Электрофорез олигонуклеотидов в геле

Рис. 2.2, Со5-картирование. Радиоактивные олигонуклеотиды, комплементарные левому или правому липкому концу, гибридизируют с соответствующим сайтом. Затем проводят частичный гидролиз рестриктазой К, разделение фрагментов электрофорезом в агарозном геле и радиоавтографию, позволяющую идентифицировать все меченые фрагменты, полученные в результате неполного гидролиза. Молекулярную массу истинных рестрикционных фрагментов, легко вычислить путем вычитания меньших величин из больших.

Вторая особенность электрофореза нуклеиновых кислот и их фрагментов — очень широкий диапазон молекулярных масс. Например, при определении нуклеотидной последовательности ДНК или РНК приходится разделять полученные при их гидролизе олигонуклеотиды, содержащие единицы и десятки мономерных звеньев, т. е. молекулы с массами от тысячи до нескольких сотен тысяч дальтон, а это — тот же диапазон, что для белков и пептидов. Естественно, что электрофорез при этом ведут в ПААГ с концентрацией от 5 до 20%, в зависимости от конкретной задачи. С другой стороны, электрофорез можно успешно использовать для разделения плазмид, крупных рестриктов ДНК и даже целых молекул ДНК или РНК вирусов. В этих случаях электрофорез ведут в гелях агарозы. [c.121]

Капиллярный гель-электрофорез Олигонуклеотиды, ДНК, полисахариды, определение молекулярных масс белков [c.364]

Достижения в области изучения первичной структуры нуклеиновых кислот непосредственно связаны с развитием методов фракционирования олигонуклеотидов. Ускорению этих исследований способствовало наличие очищенных препаратов РНК и рибонуклеаз, специфически расщепляющих одноцепочечную молекулу РНК. К настоящему времени установлена полная нуклеотидная последовательность многих РНК, в том числе многочисленных тРНК, 5S- и 5,8S-PHK, информационных и рибосомальных РНК. Работы по определению первичной структуры ДНК начались несколько позднее, однако благодаря использованию электрофоретических методов, позволяющих быстро анализировать смеси, они вскоре достигли того же уровня, что и исследования РНК. Стратегия установления первичной структуры нуклеиновых кислот описана во многих превосходных обзорах [5, 121—123]. В настоящем разделе особое внимание уделено методам электрофореза на бумаге и в геле, используемым для разделения рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов. [c.188]

Олигонуклеотиды можно разделять путем электрофореза в гелях, содержащих мочевину, при pH 3,5 [296, 1074, 1075]. В этих условиях на электрофоретическую подвижность влияет как длина цепи олигонуклеотида, так и его нуклеотидный состав. Сочетание этого метода с обычным электрофорезом улучшает разделение полинуклеотидов со сравнительно небольшими молекулярными массами. [c.379]

Идентификация модифицированных нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи РНК долгое время была задачей особой трудности. С появлением современных методов секвенирования нуклеиновых кислот она существенно упростилась. Модификацию РНК или ее расщепление ферментами ведут таким образом, чтобы (как и при секвенировании) было затронуто в среднем только одно звено на молекулу (в чем есть дополнительный смысл, так как множественная модификация РНК искажает ее структуру). Далее, если изучается РНК небольшого размера или сегмент РНК, примыкающий к одному из ее концов, то этот конец метят радиоактивной меткой и задача идентификации модифицированного основания (после расщепления соответствующего звена) или атакованной нуклеазой межнуклеотидной связи сводится, как и при секвенировании, к определению длины фрагмента по его подвижности в высокоразрешающем электрофорезе в геле. В том случае, когда анализируемый район удален от концов молекулы на расстояние больше 150—200 н. о., используют реакцию обратной транскрипции (см. гл. 13). Для этого синтезируют олигонуклеотид, комплементарный участку РНК, расположенному вблизи от анализируемого района с З -концевой стороны молекулы, и далее используют его как праймер для обратной траискриптазы. Так как этот фермент останавливается на модифицйрованных остатках матрицы (или в том месте, где расщеплена фосфодиэфирная связь), то вновь по длине образующегося фрагмента можно определить положение модифицированного звена в РНК. [c.40]

Эти олигонуклеотидные фрагменты разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, обладающего высокой разрешающей способностью [129, 135] (рис. 10.12). Чтобы исключить возможность образования внутримолекулярных вторичных структур (этот процесс особенно характерен для длинных олигонуклеотидов), в электродный буфер и в гель добавляют мочевину, выполняющую роль денатурирующего агента. При разработке этих систем гель-электрофореза было отмечено, что длина нуклеотидной последовательности, поддающейся прочтению непосредственно с помощью электрофореграммы, определяется разрешающей способностью метода электрофореза, которая в свою очередь зависит от толщины геля. В случае гелей толщиной 1—2 мм на радиоавтограмме обнаруживаются диффузные полосы, поскольку радиоактивный источник (фрагменты ДНК) весьма удален от поверхности рентгеновской пленки. Более тонкие гели (0,1—0,4 мм) позволяют достичь очень высокого разрешения олигонуклеотидов и обладают к тому же дополнительным преимуществом, которое заключается в том, что за счет тепла, выделяющегося в ходе электрофореза, происходит полная денатурация петель, обогащенных G -парами [129, 135]. [c.191]

Электрофорез олигонуклеотидов в геле [c.289]

Гомогенность образца по молекулярной массе может быть установлена с помощью методов ультрацентрифугирования или гель-фильтрации. Но эти методы менее чувствительны по сравнению с каскадными методами, в которых разделение макромолекул зависит от их суммарного заряда. Для установления чистоты белков, пептидов и олигонуклеотидов очень полезны методы зонного электрофореза, особенно при изучении электрофоретического поведения образца в нескольких буферных системах с различными значениями pH. С помощью ионообменной хроматографии также можно обнаружить присутствие примесей. Распределительная хроматография и противоточное распределение были успешно использованы при изучении лишь немногих белков из-за ограниченной растворимости и относительной нестабильности большинства белков в неполярных растворителях. Чистоту пептидов, содержащих до 40— 50 остатков аминокислот, можно во многих случаях установить с помощью хроматографии на бумаге. Часто макромолекулярное вещество, кажущееся гомогенным при исследовании одним мето- ом, оказывается негомогенным при использовании другого метода. На- [c.164]

Гель-электрофорез нуклеиновых кислот [34]. Если в 60-х годах разделение нуклеиновых кислот по молекулярным массам вели в основном путем ультрацентрифугирования в сахарозном градиенте, то в 70-х годах этот метод вытесняется методом электрофореза в геле. Впервые он был широко применен болгарским исследователем Р. Цаневым и сотр., и затем быстро завоевал общее признание. Оказалось, что в геле ДНК и РНК движутся тем быстрее, чем ниже их молекулярная масса. Пройденное расстояние обратно пропорционально логарифму молекулярной массы. Особенно важно, что разрешающая способность метода благодаря низкой диффузии гораздо выше, чем у ультрацентрифугирования. Для низкомолекулярных нуклеиновых кислот электрофорез ведется в полиакриламидном геле, для высокомолекулярных — в агарозном. Чем ниже концентрация геля, тем более высокомолекулярные нуклеиновые кислоты могут в нем разделяться. Подбирая условия, можно разделить как короткие олигонуклеотиды, отличающиеся по длине всего на один нуклеотид, так и молекулы ДНК размером до нескольких миллионов пар нуклеотидов. [c.27]

В результате этих реакций в пробах будут появляться наборы меченых олигонуклеотидов (рис. 11.14, Б). Продукты реакций подвергают электрофорезу в денатурирующем полиакриламидном геле, и получают радиоавтограф геля на рентгеновской пленке. При этом следует помнить, что скорость миграции фрагментов обратно [c.284]

Отщепление защитных групп и разрыв связей олигонуклеотида с твердой фазой производят поэтапно, а затем полученный материал очищают с помощью препаративного гель-электрофореза или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ). [c.88]

Сенжер и Коулсон создали метод анализа последовательности ДНК, который основан на ферментативном копировании однонитевых частиц ДНК [18]. Максам и Гилберт создали метод, в основу которого положена химическая модификация четырех оснований, входящих в состав ДНК, и который с одинаковым успехом применим как к однонитевым, так и к двунитевым молекулам ДНК [19]. Оба метода используют авторадиографическое определение згр-меченных олигонуклеотидов, которые разделяют в зависимости от их длины электрофорезом денатурированных фрагментов в полиакриламидном геле. На практике, успех этих методов во многом определяется недавними достижениями в энзимологии нуклеиновых кислот, особенно использованием ферментов рестрикции, расщепляющих молекулы ДНК, и обратной транскриптазы, с помощью которой получают циклические ДНК, комплиментарные РНК-матрице. Нижеследующее описание методики анализа будет, однако, предполагать наличие гомогенных образцов ДНК подходящей длины. [c.188]

Чтобы выход продукта был достаточно высок, эффективность присоединения нуклеотидов на каждом этапе должна быть не ниже 98%. Эффективность контролируют спектрофотометрическими методами, определяя количество удаляемых тритильных групп. Если, например, при синтезе 20-членного олигонуклеотида эффективность каждого цикла равна 99%, то 82% (т. е. 0,99 100) олигонуклеотидов будут иметь именно такую длину. Если же синтезируется 60-членный олигонуьслеотид, то при той же эффективности только 55% олигонуьслеотидов будут содержать по 60 нуклеотидов. А если средняя эффективность цикла не превышает 98%, то доля олигонуклеотидов заданной длины будет гораздо ниже (табл. 5.1). Фирмы - изготовители коммерческих ДНК-синтезаторов обычно гарантируют среднее значение эффективности присоединения 98%. Но для этого необходимо использовать реагенты и химикаты очень высокой степени чистоты, что не всегда удается выполнить. Как правило, реальная эффективность присоединения составляет 95%, хотя иногда удается достичь и 99%-ной эффективности. Чтобы получить олигонуклеотиды заданной длины, первичные продукты большинства химических синтезов необходимо очистить с помощью либо высокоэффетивной жидкостной хроматографии под высоким давлением с обращенной фазой, либо электрофореза в полиакриламидном геле. Поскольку все неудачные последовательности короче, чем тот олигонуклеотид, который хотят получить, сделать это нетрудно. [c.85]

Ввиду только что отмеченного обстоятельства разделение коротких олигонуклеотидов строго по их длине предпочитают вести в гелях, где фиксация однонитевого состояния нитей ДНК или РНК обеспечивается не щелочью, а присутствием высокой концентрации мочевины. Образуя прочные водородные связи с нуклеиновыми основаниями, мочевина препятствует их комплементарному спариванию. Сама по себе мочевина не распрямляет нити полинуклеотидов, но в отсутствие нейтрализации фосфатов ионами металлов эти нити оказываются достаточно расправленными для того, чтобы обеспечить надежное разделение олигонуклеотидов длиной в несколько сотен мономерных звеньев, отличающихся между собой всего лишь на одно звено. Именно такая задача стоит при использовании электрофореза в современных методах определения последовательности оснований ( секвенирования ) в молекулах ДНК и РНК. [c.131]

В первоначальных экспериментах после завершения электрофореза гель во избежание диффузии полос ДНК в замороженном виде экспонировали на рентгеновскую пленку. Однако в этом случае присутствующие в геле вода и мочевина способствовали гашению радиоактивных сигналов и полосы ДНК на радиоавтографе получались нечеткими. Введенный впоследствии этап фиксации олигонуклеотидов в геле с помощью 10%-ной уксусной кислоты, кроме перевода нуклеиновых кислот в нерастворимую форму, удалял мочевину. Уже упоминавшийся выше маркерный краситель - бромфеноловый синий - является рН-ин-дикатором и в тех случаях, когда он не успевает выйти и остается в геле, по изменению его окраски с фиолетово-синей на желто-коричневую можно судить об изменении кислотности среды в самом геле. Последу- [c.184]

На первой стадии проводили ПЦР полинуклеотидов А, В, С, D в присутствии 7а -полиме-разы. Полученный продукт реакции, не являющийся по данным гель-электрофореза гомогенным, вводили в ПЦР с короткими (длиной 30 нуклеотидных звеньев) олигонуклеотидами Е и F. В результате второй реакции образовался индивидуальный дуплекс, который затем бьш клонирован, но данные о правильности его нуклеотидной структуры отсутствуют. [c.75]

Олигонуклеотиды с молекулярным весом менее 10 ООО фракционируют электрофорезом в 15%—ном полиакриламидном геле Gould et al., 1969), где олигонуклеотиды делятся главным образом в соответствии с размерами молекул чем меньше молекула, тем быстрее она движется через гель. Таким образом, этот метод подобен хроматографическому разделению по длине цепи, однако для длинноцепочечньк олигомеров электрофорез в геле позволяет получить лучшее разрешение, чем хроматография. Это показано на рис. 11.7, где сравниваются положения олигонуклеотидов из Т -РНК-азного гидрохшзата РНК TMV при электрофорезе и колоночной хроматографии. Из рисунка следует, что в геле олигонуклеотиды с длиной цепи более 8 звеньев разрешаются, хотя и не так хорошо, как олигонуклеотиды с меньшей длиной цепи, тогда как на колонке плохо делятся олигонуклеотиды уже с длиной цепи более 6. Поэтому гель-электрофо-рез может быть эффективным методом фракционирования олигонуклеотидов с длиной цепи больше 8. [c.289]

Таким образом, для полного анализа последовательности любого полинуклеотида необходимо иметь, во-первых, метод получения четырех наборов специфических концевых продуктов, подобных тем, которые приведены втаблице 12, и, во-вторых, метод, позволяющий проводить сравнение длин этих продуктов. Различие современных методов анализа заключается в способах получения наборов специфических фрагментов. Общность — в способе сравнения длин, которое во всех случаях производится путем электрофореза радиоактивных концевых продуктов в пластинках полиакриламидного геля. По окончании электрофореза положение продуктов в геле определяют путем радиоавтографии. Каждый продукт проявляется в виде темной полосы на рентгеновской пленке сравниваются относительные подвижности полос в разных дорожках, подобно тому как сравнивались длины продуктов в таблице I. Картина распределения полос на рисунке 180 соответствует последовательностн олигонуклеотидов в таблице 12. Это следует нз анализа относительных подвижностей продуктов самый подвижный и, следовательно, самый короткий продукт обнаруживается в дорожке С, следующий по подвижности н длине — в колонке Т, далее — в колонке С, следующие два — в колонках Т и А соответственно и т. д. Выписывая таким образом названия колонок в порядке, в котором в них обнаруживаются последовательно удлиняющиеся продукты, получают формулу исходного олигонуклеотида. [c.321]

К электрофорезу в геле эти методы, разумеется, прямого отношения не имеют, так как являются примерами электрофореза в свободной жидкости. Именно с этого начиналось применение электрофореза для фракционирования биополимеров. Однако за последнее десятилетие, во всяком случае для аналитических целей, электрофорез в свободной жидкости был полностью вытеснен электрофорезом в гелях или на твердых носителях (бумаге, различных производных целлюлозы, полиамидных пленках и т. д.), который широко применялся при фракционировании пептидов, аминокислот и других сравнительно низкомолекулярных биологически важных молекул, в том числе и в высоковольтных вариантах. В свое время, например, очень важную роль сыграл метод фракционирования олигонуклеотидов гидролизата РНК двумерным электрофорезом. В первом направлении разделение вели на полосках ацетатцеллюлозы в пиридин-ацетатном буфере (pH 3,5) с добавлением 7 М мочевины, во втором — на ДЭАЭ-бумаге в 7%-ной НСООН [Brownlee, 1972]. Ввиду малой емкости ацетатцеллюлозы общая загрузка не превышала 0,1 мг гидролизата РНК, поэтому использовали препараты, меченные радиоактивным фосфором. [c.119]

Полимеры нуклеозидмонофосфатов, в молекулах которых 3 - и 5 -гидроксильные группы двух соседних углеводных остатков связаны фосфодиэфирным мостиком, представляют собой ковалентный каркас нуклеиновых кислот. Соединения, содержащие менее 50 нуклеотидных остатков, обычно относят к олигонуклеотидам. Олигонуклеотиды, построенные из остатков одного и того же нуклеотида, называют гомополимерами. Их получают либо синтетическим путем, либо в результате расщепления более длинных полимеров. Этот раздел посвящен хроматографии олигонуклеотидов на колонках фракционирование этих соединений с помощью электрофореза на бумаге и в геле рассмотрено в разд. 10.7. [c.168]

Синтезы олигонуклеотидов с использованием фосфатного и фосфитного фосфотриэфирных методов приведены на рисунках 203 и 204. На первой стадии нуклеозид присоединяют с помощью якорной группы к полимерному носителю. Затем его 5 гидроксильную группу деблокируют кислотной обработкой и конденсируют с нук леотидным компонентом. У образующегося полностью защищенного динуклеозидмонофосфата удаляют диметокситритильную группу и присоединяют следующий нуклеотид и т. д. На последней стадии продукт отщепляют от полимерного носителя, снимают защитные группы н очиш,а1от хроматографией или электрофорезом в полиакриламидном геле. [c.366]

Быстрое распространение хроматографических и электрофоретических методов в области исследования нуклеиновых кислот, которому в значительной степени способствовало становление технологии рекомбинантных ДНК, продолжается и по сей день, особенно в таких направлениях, как разделение мРНК, фрагментов ДНК и нуклеопротеидов. Уже установлена первичная структура обширных участков генома многих животных, и непрерывное совершенствование метода гель-электрофореза, обладающего высоким разрешением, в сочетании с использованием компьютерной техники для определения полных нуклеотидных последовательностей позволит добиться еще более значительных успехов. На ранних этапах развития этой области исследований одна из задач экспериментатора заключалась в том, чтобы приспособить используемые в других областях науки хроматографические и электрофоретические методы для разделения моно- и олигонуклеотидов. Теперь же, по прошествии тридцати лет, биохимия нуклеиновых кислот сама стала тем источником новых представлений о разделении макромолекул, который стимулирует развитие хроматографии и электрофореза. [c.196]

Традиционный способ анализа рестриктов гель-электрофоре-зом описан в приложении. Расположение зон, зафиксированное на фото рафии или авторадиограмме, для анализируемой молекулы ДНК является своеобразным паспорюм. С введением в практику флуоресцентных меток регистрацию результатов гель-электрофореза удалось автоматизировать ( arvano et al., 1989). Хотя введение такой метки — достаточно трудоемкий процесс, метод оправдывает себя при необходимости проводить массовую паспортизацию фрагментов ДНК Метку (Фл) присоединяют ковалентно к 5 -концу какого-либо стандартного праймера и отжигают его с комплементарным олигонуклеотидом, 5 ОН-конец которого является липким для n j (ользуемой в эксперименте рестриктазы (в нашем примере Hmdlil). К образовавшимся меченым дуплексам добавляют рестрикты (выделены жирным шрифтом) [c.288]

Ранее схожий метод мультиплексной геномной прогулки был применен для определения нуклеотидной последовательности неклони-рованного гена пируваткиназы Е. соИ [Ohara et al., 1989]. Суть такой прогулки , весьма напоминающей праймерную (описанную ниже в разделе 8.4), заключается в расщеплении тотальной ДНК несколькими подходящими рестрикционными эндонуклеазами, разделении полученных фрагментов в денатурирующем секвенирующем гель-электрофорезе, их переносе на нейлоновый фильтр и многочисленных гибридизациях с мечеными олигонуклеотидами (рис. 8.3). [c.239]

Смотреть страницы где упоминается термин Электрофорез олигонуклеотидов в геле: [c.169] [c.102] [c.454] [c.504] [c.378] [c.54] [c.351] [c.162] [c.290] [c.103] [c.168] [c.168] [c.133] [c.145] [c.146] [c.103] [c.69] [c.155] [c.19] [c.302] [c.314] [c.47]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология