Меррифилда синтез

В чем заключается принцип твердофазного синтеза полипептидов, предложенный Р.Меррифилдом 393 [c.393]

Замечательные успехи в синтезе белков, достигнутые в последние годы, стали возможны после того, как Меррифилдом был разработан метод синтеза на твердом носителе. Принцип метода состоит в том, что исходная С-концевая аминокислота связывается ковалентно с нерастворимым полимером пространственной структуры и затем все последовательные стадии синтеза пептидной цепи проводятся на этом носителе. При этом отпадает необходимость выделения на каждой стадии синтеза полученных пептидов, так как они остаются привязанными к носителю, и становится возможным простой промывкой носителя удалять побочные продукты синтеза и непрореагировавшие исходные вещества. [c.381]

Стратегическую модификацию постепенного наращивания пептидов или белков представляет разработанный в 1963 г. Меррифилдом пептидный синтез на полимерных носителях. Несмотря на сенсационный успех этого метода (синтез протекает в двухфазной системе и есть возможность его автоматизации), возлагаемые на него большие ожидания до сих пор полностью не исполнились. [c.98]

Удивительно простая идея этого нового метода синтеза состоит в том, что аминокислота закрепляется через свою карбоксильную группу на нерастворимом легко фильтруемом полимере, и затем пептидная цепь постепенно наращивается с С-конца. Для этой цели К-замещенные аминокислоты вводят в реакцию с реакционноспособными группами полимерной смолы. С аминокислоты, ковалентно соединенной с полимерной частицей, удаляется Ы-защитная группа, и полученный аминоацильный полимер реагирует со следующей Ы-защищенной аминокислотой. Пептидная цепь ступенчато наращивается на полимерной матрице. На последней стадии синтеза Меррифилда расщепляется ковалентная связь между С-концевой аминокислотой построенной полипептидной цепи и якорной группировкой полимерного носителя. Нерастворимый носитель может быть отделен от находящегося в растворе полипептида простым фильтрованием. Решающее преимущество метода Меррифилда состоит в том, что избегают трудоемких и требующих много времени операций по очистке промежуточных продуктов. Ценный продукт реакции все время остается прикрепленным к полимерному носителю, в то время как избытки реагентов и побочные продукты удаляются фильтрованием. Простота эксперимента и возможность автоматизации привели сначала даже к мнению, что благодаря этой новой синтетической концепции будет, наконец, решена проблема химического синтеза ферментов и других белков. Однако после подробного изучения и интенсивной разработки этой новой техники синтеза были выявлены серьезные лимитирующие факторы, которые впоследствии привели к реалистической Оценке этого метода. Конечно, сведение трудных стадий высаживания и очистки при обычных методах в растворе к простому процессу фильтрования в твердофазном синтезе уже означает неоспоримое преимущество. [c.179]

Синтез пептидов на твердой фазе (синтез Меррифилда) [c.179]

Хотя все описанные методы пептидного синтеза с применением нерастворимых или растворимых полимерных носителей основаны на главном принципе, введенном Меррифилдом, понятие синтез Меррифилда следует употреблять специально для пептидного синтеза с твердыми носителями. По причине громадного количества работ, появившихся с 1963 г., полный [c.179]

Рис. 2-12. Схема синтеза Меррифилда.

Рис. 2-16. Якорные группировки для синтеза Меррифилда [404].

Основываясь на фотолабильных якорных группировках, Меррифилд разработал так называемую ортогональную концепцию защит для твердофазного пептидного синтеза [420]. С этой целью вводятся защитные группы различных типов, которые могут селективно отщепляться при действии разных реагентов. [c.185]

Рис. 2-18. Реакционный сосуд для синтеза Меррифилда.

Описанная проблематика защитных групп при твердофазном пептидном синтезе показывает, что различные лимитирующие факторы метода Меррифилда тесно связаны с указанными неразрешенными (или же недостаточно разрешенными) вопросами. Совокупность этих проблем не может здесь подробно обсуждаться, поэтому желающие отсылаются к литературным источникам [391—396, 420]. [c.188]

После п-кратного повторения реакционных стадий III и IV (рис. 2-12) желаемая пептидная последовательность строится на полимерном носителе на стадии V. Несмотря на указанные недостатки, твердофазный пептидный синтез открыл новые возможности для автоматизации. Первый аппарат был сконструирован Меррифилдом и сотр. [440] (рис. 2-20). [c.191]

Если проанализировать все проведенные синтезы Меррифилда (табл. 2-9), то станет ясно, что это в основном работы в период между 1968 и 1972 гг. В это время во многих новых лабораториях — а их количество в США со времени опубликования концепции Меррифилда увеличилось в десять раз — начали проводить синтезы пептидов на носителях, чему в значительной степени способствовала коммерческая доступность синтезаторов. Очевидно, разочаровывающие результаты при попытках синтеза белков привели к реалистической оценке возможностей метода. Попытка синтеза лизо-цима привела, например, к смеси полипептидов, которая обладала 0,5—1% специфической активности [455]. Гораздо успешнее был синтез рибонуклеазы А [449], хотя и в этом случае выход составлял всего 16%. На этом ферменте с помощью твердофазной техники проведено интересное изучение взаимосвязи строения и активности [467]. Несомненно, что биологическая активность не является критерием гладкого течения твердофазного синтеза. Синтез белка, состоящего из 188 аминокислот, который сначала считали гормоном роста человека, дал смесь белков с заметной биологической активностью. Несколько позднее было, однако, показано, что положенная в основу синтеза первичная структура не подтвердилась [453, 468]. Синтез длинноцепочечных пептидов и белков по методу Меррифилда в настоящее время и в обозримом будущем уже не может отвечать тем высоким требованиям, которые предъявляются к синтезу биологически активных соединений. [c.193]

Несмотря на это, работы Меррифилда положили начало новому направлению пептидного синтеза, которое следует рассматривать не просто [c.193]

Жидкофазный пептидный синтез, хотя и не дает возможности разделения промежуточных продуктов, имеет, однако, преимущество условия реакции гораздо ближе к условиям традиционных методов. Полного превращения здесь можно добиться тоже только с помощью больших избытков ацилирующего средства и многократного повторения стадий конденсации. Кроме того, растущие цепи пептидов — в большинстве случаев уже начиная с гептапептидов — влияют на растворимость полимерных носителей. Получающиеся при этом (даже при применении диметилформамида) вязкие растворы затрудняют дальнейшее теченне синтеза. Хотя жидкофазный метод также может быть автоматизирован, он не получил такого широкого применения, как метод Меррифилда. [c.215]

В 1969 г. Меррифилд сделал попытку осуществить химический синтез фермента рибонуклеазы. [c.344]

Таким образом, имея соответствующий набор аминокислот с защищенной аминной и активированной карбоксильной группами, и используя соответствующим образом модифицированный полимер, можно с помощью несложных операций синтезировать пептиды различной последовательности. Такой подход дает также возможность автоматизировать соответствующие операции и создать машину-синтезатор (1968 г., Меррифилд синтез природного белка-рибонуклеазы). [c.464]

Первой стадией пептидного синтеза Меррифилда является сшивание аминокислот (с защищенной азотной функцией) схлор-метилированным полистиролом путем образования сложноэфирной группы. Эту стадию можно ускорить, используя калиевую соль Вос-аминокислоты и молярное количество 18-крауна-6 в ДМФА (972]. [c.131]

Процесс АТФСП (синтез Меррифилда) проводится с использованием в качестве матрицы, на которой осуществляется синтез, полистирола, 1% (мол.) арильных групп в котором содержат метиленхлоридные (или метиленбромидные) а-заместители [c.353]

В 1963 г. Р. Меррифилд [722] разработал важный метод, который с тех пор применяется для синтеза многих пептидов [723]. Этот метод называется твердофазным синтезом, или синтезом на полимерных подложках [724]. Здесь используются те же реакции, что и в обычном синтезе, но один из реагентов закреплен на твердом полимере. Например, если желательно соединить две аминокислоты (получить дипептид), то в качестве полимера может выступать полистирол, содержащий боковые группы H2 I (рис. 10.1, 99). Одну из аминокислот, защищенную трет-бутоксикарбонильной группой (Вое), закрепляют на боковых группах (стадия А). Нет необходимости, чтобы все боковые группы вступили в реакцию достаточно, чтобы это произошло с некоторыми из них. Затем гидролизом в присутствии трифтороуксусной кислоты в дихлорометане снимают защитную группу Вое (стадия Б) и к иммобилизированной аминокислоте присоединяют другую аминокислоту, используя ДЦК или другой агент сочетания (стадия В). После этого удаляют вторую защитную группу Вое (стадия Г), что дает дипептид, все еще закрепленный на полимере. Если этот дипептид и есть желаемый продукт, его можно снять с полимера действием HF (стадия Д). Если необходимо получить пептид с более длинной цепью, прибавляют другие аминокислоты, повторяя стадии В и Г. [c.156]

Хлорметилированный сополимер стирола с дивииилбензолом применяется в качестве твердого носителя при синтезе полипептидов по методу Меррифилда (см. с. 381). [c.230]

Твердофазная техника приводила к существенной экономии труда и времени, необходимых для пептидного синтеза. Так, например, ценой значительных усилий Хиршмен с 22 сотрудниками [5f] завершили вьщающийся синтез фермента рибонуклеазы (124 аминокислотных остатка) с помошью традиционных жидкофазных методов. Почти одновременно тот же белок был получен путем автоматизированного твердофазного синтеза [5g], Во втором случае синтез, включающий 369 химических реакций и 11 931 операцию, был вьшолнен двумя участниками (Гатте и Меррифилд) всего за несколько месяцев (в среднем до шести аминокислотных остатков в день присоединялись к растущей полипептидной цепи — фантастический темп ). Последующие усовершенствования позволили построить полностью автоматический синтезатор. Таким образом, дерзновенная и волнующая проблема пептидного синтеза, решение которой ранее требовало огромных затрат труда и времени, теперь может считаться практически решенной (по крайней мере, для не слишком сложных пептидов). [c.302]

Потенциальные возможности Т.е. были продемонстрированы синтезом рибонуклеазы А (Р. Меррифилд, 1969) и гормона роста человека (Д. Ямаширо, 1970) длиной 124 и 183 аминокислоты соответственно. Однако в связи с не- [c.505]

В период между 1944 н 1954 гг. развивались аналитические исследования по выделению, очистке и определению строения пептидов с высокой биологической активностью, а также методические разработки в области синтеза, например в 1950 г. был разработан метод смешанных ангидридов (Виланд, Буассона, Воган). Эти успехи сделали возможным химический синтез природных пептидов, обладающих биологической активностью. В 1953 г. дю Виньо удалось синтезировать первый пептидный гормон — окситоцин. Эта работа была удостоена Нобелевской премии за 1955 г. В следующие годы наступило бурное развитие синтетической пептидной химии, было предложено несколько новых защитных групп, эффективные методы кои-деисаш1и и иовые методические варианты, такие, как разработаниь й Меррифилдом в 1962 г. пептидный синтез иа полимерных носителях. Химический синтез инсулина и рибонуклеазы ознаменовал переход к белковому синтезу. [c.100]

Нерастворимые полимерные эфиры являются чрезвычайно интересным классом карбоксизащитных групп, из которых полимерный беизиловый эфир является прототипом разработанного Меррифилдом твердофазного синтеза пептидов. Проблема синтеза на полимерных носителях излагается (разд. 2.2.7). [c.120]

Эта опасность существует в основном в случае синтезов на твердых носителях по Меррифилду (разд. 2.2.7.1), где, как правило, вводятся больщие избытки активированных карбоксикомпонентов. [c.131]

Однородные продукты реакции получаются только в том случае, если как конденсация, так и деблокирование протекают практически количественно. Так как эти тоебования не всегда выполнимы, то на носителе накапливаются примеси. Поэтому после снятия пептида с носителя требуется тщательная очистка конечного продукта. Отмена очистки промежуточных продуктов в случае синтеза Меррифилда, декларированная вначале как удобства, оказалась впоследствии сомнительным преимуществом. [c.179]

Согласно Шеппарду [401], различные лимитирующие факторы синтеза Меррифилда можно объяснить различием полярностей углеводородной основы полимерной матрицы и растущей на носителе пептидной пепи (рис. 2-15). [c.182]

Селективное отщепление №-замещенной группы (III, рис. 2-12) — следующая ступень синтеза Меррифилда.. Выбор N -аминозащитной группы зависит как от прочности связи между исходной аминокислотой и полимерным носителем, так и от защитных групп на функциях боковых цепей. Требования к защитным группам, применяемым в твердофазном синтезе, особенно велики в отношении селективности отщепления. [c.187]

Гуанидиновая группа аргинина может блокироваться нитрованием или тозилированием. Последний метод, очевидно, предпочтительнее, так как тозильный остаток может быть удален как посредством HF, так и с помощью расщепления бортрис-(трифторацетата) [427]. В случае нитроаргинина существует опасность расщепления с образованием орнитина. Все еще недостаточно решена проблема защиты цистеина при твердофазном синтезе, хотя перепробовано множество вариантов. Амидные группы глутамина и аспарагина целесообразно защищать. Общеизвестные побочные реакции при применении многофункциональных аминокислот, такие, как, например, транспептидация в случае аспарагиновой кислоты или образование пирролидон-5-карбоновой-2 кислоты с глутамином, представляют опасность также и в случае синтезов Меррифилда. [c.188]

Главная проблема синтеза Меррифилда состоит в том, чтобы все реак-щ и ацилирования и деблокирования проводить количественно. Так как это требование при гетерогещых реакциях не всегда выполнимо, происходит образование ошибочных последовательностей или неполных последовательностей [430, 431] (рис. 2-19). [c.189]

Чтобы обойти эти трудности, метод был модифицирован [434, 435] N-защищенные аминокислоты ноногенно фиксируются иа свободных аминогруппах носителя перед добавкой ДЦГК избыток нефиксированных N-защищенных аминокислот можно вернуть промыванием дихлорметаном. Легко вымываются активированные эфиры. Для синтезов Меррифилда применялись различные типы эфиров. Правда, оии требуют значительно большего времени реакции, чем конденсация по ДЦГК-методу [436]. Другие методы активирования, включая их различные варианты, тоже не столь эффективны, как ДЦГК-метод. [c.190]

Отщепление синтезированного пептида от полимерного носителя , рис. 2-12) составляет последнюю стадию синтеза Меррифилда, а последующая очистка полученной смеси продуктов — самая трудная операция. Снятие полимера осуществляется с помощью реагентов, которые либо селективно расщепляют якорную связь между С-концевой аминокислотой и носителем, либо одновремеино с этим позволяют частично или полностью деблокировать полипептид. Связь типа алквлзамещенного бензилового эфира лучше всего расщепляется ацидолизом. Для этого часто применяются растворы бромоводорода в трифторуксусной кислоте, уксусная кислота меньше подходит в качестве растворителя из-за опасности ацетилирования гидроксиаминокислот. Описаны также многие отщепления при помощи безво- [c.192]

Используя несомненные преимущества метода Меррифилда, уже сегодня можно сравнительно быстро синтезировать пептидные фрагменты, которые могут быть получены с высокой степенью чистоты при помощи имеющейся теперь техники фракциоиирювания. Конденсация таких фрагментов с помощью обычных методов, позволяющих проводить тщательную очистку и анализ после каждой стадии, указывает путь иа ближайшее будущее. Наряду с этим с помощью твердофазного синтеза следует получать короткие биологически активные пептиды и прежде всего многочисленные аналоги. Хотя трудно установить предел длины цепи, позволяющий использовать этот метод для успешного получения пептидов, но пептиды, включающие 10—15 аминокислот, — вот, по-видимому, предпочтительные объекты синтеза. Главные проблемы, решение которых позволит преодо- [c.194]

Ступенчатое наращивание пептида с применением второй фазы впервые проведено Меррифилдом на примере твердофазного пептидного синтеза (разд. 2.2.7.1). При реакциях в гетерогенной фазе вероятность встречи реагирующих партнеров гораздо ниже, чем в гомогенном растворе. Для получения высокой степени превращения требуется значительный избыток ацилирующего средства. Преимуществом этой стратегии является простота технических операций и связанная с этим возможность автоматизации. Трудные операции очистки промежуточных веществ традиционного синтеза заменяются простыми процессами фильтрования и промывания. Однако на этом пути однородный продукт синтеза получается только в том случае, если каждая реакция в гетерогенной фазе протекает практически количественно. Несмотря на большие избытки карбоксикомпонента, использование которых чревато опасностью N-ацилирования пептидной связи, полное превращение на каждой стадии в настоящее время недостижимо. На практике средний выход на одну стадию 95—99%, что недостаточно для синтеза длинных пептидов или белков. Средние выходы на одну стадию и полные выходы (в зависимости от длины цепи) приведены в табл. 2-10. Как показывает практика, короткоцепочечные пептиды или их аналоги длиной до -15 аминокислотных остатков могут быть получены твердофазным методом. Трудности при синтезе небольших белков наглядно демонстрируются данными табл. 2-10. Еще хуже сказывается накопление не- [c.214]

Табтца 2-10. Выходы на одну конденсацию и общие выходы в зависимости от длины цепи при синтезах Меррифилда [533] [c.214]

В последние годы отмечается повыщенный интерес к кислотоустойчивым временным защитным группам, отщепляемым в слабощелочных условиях (разд. 2.2.4.1 и табл. 2-1). Такие группы можно использовать в комбинации с постоянными защитными группами mpem-бутильного типа. Комбинация этих защитных групп была с успехом применена при синтезе пептидов по Меррифилду (разд. 2.2.7). Эта так называемая ортогональная концепция защиты для твердофазного синтеза очень интересна с тактической точки зрения (с. 185). И наконец, следует обратить внимание на уже обсуждавшуюся возможность фотолитического отщепления защитных групп, а также упомянуть защитые группы, которые можно удалить лищь в особых условиях (например, с помощью протеаз). Значение ферментативного деблокирования [476, 552—555] в будущем может возрасти. [c.223]

Рибонуклеаза была первым ферментом, который удалось получить полным химическим синтезом. Гутт и Меррифилд синтезировали цепь с С-конца на твердой фазе с использованием автоматического синтезатора (разд. 2.2.7.1). Концепция группы Мерка (разд. 2.2.5.3) состояла в построении фрагментной конденсацией S-белка и соединении его с синтетическим S-пептидом. Невысокая (20 — 30%) величина полученной биологической активности объясняется неоднородностью конечного продукта синтеза. [c.404]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология