Олигонуклеотиды, электрофорез

В последние 15 лет были разработаны различные хроматографические методы, позволяющие фракционировать высокомолекулярные нуклеиновые кислоты для этой же цели применяют электрофорез. Хроматографией на бумаге и другими распределительными методами, а также ионообменной хроматографией удалось выделить продукты гидролиза нуклеиновых кислот. Определяя концентрации выделенных оснований, нуклеозидов, моно- и олигонуклеотидов, в настоящее время проводят количественный анализ с очень небольшим количеством гидролизата. [c.437]

Идентификация модифицированных нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи РНК долгое время была задачей особой трудности. С появлением современных методов секвенирования нуклеиновых кислот она существенно упростилась. Модификацию РНК или ее расщепление ферментами ведут таким образом, чтобы (как и при секвенировании) было затронуто в среднем только одно звено на молекулу (в чем есть дополнительный смысл, так как множественная модификация РНК искажает ее структуру). Далее, если изучается РНК небольшого размера или сегмент РНК, примыкающий к одному из ее концов, то этот конец метят радиоактивной меткой и задача идентификации модифицированного основания (после расщепления соответствующего звена) или атакованной нуклеазой межнуклеотидной связи сводится, как и при секвенировании, к определению длины фрагмента по его подвижности в высокоразрешающем электрофорезе в геле. В том случае, когда анализируемый район удален от концов молекулы на расстояние больше 150—200 н. о., используют реакцию обратной транскрипции (см. гл. 13). Для этого синтезируют олигонуклеотид, комплементарный участку РНК, расположенному вблизи от анализируемого района с З -концевой стороны молекулы, и далее используют его как праймер для обратной траискриптазы. Так как этот фермент останавливается на модифицйрованных остатках матрицы (или в том месте, где расщеплена фосфодиэфирная связь), то вновь по длине образующегося фрагмента можно определить положение модифицированного звена в РНК. [c.40]

Капиллярный гель-электрофорез Олигонуклеотиды, ДНК, полисахариды, определение молекулярных масс белков [c.364]

Двумерное фракционирование олигонуклеотидов в первом направлении — электрофорезом в кислом пиридин-ацетатиом буфере на полоске ацетилцеллюлозы, во втором — гомохроматографией или элюцией солевым градиентом на пластинке ДЭАЭ-целлюлозы. [c.460]

Сенжер и Коулсон создали метод анализа последовательности ДНК, который основан на ферментативном копировании однонитевых частиц ДНК [18]. Максам и Гилберт создали метод, в основу которого положена химическая модификация четырех оснований, входящих в состав ДНК, и который с одинаковым успехом применим как к однонитевым, так и к двунитевым молекулам ДНК [19]. Оба метода используют авторадиографическое определение згр-меченных олигонуклеотидов, которые разделяют в зависимости от их длины электрофорезом денатурированных фрагментов в полиакриламидном геле. На практике, успех этих методов во многом определяется недавними достижениями в энзимологии нуклеиновых кислот, особенно использованием ферментов рестрикции, расщепляющих молекулы ДНК, и обратной транскриптазы, с помощью которой получают циклические ДНК, комплиментарные РНК-матрице. Нижеследующее описание методики анализа будет, однако, предполагать наличие гомогенных образцов ДНК подходящей длины. [c.188]

Для анализа стандартных смесей олигонуклеотидов, образующихся в результате действия эндонуклеаз на РНК или ДНК, в последнее время широко применяются двумерная хроматография на бумаге или комбинация электрофореза и хроматографии на бумаге [35] (рис. И). Первичную хроматографию, или электро- [c.330]

Чтобы выход продукта был достаточно высок, эффективность присоединения нуклеотидов на каждом этапе должна быть не ниже 98%. Эффективность контролируют спектрофотометрическими методами, определяя количество удаляемых тритильных групп. Если, например, при синтезе 20-членного олигонуклеотида эффективность каждого цикла равна 99%, то 82% (т. е. 0,99 100) олигонуклеотидов будут иметь именно такую длину. Если же синтезируется 60-членный олигонуьслеотид, то при той же эффективности только 55% олигонуьслеотидов будут содержать по 60 нуклеотидов. А если средняя эффективность цикла не превышает 98%, то доля олигонуклеотидов заданной длины будет гораздо ниже (табл. 5.1). Фирмы - изготовители коммерческих ДНК-синтезаторов обычно гарантируют среднее значение эффективности присоединения 98%. Но для этого необходимо использовать реагенты и химикаты очень высокой степени чистоты, что не всегда удается выполнить. Как правило, реальная эффективность присоединения составляет 95%, хотя иногда удается достичь и 99%-ной эффективности. Чтобы получить олигонуклеотиды заданной длины, первичные продукты большинства химических синтезов необходимо очистить с помощью либо высокоэффетивной жидкостной хроматографии под высоким давлением с обращенной фазой, либо электрофореза в полиакриламидном геле. Поскольку все неудачные последовательности короче, чем тот олигонуклеотид, который хотят получить, сделать это нетрудно. [c.85]

Подводя итог, следует подчеркнуть, что для идентификации низших олигонуклеотидов очень удобны методы электрофореза и хроматографии на бумаге, особенно в двумерном варианте. Для разделения высших олигонуклеотидов значительно эффективней ионообменная хроматография, требующая большего количества вещества, но дающая очень четкие результаты. [c.335]

Далее проводили фосфорилирование всех олигонуклеотидов по 5 -концам радиоактивным фосфором за счет [7- PlATP с помощью Т4-полинуклеотидкпназы. Смесь меченых олигонуклеотидов разделяли электрофорезом в ПААГ, получая лестницу полос, как было описано при рассмотрении электрофореза [Остерман, 1981]. В отличие от методов секвенирования ДНК здесь каждой полоске ( перекладине лестницы ) соответствует фрагмент, укороченный точно на один нуклеотид по сравнению с фрагментом предыдущей полоски. Как и при секвенировании ДНК, меченые гидролизаты наносили в параллельные треки со сдвигом по времени в 4, 8 и И ч, а весь электрофорез проводили в течение 14 ч, с тем чтобы лучше разрешить разные по длине фрагментов участки лестницы . [c.508]

Далее, возможна прямая локализация спаренных участков цепи. Один из наиболее результативных подходов состоит в том, что после переваривания РНКазой, гидролизующей однотяжевые участки РНК, получающиеся двуспиральные фрагменты разделяются в электрофорезе сначала в неденатурирующих условиях (первое направление), а затем в условиях диссоциации двуспиральных комплексов (второе направление) таким образом, каждая полоса первого направления, представляющая собой двойную спираль, разделяется во втором направлении на два пятна, представляющих собой комплементарные тяжи, которые идентифицируются и локализуются на первичной структуре РНК. Таким путем удается выявить не только смежные (вдоль цепи) комплементарные участки, но и комплементарные взаимодействия между удаленными участками цепи РНК. Другой подход, особенно эффективный в выявлении дальних взаимодействий, состоит в фотоактивируемых сшивках оснований спаренных тяжей в составе структуры РНК с последующей идентификацией сшитых олигонуклеотидов. [c.74]

Фракционирование олигонуклеотидов в тонком слое играет центральную роль в некоторых методах секвенирования нуклепновых кислот, особенно тРНК, где из-за высокого уровня содержания модифицированных нуклеотидов методы секвенирования с использованием электрофореза в ПААГ наталкиваются на серьезные трудности. [c.496]

К описанным модификациям метода двумерного фракционирования олигонуклеотидов, ведущего свое происхождение от метода Сэнджера, мы снова вернемся в конце раздела при сопоставлении методов секвенирования тРНК, а сейчас остановимся на совершенно другом варианте двумерного фракционпрования олигонуклеотидов — с помощью ТСХ в обоих направлениях, т. е. без использования электрофореза. [c.500]

Такую смесь меченых фрагментов олигонуклеотида снова подвергают двумерному фракционированию электрофорезом на ацетилцеллюлозе и гомохроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, как описано выше, а затем проводят авторадиографию. Однако теперь вместо разбросанных по всей иластпнке иятен фингерприита получается зигзагообразная цепочка следующих друг за другом пятен (рис. 173), анализ расположения которых дает информацию о последовательности нуклеотпдов в олигонуклеотиде. [c.504]

Таким образом, для полного анализа последовательности любого полинуклеотида необходимо иметь, во-первых, метод получения четырех наборов специфических концевых продуктов, подобных тем, которые приведены втаблице 12, и, во-вторых, метод, позволяющий проводить сравнение длин этих продуктов. Различие современных методов анализа заключается в способах получения наборов специфических фрагментов. Общность — в способе сравнения длин, которое во всех случаях производится путем электрофореза радиоактивных концевых продуктов в пластинках полиакриламидного геля. По окончании электрофореза положение продуктов в геле определяют путем радиоавтографии. Каждый продукт проявляется в виде темной полосы на рентгеновской пленке сравниваются относительные подвижности полос в разных дорожках, подобно тому как сравнивались длины продуктов в таблице I. Картина распределения полос на рисунке 180 соответствует последовательностн олигонуклеотидов в таблице 12. Это следует нз анализа относительных подвижностей продуктов самый подвижный и, следовательно, самый короткий продукт обнаруживается в дорожке С, следующий по подвижности н длине — в колонке Т, далее — в колонке С, следующие два — в колонках Т и А соответственно и т. д. Выписывая таким образом названия колонок в порядке, в котором в них обнаруживаются последовательно удлиняющиеся продукты, получают формулу исходного олигонуклеотида. [c.321]

В методе блуждающего пятна эти две задачи рещаются одновременно. Смесь меченык фрагментов подвергается двумерному разделению. Сначала оно проводится путем электрофореза на полосках ацетата целлюлозы при pH 3,5 (разделение по составу), а затем влажная полоска прикладывается к краю пластинки с ДЭАЭ целлюлозой. которая сорбирует частично ра деленные олигонуклеотиды, и разделение ведется в направлении, перпендикулярном первому (разделение по длине). В качестве элюента используется гидролизат РНК. содержащий олигонуклеотиды всех возможных длин и составов (такая процедура называется гомохроматографией). [c.318]

Если сравнивать подвижность каждого олигонуклеотида при электрофорезе с подвижностью получаемого из него продукта, укороченного на одно звено, то наблюдаются следующие закономерности отщепление рТ приводит к уменьшению подвижности продукта по сравнению с исходным олигонуклеотидом вследствие резкого уменьшения заряда. Отщепление рС вызывает качественно такой же, но количественно меньший эффект. Отщепление рА, уменьшая длину олигонуклеотида и в значительно меньшей степени (по сравнению с рТ и рС) заряд, приводит к некоторому увеличению подвижности. Наконец, от1црпление рС очень Лало меняет заряд, но р>езко уменьшает длину, что существенно увеличивает подвижность продукта. [c.319]

В качестве примера рассмотрим анализ радиоавтограммы, приведенной на рисунке ПЧ. Очевидно, что наименее подвижный при гомохроматографии компонент представляет собой исходный олигонуклеотид. Соседний с ним продукт образуется путем отщепления З -концевого звена при электрофор>езе подвижность его слегка увеличивается, а при гомохроматографии — резко возрастает. Отсюда делается вывод, что отщепленным звеном является А. Следующий продукт (3) отличается от продукта (2) также одним звеном. Он значительно менее подвижен при электрофорезе и несколько более подвижен при гомохроматографии, следовательно, (3) образуется из (2) в результате отщепления Т. Продолжая такой анализ, определяют звено, которым отличается друг от друга каждая пара соседних пятен, т. е. кониевые звенья каждого олигонуклеотида смеси. Читая эти концевые нуклеотиды, можно восстановить исходную последовательность. [c.319]

Синтезы олигонуклеотидов с использованием фосфатного и фосфитного фосфотриэфирных методов приведены на рисунках 203 и 204. На первой стадии нуклеозид присоединяют с помощью якорной группы к полимерному носителю. Затем его 5 гидроксильную группу деблокируют кислотной обработкой и конденсируют с нук леотидным компонентом. У образующегося полностью защищенного динуклеозидмонофосфата удаляют диметокситритильную группу и присоединяют следующий нуклеотид и т. д. На последней стадии продукт отщепляют от полимерного носителя, снимают защитные группы н очиш,а1от хроматографией или электрофорезом в полиакриламидном геле. [c.366]

Рис. 12.32. Двухмерный электрофорез олигонуклеотидов (по данным Браунли,

В литературе по биохимии есть примеры применения электрофореза на бумаге для разделения смесей аминокислот и пептидов [4, 6, 7] и олигонуклеотидов [8—10]. В качестве метода регистрации радиоактивности чаще всего, особенно для двумерных электрофоре-тограмм, используют авторадиографию, хотя некоторые исследователи предпочитают радиосканирование. [c.135]

Фракционирование рибонуклеазных гидролизатов рибонуклеиновых кислот при помощи ионообменной хроматографии [98], электрофореза на бумаге и хроматографии на бумаге [99] полностью подтвердило вывод, основанный на изучении грубых смесей, и привело к исследованию свойств индивидуальных олигонуклеотидных компонентов. Кратковременная обработка рибонуклеазой (или инкубация в условиях диализа) показала, что первоначально в результате трансфосфорилирования образуются пиримидиновые нуклеозид-2, З -циклофосфаты (и олигонуклеотиды с концевым 2, 3 -циклофосфатом) [100] и что последующее действие фермента осуществляет гидролиз этих циклических фосфатов до соответствую- [c.377]

Электрофорез на бумаге с последующей хроматографией на бумаге представляет удобный метод разделения присутствующих в рибонуклеазных гидролизатах нуклеотидов и олигонуклеотидов (вплоть до тетрануклеотидов) [163]. Разделение, идентификация и количественное определение этих фрагментов дает некоторую информацию [c.392]

Прямой предпосылкой для такой интерпретации rипepxpo шзмa олигонуклеотидов является тот факт, что низкомолекулярные полинуклеотиды обладают определенной конформацией и что даже динуклеотиды и динуклеозидфосфаты характеризуются ограниченным вращение.м вокруг межнуклеотидной связи. Это подтверждается подвижностью изомерных динуклеозидфосфатов при электрофорезе [22]. Во всех изученных случаях производные с 2 —5 -связями обладают более высокой подвижностью, чем 3 — 5 -изоме-ры (что параллельно их гиперхромизму) таким образом, соединения первого типа более компактны, чем соединения второго типа, что приводит к более сильному взаимодействию между основаниями. Это особенно примечательно, так как в других отношениях 3" — 5 -соединения ведут себя как более сильные кислоты. [c.526]

Хотя взаимодействия химически синтезированных полиадениловой н полиуридиловой кислот не наблюдали, частичное взаимодействие иолицитидиловой с полигуаниловой кислотой (обе со средней длиной примерно 10 нуклеотидов) было показано с помощью противоточного распределения, а также электрофореза на бумаге гомополимеров и их смеси (22J. Это взаимодействие (сопровождаемое небольшим уменьшением ультрафиолетового поглощения), ио-видимому, сходно с тем, которое наблюдается у высокомолекулярных ферментативно синтезированных полимеров 164]. Кроме того, обнаруженное затем ограниченное вращение вокруг межнуклеотидных связей в олигонуклеотидах также свидетельствует о том, что водородные связи между остатками гуанина и цитозина более прочные, чем между аденином и урацилом. Эти синтетические полимеры содержали как 2 — 5 -, так и 3 — 5 -связи, и трудно было ожидать их полного взаимодействия даже в случае исиользования препаратов с более длиииыми цепями, так как изменение межплоскостного взаимодействия могло бы значительно понизить эффективность образования водородных связей . Последующие работы [c.533]

Браунли и Сенджер [109] анализировали меченые олигонуклеотиды, в молекулярные цепи которых входит до 50 остатков, методом одномерного электрофореза на ацетилированной целлюлозе, после чего переносили полосы на адсорбционный слой и проводили разделение методом ТСХ на слоях со смешанной DEAE-целлюлозой. [c.137]

Рис. 2.9. Фингерпринт олигонуклеотидной смеси на хроматографической бумаге. В одном направлении проводили электрофорез при низком значении pH, в другом -хроматографию в смешанном водноорганическом растворителе. Данный фингерпринт описан Рушицким и Собе- оы (Rushizky, Sober, 1962). Некоторые олигонуклеотиды были идентифицированы следующим образом

При этом олигонуклеотиды вначале разделяют электрофорезом на полоске ацетилцеллюлозы. Затем вещество с полоски ацетилцеллюлозы переносят на лист DEAE -бумаги и [c.56]

Смотреть страницы где упоминается термин Олигонуклеотиды, электрофорез: [c.496] [c.497] [c.499] [c.503] [c.504] [c.171] [c.378] [c.54] [c.10] [c.351] [c.353] [c.413] [c.120] [c.121] [c.133] [c.48] [c.55] [c.55] [c.56] [c.57]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология