Центрифугирование в зональных роторах

Зональное центрифугирование представляет собой эффективный способ разделения структур, имеющих сходную плавучую плотность, но различающихся по форме и массе частиц. В качестве примеров можно привести разделение субъединиц рибосом, различных классов полисом, а также молекул ДНК, имеющих различную форму. Центрифугирование осуществляют либо в бакет-роторах, либо в специально устроенных зональных роторах для предотвращения конвекции при центрифугировании в стаканах бакет-ротора или в камере зонального ротора создают слабый градиент (обычно сахарозы). Пробу наносят в виде зоны или узкой полосы в самом верху градиентного столбика. Для субклеточных частиц обычно используется градиент сахарозы от 15 до 40% (вес/объем) большинство этих частиц в достаточной степени разделяется центрифугированием при 100000 д в течение 1—4 ч. [c.149]

Если центрифугирование предполагается вести на холоду, зональный ротор предварительно охлаждают (в собранном виде) в течение 4—5 ч в холодной комнате. При этом его полость должна быть закрыта пробкой во избежание конденсации влаги внутри ротора. Заполнение градиентом ведут через змеевик, погруженный в баню со льдом, со скоростью 40—50 мл/ /мин. Препарат через центральную трубку наслаивают со скоростью 5—10 мл/мин. С такой же скоростью наслаивают и буфер на препарат. [c.198]

Исходную смесь частиц разных размеров наносят. в виде тонкого слоя на более плотную среду, заполняющую весь объем пробирки бакет-ротора или полости зонального ротора (для зонально-скоростного центрифугирования используют только эти два типа роторов). В ходе центрифугирования наиболее тяжелые частицы быстро продвигаются ко дну пробирки или к пе- [c.201]

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ В ЗОНАЛЬНЫХ РОТОРАХ [c.275]

В большинстве случаев зональные роторы используют для зо-нально-скоростного центрифугирования в градиенте плотности раствора сахарозы на стадии препаративного выделения и очистки макромолекул или частиц из большого объема материала. [c.275]

Рис. 2.6. Стадии центрифугирования (а—е) в зональном роторе

В роторах с подвесными стаканами (фиг. 38, В) конвекционные явления выражены в меньшей степени, чем в угловых роторах. Такие роторы также очень широко применяются для зонального центрифугирования. Более того, некоторое время назад для зональных опытов использовались роторы только такого типа впоследствии [c.184]

Роторы с 4 и 6 подвесными стаканами, оптимальное разрешение, разделение более широких пиков при скоростном зональном центрифугировании [c.192]

Высокоскоростные роторы с пробирками объемом 4 4 и 5 мл (SW 50.1, SW 55 Ti, SW 60 Ti и SW 65 Ti). Они удобны для равновесного и зонально-скоростного центрифугирования, где не требуется особенно хорошее разрешение. [c.191]

Подробнее геометрия бакет-роторов будет рассмотрена в. главе 5, посвященной зонально-скоростному центрифугированию. [c.191]

На схеме 5 показан конечный момент зонально-скоростного центрифугирования. Ротор закрыт пробкой и вращается с большой скоростью. Частицы распределились вдоль градиента в соответствии с их константами седиментации. [c.195]

В заключение еще раз отметим, что выбор режима зонально-скоростного центрифугирования в градиенте плотности растворов сахарозы достаточно свободен. Изменение продолжительности центрифугирования на 20%, как правило, не очень сильно меняет характер фракционирования. Важно лишь правильно оценить соотношение значений г ., , разделяемых компонентов в препарате, диктующее выбор крутизны градиента сахарозы. Затем для максимально допустимой скорости имеющегося в распоряжении бакет-ротора (с длинными пробирками) с помощью номограмм следует найти ориентировочную продолжительность центрифугирования. Ее можно затем уточнить после первого пробного опыта. [c.239]

Однако ротор с вертикальными пробирками можно успешно использовать и для зонально-скоростного центрифугирования вместо бакет-ротора. В отличие от углового ротора относительно тяжелые частицы не будут здесь попадать на стенку пробирки вплоть до момента прохождения ими всего градиента плотности. Приведенные выше рассуждения о том, что стенка пробирки углового ротора не влияет на образование градиента плотности солевого раствора, не относятся к поведению фракционируемых частиц при зонально-скоростном центрифугировании, ведь плотность этих частиц заведомо больше, чем максимальная плотность раствора сахарозы. Попав в любой части пробирки на ее стенку, частицы, а тем более их агрегаты, будут легко соскальзывать по стенке на дно пробирки. Всего этого не будет в вертикально стоящей пробирке. [c.257]

Таким образом, на практике в настоящее время бакет-рото ры используют для зонально-скоростного центрифугирования, угловые —для равновесного, а роторы с вертикальными пробирками — как для того, так и для другого. Для сбора осадков при дифференциальном центрифугировании одинаково пригодны как угловые, так и бакет-роторы, а роторы с вертикальными пробирками неудобны осадок образуется не на дне. а вдоль образующей цилиндрической части пробирки. [c.258]

Следует отметить, что стенки пробирок в препаративных роторах параллельны в отличие от ячейки секториальной формы, показанной на рис. 11-3. Это вызывает конвекцию и будет обсуждаться ниже в разделе, посвященном зональному центрифугированию. Однако до сих пор еще не разработан удовлетворительный препаративный ротор с пробирками секториальной формы. [c.282]

Зональный градиент плотности. Суть метода состоит в разделении смеси веществ в соответствии с их седимента-ционными коэффициентами с помощью центрифугирования в сахарозном градиенте в горизонтальном баке т-роторе, При этом вещества с различным молекулярным весом седиментируют в сахарозном градиенте с разной скоростью и проходят различные расстояния от мениска. [c.176]

При равновесном центрифугировании в градиенте плотности раствора s l резиновое кольцо, уплотняющее крышку зонального ротора, желательно менять после каждого опыта, поскольку раствор s l разъедает резину. После опыта ротор разбирают, вынимают крестовину и все детали тщательно споласкивают теплой водой. Через каналы крестовины прогоняют- [c.198]

В качестве примера использования вставки типа В-29 и сбора фракций через периферический канал можно указать на работу, авторы которой очищали зональным центрифугированием в роторе Ti-15 гранулы зимогенов из поджелудочной железы крысы [S hneider, Smith, 1977]., [c.276]

Другой способ заключается в наслаивании образца на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности, охватывающим диапазон плотностей всех компонентов смеси. Центрифугирование проводят до тех пор, пока плавучая плотность частиц не сравняется с плотностью соответствующих зон, т. е. пока не произойдет разделение частиц по зонам. Метод получил название зснально-изопикнического, или рв -зонального центрифугирования, так как основным моментом здесь является плавучая плотность (рв), а не размеры или форма частиц (рис. 2.4). На величину плотности, при которой частицы образуют изопикнические полосы, влияет природа среды суспендирования частицы могут быть проницаемыми для одних соединений, находящихся в растворе, и непроницаемыми для других или же присоединять молекулы раствора. При использовании зонального ротора (разд. 2.5.3) митохондрии, лизосомы, перок-сисомы и микросомы концентрируются в полосах с 42 %-, 47%-, 47%-и 27%-НОЙ сахарозой, соответствующих плотности 1,18, 1,21, 1,21 и 1,10 г-см"3 соответственно. Плотность субклеточных органелл зависит также и от избирательного поглощения ими определен- [c.48]

Зональные роторы, В поисках решения яроблемы разделения больших количеств ряда субстанций — макромолекулы, субклеточные частицы и вирусы — доктор Андерсон из Национальной лаборатории ОУК Ридж (США) разработал роторы для зонального центрифугирования в которых градиент и исследуемое вещество можно вносить в ротор и извлекать нз него непосредственно во время вращения ротора. Подобные операции невозможны в роторах с подвесными приборами. [c.198]

Точно так же, как для оценки времени осаждения в ультрацентрифуге компонента с данным ко фициентом седиментации s используются параметры ST, Pi или k, можно предложить аналогичный параметр к для зонального центрифугирования в градиенте плотности. В табл. 7 (данные фирмы Be kman Instruments In .) приведены значения этого параметра для различных роторов, выпускаемых этой фирмой. С помощью фактора к можно определить время, необходимое для седиментации частиц с данным коэффициентом седиментации и данной плотностью в градиенте плотности от мениска до дна пробирки. В таблице приведены девять значений этого фактора для различных роторов и для частиц с плотностями от 1,1 до 1,9 г/мл, седиментирующих в линейном градиенте сахарозы (5—20% по массе) при 5°С. [c.198]

Зависимость константы седиментации от скорости вращения ротора. Уже при первых попытках использовать метод седиментации границы раздела ддя исследования образцов ДНК с молекулярным весом выше 30 ООО ООО были отмечены аномалии, связанные со скоростью вращения ротора [75, 76]. В настоящее время артефакты скорости достаточно подробно изучены данные самого последнего времени свидетельствуют в пользу того, что эти артефакты возникают в результате конвекции и обратимого образования межмолекуляриых агрегатов [44, 46]. На практике этих артефактов можно избежать, если работать при скорости вращения ротора ниже 15 ООО об мин и концентрациях ниже 20 мкг мл. Используя ЭТИ предосторожности, различные авторы получили хорошо совпадающие значения констант седиментации для самых высокомолекулярных из изученных ДНК, а именно для ДНК Т-четных фагов [26, 45, 46]. При использовании обоих методов зонального центрифугирования артефакты скорости отмечены не были. [c.224]

При центрифугировании клеток (Boone et al., 1968) через прерывистый (10—20%) градиент фиколла в МСИ, модифицированной для этой цели (удалены кальций и бикарбонат и концентрация фосфата увеличена в 10 раз), в зональном центрифужном роторе А=1Х в течение 1 ч при 1000 об/мин при 20°С удается получить четкое разделение различных типов клеток (клетки HeLa и тимоциты кролика). [c.150]

Материал, полученный одним из описанных выше методов, обычно контаминирован клеточными компонентами. Однако в тех случаях, когда высокая степень очистки не обязательна (например, для постановки RIA или ELISA), его можно использовать уже на этой стадии. Тем не менее для большинства исследований необходима дальнейшая очистка вируса с помощью зонально-скоростного или изопикнического центрифугирования в градиенте. При скоростном центрифугировании положение вируса в градиенте определяется его коэффициентом седиментации, а при изопикническом — плавучей плотностью. Для достижения максимальной степени очистки вирусных частиц от примесей изменение концентрации образующего градиент вещества должно быть плавным в то же время на промежуточных стадиях очистки нередко используют ступенчатые градиенты. В некоторых случаях принципы скоростного и изопикнического центрифугирования совмещаются примером может служить использование градиентов глицерина — тартрата калия [14]. В таких градиентах концентрация тартрата калия возрастает в направлении дна пробирки, достигая плотности, соответствующей плавучей плотности вируса концентрация глицерина, наоборот, максимальна на мениске, что препятствует продвижению медленно седиментирующего материала в направлении дна. Все типы градиентов обычно центрифугируют в бакет-роторах, но в случае изопикнических градиентов такие же или даже лучшие результаты можно получить в угловых или вертикальных роторах с помощью приспособлений для медленного разгона и остановки, обеспечивающих переориентацию градиента без перемешивания. При очистке конкретного вируса часто приходится проводить целую серию последовательных стадий центрифугирования в разных типах градиентов, чтобы добиться нужной степени очистки. [c.100]

Зональное центрифугирование лучше всего проводить в бакет-роторах или вертикальных роторах, чтобы избежать нежелательного взаимодействия материала со стенками пробирки. Линейные градиенты сахарозы (5—20%, вес на вес) готовят одним из стандартных методов (см. гл. 1, разд. 2.5.1) и сверху осторожно наслаивают раствор вируса. Поскольку при использовании данного метода отсутствует эффект концентрирования в результате образования зоны с соответствующей плавучей плотностью, объем образца не должен превышать 1/10 объема градиента. Центрифугирование следует проводить при 4°С. Время и скорость центрифугирования во многом зависят от геометрии используемого ротора, поэтому можно дать лишь самые приблизительные указания относительно режима. Первоначально используемый режим центрифугирования обычно приходится модифицировать после первых опытов с учетом полученных результатов. В бакет-роторе, например SW27, центрифугирование в течение 2 ч при 27 ООО об/мин позволяет получить достаточную степень очистки большинства тогавирусов. [c.101]

Роторы для умеренных скоростей вращения, но с относительно длинными пробирками объемом от 13,2 до 17 мл. Они особенно удобны для разделения близких по массе частиц методом зонально-скоростного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. К этой группе относятся роторы SW 28.1 (SW 27.1), SW 40Ti и SW 41 Ti. [c.191]

Из очищенных ядер РНП-частицы экстрагировали при 37 0,01 М Трис-H l (pH 8) с 0,1 М Na l и 1 мМ АТФ (АТФ способствует выходу частиц из ядра). Их собирали центрифугированием при 60 000 об/мик в течение 4 ч и предварительно очищали зонально-скоростным центрифугированием в градиенте сахарозы, собирая фракцию с константой седиментации около 40S. Эту фракцию переносили в полиалломерные пробирки ротора SW 41, фиксировали добавлением глутарового альдегида до 6% в течение 1 ч при 0°, а затем смешивали с концентрированным водным раствором s l с таким расчетом, чтобы исходная плотность при центрифугировании составляла 1,5 г/ м а объем смеси —5 мл. Остальной объем пробирки (8 мл) заполняли парафиновым маслом. Центрифугирование вели при 30 000 об/мии и 25 в течение 60 ч. Собирали 30 фракций. 40 S РНП-частицы выходили острым пиком в области р= 1,4 г/см . Аналогичным образом исследовали плавучую плотность рибосом, а по ней определяли содержание в них белка. Рибосомы фиксировали обработкой 6%-ным раствором формальдегида. [c.262]

На рис. 11-5 показаны два типа роторов для препаративной ультрацентрифуги. Угловой ротор в первую очередь предназначен для осаждения материалов . Он очень эффективен для этой цели, так как вещество проходит до стснки центрифужной пробирки короткое расстояние накапливающийся на стенке материал быстро сползает по стенке на дно пробирки. Ротор с подвесными стаканами большей частью используют для аналитического равновесного и зонального центрифугирования (будет описано вкратце). [c.282]

Для получения вирусй в йрейар ти ных количествах применяют центрифугирование в горизонтальных роторах препаративной центрифуги. После достижения равновесия содержимое анализируется аналогично тому, как это делается в опытах с равновесным зональным градиентом. В этом случае можно определить величину плавучей плотности с точностью до 0,01 г/мл при одновременной очистке вируса. При препаративном равновесном центрифугировании время может колебаться от 6 до 12 часов. [c.64]

Осаждение на градиентную иятерфазу. Для очистки сравнительно больших количеств вируса удобно пользоваться методом осаждения на градиентную интерфазу. Принцип метода заключается в том, что в пробирку наслаивают несколько растворов различной плотности. Например, установлено, что прл зональном центрифугировании вирус локализуется в зоне 50% сахарозы. В этом случае на дно центрифужной пробирки емкостью 33 мл (ротор SW25.1) помещают 3 мл 60%-ного раствора сахарозы на трисбуфере, pH 7,4, затем осторожно наслаивают 5 мл 40%-ной сахарозы и сверху 4 мл 20%-ной сахарозы в том же буфере. На такой нреформированный ступенчатый гра- [c.68]

В заключение следует сказать, что методы градиентного центрифугирования наиболее совершенны из всех известных в настоящее время методов очистки вирусов. Причем для некоторых вирусов достигается абсолютная очистка. Относительная сложность методов градиентного центрифугирования не препятствует его широкому распространению в препаративной биохимии вирусов. Единственным ограничением пока является то, что очи щать мoяiнo лишь сравнительно небольшие объемы вирус-содержащего материала. Поэтому для увеличения выхода очищенного вируса желательна его предварительная концентрация. Но в последнее время разрабатываются методы препаративного фракционирования в равновесном и в зональном градиенте. Для препаративных целей стали использовать угловые роторы, объем которых значительно больше объема горизонтальных [319, 324], что делают этот [c.69]

Несомненно, техника зонального центрифугирования найдет широкое применение в самых различных областях препаративной биохимии, а роторы типа А явятся существенным новым дополнением к арсеналу современного научного работника [c.201]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология