последовательности периодически повторяющихся процедур, легко поддающихся автоматизации. Метод Меррифнлда позволил существенно ускорить процесс синтеза П. На основе этой методологии созданы разл. тины автоматич. синтезаторов П. [c.471]

В основе автоматич. пром. синтезаторов лежит общая принципиальная схема (см. рис.). Многочисл. модели синтезаторов различаются конструкцией колонок и их кол-вом, способом подачи реагентов и р-рителей и др. Управление и программирование осуществляют с помощью встроенного или вынесенного компьютера. [c.505]

Описанные выше разновидности методик двойного резонанса относились к ядрам одного типа, и поэтому к ним применим термин гомоядерный двойной резонанс. Распространение этих методик на различные ядра приводит к гетероядерному двойному резонансу, который отличается от гомоядерного метода только тем, что разность частот V2 — vi лежит в мегагерцевом диапазоне. Второе поле В удобнее всего получать от отдельного генератора, например кварцевого синтезатора частот. Подобные эксперименты используются для упрощения спектров, усложненных за счет спин-спинового взаимодействия, такого, как Н — или Н — Р. Кроме того, можно устранить уширение линий, обусловленное присутствием ядер (разд. 4 гл. VIII и [c.326]

Пфеидер и др. [476] описали вариант пептидного синтеза в водной среде, применяя НКА-метод (разд. 2.2.5.2.3) и полиэтилениминный носитель. Для этой цели был разработан автоматический пептидный синтезатор. [c.197]

Рибонуклеаза была первым ферментом, который удалось получить полным химическим синтезом. Гутт и Меррифилд синтезировали цепь с С-конца на твердой фазе с использованием автоматического синтезатора (разд. 2.2.7.1). Концепция группы Мерка (разд. 2.2.5.3) состояла в построении фрагментной конденсацией S-белка и соединении его с синтетическим S-пептидом. Невысокая (20 — 30%) величина полученной биологической активности объясняется неоднородностью конечного продукта синтеза. [c.404]

Синтез олигонуклеотидов был осуществлен фосфорамидит-ным методом на автоматическом синтезаторе ASM102U. Очистка олигонуклеотидов проводилась на установке OPS 201. Синтезировано 5 специфических олигонуклеотидов, различающихся по составу и длине 5 -АСА-ТТС-ТАТ-ТТА-ААС-ТАС-ТТС-Т-3 (1), 5 -GAA-GTA-GGA-A -AGA-TGT- TG-3 (2), [c.47]

Синтез полипептидов является весьма тонкой и специфической, универсальной экспериментальной задачей, требует большого искусства, знаний и навыков. В последние годы сконструированы специальные автоматические синтезаторы полипептидов и получены на них весьма сложные полипептиды гормоны (например, скотофобин, снимающий страх), антибиотики (грамицидин, актиномицин), витамины. [c.669]

Верховный суд США, слушая дело Даймонд против Чакрабарти, вынес вердикт, что микроорганизмы, полученные генноинженерными методами, могут быть запатентованы Поступили в продажу первые автоматические синтезаторы ДНК [c.18]

С появлением приборов для автоматического химического синтеза ДНК (ДНК-синтезаторов) получение одноцепочечных олигонуклеотидов длиной <50 звеньев стало более или менее рутинной процедурой. Основным компонентом любого ДНК-синтезатора является система клапанов и насосов, с помощью которых в реакционную смесь по строго заданной программе вводятся нуклеотиды и реагенты, обеспечивающие присоединение нужных мономерных единиц к растущей цепи. В отличие от биологического, в ходе химического синтеза ДНК каждый новый нуклеотид можно присоединять к 5 -гидроксильному концу цепи. Все реакции осуществляются последовательно в одной реакционной колонке, а продолжительность каждой из них и время отмывания контролируются с помощью компъютера. [c.80]

Чтобы выход продукта был достаточно высок, эффективность присоединения нуклеотидов на каждом этапе должна быть не ниже 98%. Эффективность контролируют спектрофотометрическими методами, определяя количество удаляемых тритильных групп. Если, например, при синтезе 20-членного олигонуклеотида эффективность каждого цикла равна 99%, то 82% (т. е. 0,99 100) олигонуклеотидов будут иметь именно такую длину. Если же синтезируется 60-членный олигонуьслеотид, то при той же эффективности только 55% олигонуьслеотидов будут содержать по 60 нуклеотидов. А если средняя эффективность цикла не превышает 98%, то доля олигонуклеотидов заданной длины будет гораздо ниже (табл. 5.1). Фирмы - изготовители коммерческих ДНК-синтезаторов обычно гарантируют среднее значение эффективности присоединения 98%. Но для этого необходимо использовать реагенты и химикаты очень высокой степени чистоты, что не всегда удается выполнить. Как правило, реальная эффективность присоединения составляет 95%, хотя иногда удается достичь и 99%-ной эффективности. Чтобы получить олигонуклеотиды заданной длины, первичные продукты большинства химических синтезов необходимо очистить с помощью либо высокоэффетивной жидкостной хроматографии под высоким давлением с обращенной фазой, либо электрофореза в полиакриламидном геле. Поскольку все неудачные последовательности короче, чем тот олигонуклеотид, который хотят получить, сделать это нетрудно. [c.85]

К сожалению, обычно бывает неизвестно, какую нуклеотиднуто замену в клонированном гене нужно произвести, чтобы получить белок с нужными свойствами. Поэтому часто приходится изменять один определенный нуклеотидный сайт всеми возможными способами. Например, можно синтезировать олигонуклеотидные праймеры, в одном из сайтов которых находятся разные нуклеотиды. Такие вырожденные олигонуклеотиды обычно получают, добавляя в автоматический синтезатор ДНК на определенном этапе, когда к цепи должен просоеди-няться специфический нуклеотид, небольшое количество (до нескольких процентов) трех других нуклеотидов (рис. 8.5). В результате получается гетерогенный по одному сайту набор олигонуклеотидных праймеров, с помощью которых можно получить соответствующий набор мутантных генов-мишеней с нуклеотидными заменами в специфическом сайте. [c.163]

Гетероядерный контроль. Многие современные спектрометры, использующие синтезаторы частоты, позволяют применять гетероядерный внутренний контроль по сигналу гетероядра, в частности по сигналу 0. Этот сигнал может происходить от дейтерораство-рителя, если соответствующая линия спектра ЯМР достаточно [c.143]

Все экспериментальные операции в твердофазном синтезе легко автомати-уются. Поэтому в настоящее время этот синтез осуществляется с помощью боров — синтезаторов, в которых все операции совершаются в запро-ммированной последовательности. Если в классическом синтезе для присоеди-ИЯ одной аминокислоты требовались дни и недели, то в твердофазном синте-лепь можно удлинить на 6 аминокислот в сутки. [c.361]

Таким образом, имея соответствующий набор аминокислот с защищенной аминной и активированной карбоксильной группами, и используя соответствующим образом модифицированный полимер, можно с помощью несложных операций синтезировать пептиды различной последовательности. Такой подход дает также возможность автоматизировать соответствующие операции и создать машину-синтезатор (1968 г., Меррифилд синтез природного белка-рибонуклеазы). [c.464]

Для аппаратурной реализации метода применялись следующие серийные приборы 1 - синтезатор частоты 46-31 2 - реверсивный счетчик Ф5264 3 - генератор импульсов Г5-56 4 - УЗ дефектоскоп УД-10П 5 - осциллограф С1-99 9 - электронно-счетный частотомер 43-38 10 -реверсивный счетчик Ф5264 77 - генератор Г5-56. [c.107]

Специфической особенностью полипептидного синтеза является огромное число идентичных стадий, которые необходимо проводить на каждом этапе удлинения цепи образование новой пептидной связи, удаление защитной группы для подготовки к следующей стадии элонгации цепи и промежуточные отмывки от избытка реагентов и, побочных продуктов после каждого химического превращения. Метод, предложенный Робертом Меррифилдом, дал возможность автоматизировать этот процесс и снизить механические потери. Согласно этому методу, первый мономер во вновь строящейся цепи синтезируемого полипептида ковалентно связывается с нерастворимым носителем (смолой) и все последующие стадии проводятся с полипептидом, растущим на этой смоле. Этот метод известен как твердофазный синтез полипептидов. К смоле попеременно добавляют очередной синтон и реагент для удаления концевой защитной группы, остаток). Химические стадии перемежаются соответствующими промывками. В течение всего процесса полипептид остается связанным со смолой. Поместив в колонку смолу, с которой связан синтезируемый пОлипептид, можно легко автоматизировать процесс, запрограммировав смену потоков через колонку синтон (мономер) — растворитель — смесь для удаления защиты — растворитель и т.д. Разработаны специальные приборы для автоматизированного полипептидного синтеза. Так, уже упоминавшийся синтез протеазы ВИЧ-1 провели на автоматическом пептидном синтезаторе <АррИе(1 Biosystem> и потребовалось около двух-10- 291 [c.291]

Синтез. Осуществление белкового синтеза химическим путем привлекало внимание многих исследователей. Метод твердофазного синтеза, разработанный Б. Меррифилдом, дал возможность получать достаточно большие полипептиды. Таким же способом был получен гормон инсулин, а его уже можно отнести к классу белков. В случае инсулина более трудной задачей было соединение двух полипептидных цепей в активную макромолекулу. К. Диксон и А. Уардлоу справились с этой задачей и положили основу химического синтеза белков. Однако несмотря на разработку автоматических синтезаторов, метод химического синтеза белков не получил щирокого распространения из-за наличия большого числа технических ограничений. В природе небольшие полипептиды синтезируются с помощью соответствующих ферментов, основная же масса белков образуется посредством матричного синтеза. [c.40]

В последние годы создан колоночный вариант твердофазного сиитеза пептидов. В качестве матрицы вначале использовалась полярная полиамидная смола. Этот желатинообразный полимер хорошо проницаем и сольватируется многими растворителями, включая воду и диметилформамид. Мягкие полимеры такого типа в колоночном варианте имели неудовлетворительные физико-химические и механические свойства. Р. Шеппард и сотр. пред.южнли использовать жесткий макропористый неорганический носитель — силикагель, в порах которого заполимеризован полидиметилакрил-амидный гель. Этот носитель, сочетающий в се е свойства жесткой матрицы и хорощо набухающего органического геля, нашел успешное применение в ко.аоночном твердофазном синтезе. На его основе создан и синтезатор колоночного типа. [c.147]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология