Гель-фильтрация, определение молекулярного веса

При исследовании белков гель-фильтрация пользуется особым вниманием как простой аналитический метод решения ряда задач, например определения молекулярно-весового распределе-иия в биологических жидкостях, сопоставления размеров белковых молекул, определения молекулярного веса на уровне нескольких микрограммов. Несомненным достоинством метода является возможность одновременного сравнения 30 образцов. [c.263]

В соответствии с определением, данным в статье 11, а], при гель-фильтрации используют водные растворы и гидрофильные гели, а при гель-проникающей хроматографии — органические растворители и гидрофобные гели. Фильтрование через гель применяется при биохимических исследованиях и при изучении природных соединений, гель-прони-кающая хроматография — для исследования синтетических высокомолекулярных соединений. Указанные методы включают также хроматографирование, или фильтрование , на молекулярных ситах 12]. Гель обычно характеризуют размерами молекул (точнее, интервалом молекулярных весов молекул), которые он достаточно эффективно разделяет. [c.399]

В предыдущей главе на отдельных примерах мы рассмотрели возможные пути применения гель-хроматографии. При этом, подбирая иллюстративный материал, мы руководствовались лишь методическими аспектами и совершенно не принимали во внимание., к какому классу принадлежат исследуемые вещества. Такой подход был вполне оправдан, поскольку приемы при работе с веществами разных классов в значительной мере одинаковы. В разделах Гель-фильтрация и особенно Определение молекулярного веса рассмотрена значительная часть имеющихся экспериментальных результатов. В раздел же Гель-хроматография была включена лишь очень небольшая часть обширного материала, описанного в литературе (в основном из области биохимических исследований). Поэтому в настоящей главе речь пойдет главным образом о "таких экспериментах, которые ранее-мы относили к гель-хроматографии в узком смысле. Эти данные в основном касаются разделения более или менее сложных смесей на относительно высоких слоях геля, поскольку присутствующие в них компоненты мало различаются по молекулярному весу. [c.211]

Гель-фильтрация восстановленных полипептидных цепей в 6М гуанидингидрохлориде позволяет производить оценки молекулярного веса в диапазоне 80000—1000 [147]. В поддиапазоне 40 000—10 000 точность метода 7% и на краях диапазона — 10%. В качестве среды для гель-фильтрации используют колонку Био-Гель А-5М с номинальным содержанием агарозы 6%. Определение молекулярного веса осуществляется по принципу сравнения с белками-маркерами известного молекулярного веса на полулогарифмическом графике зависимости молекулярного веса от коэффициентов распределения либо от где Ve — объем элюирования и Уо — исключенный объем (см. разд. 5.3 и 5.5). [c.427]

В последнее время большой интерес вызывает использование гель-фильтрации для определения молекулярных весов. Теоретическим путем было выведено несколько уравнений, описывающих процессы при гель-фильтрации в колонках [291—293]. Этот метод приспособлен для применения в тонкослойной хроматографии на пластинках [294]. Недавно полученные точные данные [295, 296[ свидетельствуют о применимости этого метода для компактных глобулярных белков. Однако обнаруженные аномалии касаются главным образом гликонротеинов. [c.98]

Растворы белков обладают многими свойствами, которые характерны для лиофильных коллоидных растворов. Молекулы белков не проходят через полупроницаемые мембраны, и это используется для их очистки от низкомолекулярных примесей при помощи диализа. Представляет большой интерес определение размеров, формы белковых молекул и молекулярных весов белков. Для этой цели используется целый ряд физико-химических методов. Так, белки в растворах седиментируют в ультрацентрифугах при ускорениях до 200 ООО g , величины констант седиментации колеблются от 1 Ю до 90—100 сек. Коэффициенты диффузии — в пределах от 0,1 10 до 10- 10 средний удельный объем — около 0,75 см г. Размеры и форму (асимметрию) частиц белка определяют, кроме того, методами светорассеяния, двойного лучепреломления в потоке, измерениями вязкости, коэффициента вращательной диффузии, но, по-видимому, наиболее точно — прямым наблюдением в электронном микроскопе в тех случаях, когда молекулы белка достаточно велики и когда удается преодолеть технические затруднения. Молекулярные веса, кроме названных выше способов, определяют методами осмометрии, гель-фильтрации, исследованием монослоев белков на поверхности жидкой фазы, светорассеяния и др. [c.30]

Для некоторых растворов полимеров вязкость является решающим фактором при прядении. Найдено, что наивысшая вязкость, исключая гели, обеспечивает наилучшие условия прядения [51. Для других полимеров вязкость не имеет такого значения, поскольку в этих случаях, очевидно, существенную роль играет и ряд других факторов. При данном молекулярном весе полимера более высокие вязкости обусловлены более высокими концентрациями. Последние желательны, так как при этом, кроме облегчения образования волокна [46], увеличивается эффективность емкостей, используемых для хранения растворов полимеров, и уменьшается разбавление коагуляционной ванны во время прядения. Однако на практике существует определенный предел применяемой концентрации, который обусловливается трудностью фильтрации, транспортировки и продавливания очень вязких растворов. При любой температуре вязкость очень быстро увеличивается с ростом концентрации, причем это возрастание тем сильнее, чем выше молекулярный вес полимера [6]. Полиакрилонитрил с молекулярным весом 120 ООО и вязкостью 18%-ного раствора 450 пуаз при 100° 171 и полиакрилонитрил с молекулярным весом 89 000 и вязкостью 11%-ного раствора 180 пуаз при 140° [8] признаны пригодными для прядения. Повышение температуры уменьшает вязкость, и этот метод находит применение на практике, однако, он является ограниченным при любом способе мокрого прядения, [c.350]

Значения молекулярных весов разных форм НАД-киназы, определенные методом гель фильтрации, совпадают с величинами, определенными методом электрофореза в градиенте концентрации ПААГ, за исключением низкомолекулярной формы НАД-ки- 230, назы с молекулярным весом 45000, которую при гель-фильтрации обнаружить не удавалось. [c.139]

Мы не нашли в доступной нам литературе аналогичных данных о разделении при УЦ в присутствии субстратов олигомерных белков на каталитически активные и неактивные формы. Возможно, что отсутствие подобных результатов объясняется тем, что при исследовании четвертичной структуры ферментов методом УЦ в условиях протекания ферментативной реакции место локализации фермента в центрифужной пробирке определяли исключительно по активности. По этой причине присутствие неактивной белковой фракции могло остаться просто незамеченным. Между тем нельзя, по-видимому, полностью исключить возможности существования и для -других ферментов каталитически активной и неактивной форм. Высказанное соображение можно проиллюстрировать следующим примером. Из данных литературы известно, что молекулярный вес гомогенного препарата НАД-киназы из печени голубя, определенный методом гель-фильтрации, равен 270 000 [19]. Мы анализировали методом УЦ в присутствии субстратов частично очищенные препараты фермента из печени голубя и не смогли обнаружить каталитически активной формы с таким высоким молекулярным весом. Однако 60% активности [c.157]

В настоящее время имеется ряд новых методов определения молекулярного веса, которые могут соперничать с ультрацентрифугированием. Один из них — это простая гель-фильтрация. Колонку тщательно заполняют гелем (например, сефадексом) и калибруют, пропуская ряд белковых растворов. Измеряют Уе — объем элюата, собранного с момента нанесения вещества на колонку до момента его выхода из колонки, и делят этот объем на Уо — объем элюата для очень крупных частиц, совершенно не проникающих внутрь частиц геля. Далее строят зависимость Уе/Уо ОТ логарифма мол. веса для ряда белков с известным молекулярным весом. Как и при оценке молекулярных весов по константам седиментации, здесь предполагается, что молекулы всех белков имеют примерно сферическую форму для неизвестного белка значение молекулярного веса определяют по местоположению отвечающей ему точки на описанном выше графике [153, 154]. Модификацией этого метода служит хроматография при высоких концентрациях гуанидинхло-рида — соли, вызывающей денатурацию белков. Предполагается, что в таком растворителе белковая молекула представляет собой статистический клубок [154]. [c.182]

Тонкослойный вариант гель-фильтрации был предложен Детер-маном [6], а также Иоханссоном и Римо [11 ] и оказался весьма полезным для микроанализа и быстрого сравнительного анализа нескольких образцов исследуемого материала. Эндрюс [1 ], а позднее Моррис [12] применили тонкослойную гель-фильтрацию для определения молекулярного веса белков на основе установленной ими линейной зависимости между логарифмом молекулярного веса данного белка и расстоянием, пройденным им в слое данного носителя за определенный помежуток времени. В соответствии с этим можно ориентировочно определять молекулярные веса неизвестных белков, если одновременно проводить гель-фильтрацию стандартных белков известного молекулярного веса. Когда исследователь располагает достаточно чувствительными методами обнаружения белка в слое носителя, для определения молекулярного веса достаточно всего лишь нескольких микрограмм исследуемого материала. При определении молекулярного веса белков гель-фильтрацией в тонком слое следует иметь в виду, что подвижность данного белка при хроматографии в гель зависит не только от молекулярного веса, но и от формы его молекул. Поэтому определение молекулярного веса с помощью гель-хроматографии правомерно лишь в том случае, когда форма молекул исследуемого белка незначительно отличается от < рмы молекул стандартных белков, используемых для калибровки. [c.238]

В последние годы с помощью гель-хроматографии было очищено или выделено в чистом состоянии большое число ферментов. Конечно, этот новый метод ни в коей мере не может заменить традиционных методов очистки белков (например, осаждение растворителями или сульфатом аммония, а также ионообменную хроматографию). Однако гель-хроматография эффективно дополняет эти методы. Гели применяются главным образом для следующих целей I) удаление яизкомолекулярных примесей (гель-фильтрация, см. гл. IV) 2) отделение чужеродных белков на гелях соответствующей пористости (гель-хроматография) 3) определение молекулярных весов (см. табл. 26). В конце главы приведены работы (см. литературу, приложения I—III), в которых гель-хроматография явилась важным этапом при выделении фосфоэстераз и ряда других эстераз, а также дегидрогеназ, трансфераз и других ферментов. [c.212]

Возможность определения молекулярного веса с помощью гель-фильтрации всегда вызывала большой интерес. Этот вопрос подробно рассматривался в главе 5, а также в монографии Детермана [4]. Ряд авторов опытным путем показали, что между объемом выхода и молекулярным весом соединений существует [c.267]

В последние годы все большее распространение получает хроматографическое разделение веществ по их молекулярному весу, причем первое место среди таких вариантов хроматографии принадлежит гель-фильтрации на сефадексах . Сефадекс представляет собой полусинтетический -сорбент полисахаридной природы, гранулы которого обладают порами определенного размера, так что диффузия внутрь этих гранул возможна только для молекул, величина которых не превышает величину пор. Поэтому сефадекс работает как своего рода молекулярное сито , задерживающее проникающие внутрь гранул низкомолекулярные вещества и не задерживающее полимеры. Гель-фильтрация незаменима для быстрого отделения полимера от низкомолекулярных примесей (неорганических солей, мономеров и т. д.). Ее применяют и для разделения полимеров, причем одновременно можно приблизительно оценить их молек лярный вес, так как существует набор сефадексов, различающихся величиной пор. Есть все основания полагать, что в химии полисахаридов этот перспективный метод будет находить все большее применение. Особенно интересным является использование сефадексов для разделения высоко- и низкомолекулярных осколков, образующихся при расщеплении биополимеров различными реагентами , и для выделения полисахаридов из различных природных источников Хроматография на модифицированных сефадексах, обладаюш.их ионообменными свойствами, например на диэтиламиноэтилсефадексе, также может служить эффективным приемом фракционирования полисахаридов . [c.487]

В соответствии с данным выше определением в последующих примерах речь идет о разделении веществ, сильно различающихся по молекулярному весу. Именно благодаря гель-фильтрации раздёление на пористых гелях успешно конкурирует с давно применяющимся диализом. По сравнению с диализом гель-фильтрация обладает тем преимуществом, что эксперимент не требует столь длительного времени, а если умело подобрать условия, то время разделения не зависит от количества смеси. Этот фактор может оказаться решающим при изучении лабильных природных соединений. Единственный довод против гель-фильтрации— это возможное разбавление высокомолекулярного компонента (при диализе этого не происходит). Однако разбавление имеет место лишь в том случае, когда объем образца не соответствует объему геля. Точное соблюдение объемных соотношений (см. гл. П1) может оказать решающее влияние на успешное разделение. (Далее это положение поясняется на конкретном примере, см. фиг. 22.) [c.135]

К настоящему времени накоплен определенный опыт работы на сефадексах 0-25, 0-200, но совершенно нет данных относительно использования 0-10 и 0-15. Ряд экспериментов на полиакриламидных гелях выполнены Радолой [66, 67]. Так, он показал, что на био-геле Р-300 достигается лучшее разделение фер-ритина, чем на сефадексе 0-200. Особенно интересно расширить область применения тонкослойной гель-фильтрации путем освоения гелей агарозы. В этом случае удалось бы фракционировать вещества с молекулярным весом до 1 000 000 и выше. Предварительные опыты с 4—10%-ной (вес/объем) сферической агарозой показали, что такая методика вполне осуществима [45]. Действительно на геле агарозы были получены очень четкие зоны, к тому же оказалось, что при высыхании на пластинке агароза дает более равномерную пленку, чем сефадексы. [c.268]

Принцип гель-хроматографирования (гель-фильтрации), описанный Олтгелтом и Муром [20], заключается в следующем. Колонка заполняется студнеобразными частицами набухшего в растворителе сшитого полимера, содержащего поры с определенным набором по размерам. Образец полимера, подлежащий фракционированию по молекулярному весу, заливают в виде раствора в колонку и элюируют тем же растворителем. В зависимости от размеров макромолекулы проникают в соответствующие поры студня. Очень крупные молекулы остаются в промежутках между частицами студня и извлекаются с первыми порциями растворителя. Чем меньше размер молекул, тем при большем объеме элюирующей жидкости они будут извлечены из пор студня. [c.239]

За последние годы широкое применение для разделения высокомолекулярных веществ и определения их молекулярного веса нашел предложенный Л. Поратом и П. Флодином (Швеция) метод гель-фильтрации (гель-хромато- [c.316]

Наряду с атим существуют и другие методы разделения, например метод гель-фильтрации. Принцип разделения здесь примерно тот же, что используется при смягчении питьевой воды с помощью ионообмепни-ков. Только при гель-фильтрации в качестве обменника используют не синтетическую смолу, а специально обработанную целлюлозу, которой заполняют вертикально укрепленную стеклянную трубку (колонку) длиной от 10 сантиметров до 2 метров и соответствующего диаметра, смотря по надобности. Поверх целлюлозы наливают надосадочную жидкость, полученную после отделения рибосом и содержащую помимо мРНК и тРНК много других веществ. Ей дают просочиться через целлюлозу, причем разные вещества в зависимости от их размера и растворимости задерживаются в различных слоях целлюлозы. После этого через колонку пропускают определенные жидкости, например солевые растворы возрастающей концентрации, и задержанные вещества в зависимости от их молекулярного веса и растворимости последовательно вымываются (элюируются) из целлюлозы, элюат капает из колонки снизу и собирается отдельными порциями. [c.75]

Как правило, уже иа стадии выделения и очистки гликопротеина и определения его гомогенности исследователь, наблюдая поведение вещества в ходе соответствующих операций, может составить некоторое представление о молекулярном весе гликонротеина и нолучить самые предварительные сведения о форме его молекул. Так, например, обычно становится известным, являются ли растворы гликонротеина высоковязкими или нет, а также зависит ли в заметной степени их вязкость от ионной силы. Как правило, становится ясным, способен ли данный гликопротеин к денатурации, а также выясняется его поведение нри гель-фильтрации на колонках. Определение содержания в препарате сиаловой кислоты и сульфатных групп показывает, насколько сильно заряжены его молекулы. После выяснения этого вопроса необходимо решить, достаточно ли велик этот заряд, чтобы возникала необходимость в применении специальной обработки. Вообще [c.95]

Паркер и сотр. [72] в предварительных опытах показали, что восстановление и алкилирование дисульфидных связей в трансферрине по методу Крестфилда и сотр. [73] не вызывают диссоциации трансферрина на субъединицы. Это было доказано с помощью ультрацентрифугирования, методом седиментационного равновесия, с помощью гель-фильтрации на сефадексе Г-75, а также методом электрофореза на крахмальном геле в различных буферных системах (формиатный буфер pH 2,8, фосфатно-цитратный буфер pH 5,6 и боратный буфер pH 9,0) в присутствии мочевины. Кроме того, при определении N-концевых аминокислот в трансферрине динитрофениль-ным методом Сэнджера [74] и цианатным методом Старка и Смита [75] был обнаружен только один остаток валина при расчете на молекулярный вес 83 ООО, что согласуется с ранее опубликованной величиной молекулярного веса [76, 76а]. На основании описанных данных молекулу трансферрина можно представить в виде одной полипептидной цепи, содержащей примерно 750 аминокислот, и, следовательно, трансферрин является самым крупным из белков плазмы, который не был диссоциирован на субъединицы. [c.128]

Предварительные исследования нерастворимой ДНФ осажденной фракции [34] показали, что это сложное вещество обладает несколькими N-концевыми остатками и дисульфидными связями. Окисление его надмуравьиной кислотой с последующей гель-фильтрацией на сефадексе Г-25 приводило к разделению на четыре главных и меньший пятый компоненты. Углеводы были найдены главным образом только в одной из полос молекулярный вес этой фракции, определенный по поглощению в ультрафиолетовой области ДНФ-грунпы, был равен 4170. Аминокислотный состав выделенной фракции был следующим аспарагиновая кислота (1), треонин (2), серин (1), глутаминовая кислота (2), пролин (4), глицин (1), аланин (2), изолейцин (1), лейцин (2), тирозин (2), фенилаланин (1), аргинин (1) и цистеиновая кислота (3). Анализ углеводов позволил установить, что на ДНФ-группу приходится 2,8 остатка гексоз и 2,6 остатка гексозаминов. Обработка этой фракции проназой, пепсином и химотрипсином с последующим фракционированием гель-фильтрацией на сефадексе Г-25 позволило выделить фракцию, которая содержала, кроме углеводов, только тирозин и аспарагиновую кислоту. Таким образом, вполне вероятно, что углеводная часть связана с остатком аспарагиновой кислоты пептидной цепи. [c.238]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология