Субклеточные частицы фракционирование

Изучение клеточной организации и попытки установить связь между структурой и функцией на различных иерархических уровнях — от простых молекул до макромолекул и таких агрегатов, как мембраны или частицы, до субклеточных единиц и, наконец, клеток — все это составляет одну из самых увлекательных и перспективных областей исследования в современной биологии. Для биохимика и цитолога выяснение химического значения различных сложных структурных элементов, обнаруженных в клетке, важно не только само по себе оно является необходимой ступенью любого исследования, направленного на то, чтобы понять, как происходит синтез, распад и взаимодействие этих элементов. Мы начинаем догадываться, что именно в этих сложных структурах скрыт секрет механизмов, с помощью которых осуществляется регуляция клеточных процессов как в пространстве, так и во времени. Этот секрет, возможно, заключается, по крайней мере отчасти, в том, что различные клеточные компоненты — главным образом ферменты, а также их субстраты и модификаторы (активаторы и ингибиторы) — находятся в разных отсеках клетки и потому не всегда доступны друг для друга. Из сказанного вытекает два вывода, подтвержденных в последнее время многочисленными экспериментальными данными 1) в клетке существует четкое распределение некоторых ключевых компонентов, особенно ферментов они локализуются в (или на) определенных клеточных структурах, представляющих собой микроскопические внутриклеточные органы, так называемых органеллах 2) эти структуры, а вместе с ними и соответствующие клеточные компоненты можно выделить с помощью подходящих мягких методов разрушения клеток (гомогенизация) и последующего фракционирования. [c.239]

Том 3 посвящен практическому применению жидкостной колоночной хроматографии для анализа широкого круга соединений, включая как неорганические (изотопы), так и органические вещества, имеющие синтетическое (элемент- и металлорганиче-ские соединения, пестициды, красители, полимеры и некоторые лекарственные препараты) и природное происхождение (ферменты, нуклеиновые кислоты и их компоненты, алкалоиды, антибиотики, витамины, пигменты и гетероциклические соединения). Описана также возможность применения жидкостной хроматографии для фракционирования клеток, вирусов (и фагов) и субклеточных частиц. [c.4]

Начальным этапом в изучении структуры и функции нуклеиновой кислоты является ее выделение из клетки или субклеточных частиц и очистка от различного рода примесей. Заключительный этап — фракционирование для получения препаратов, гомогенных по химическому составу, молекулярному весу и надмолекулярной организации. Естественно, что схема выделения может существенно изменяться в зависимости от природы исходного материала. Подробное описание методик можно найти [c.66]

Фракционирование гомогенатов. Из гомогената можно выделить субклеточные частицы, как надмолекулярные (клеточные органеллы), так и отдельные соединения (ферменты и другие белки, нуклеиновые кислоты, метаболиты) (см. рис. 6.8). Например, с помощью дифференциального центрифугирования можно получить фракции ядер, митохондрий, микросом (микросомы — это фрагменты эндоплазматического ретикулума). Эти органеллы различаются размерами и плотностью и поэтому осаждаются при разных скоростях центрифугирования. После осаждения микросом в надосадочной жидкости остаются растворимые компоненты клетки — растворимые белки, метаболиты. Каждую из этих фракций можно разными методами фракционировать дальше, выделяя составляющие их компоненты. Из выделенных компонентов можно реконструировать биохимические [c.195]

Препаративные центрифуги, В настоящее время имеется большое количество превосходных препаративных ультрацентрифуг, способных развивать ускорение до 420 ООО . Они применяются для выделения, очистки и концентрирования вирусов и субклеточных частиц, фракционирования белков, нуклеиновых кислот, линопро-Т0ИДОВ и других макромолекул. Наиболее популярны следующие ультрацентрифуги Спинко модель Л и Л2 (США) Судер-Спид-40 ж 50 (Англия), ВАК-40 и ВАК-60 (ГДР) и Хитачи 55Р (Япония). В нашей стране выпускаются препаративная ультрацентрифуга типа УЦП. [c.192]

Данная глава посвящена выделению хроматографическими методами интактных клеток и субклеточных частиц. Многие исследователи выделяют вирусы и субклеточные частицы хроматографированием на пористых стеклах, гелях, ионитах для фракционирования клеток чаще всего пользуются пористыми стеклами. Очевидно, наиболее перспективным в этом отношении методом следует считать аффинную хроматографию. Действительно, фракционирование клеток на хроматографических носителях, так называемая хроматография сцепления (adheren e), имеет много общего с аффинной хроматографией. Клетки определенного типа вначале более или менее избирательно сорбируют на носителе, а затем после удаления сопутствующих примесей элюируют подходящим элюентом. Однако на практике вторую стадию часто опускают и проводят элюирование путем экстракции в статических условиях. И наоборот, многие операции, проводимые в статических условиях, можно выполнять на хроматографических колонках. Именно по этой причине чрезвычайно трудно провести четкую границу между строго хроматографическими методами и элюированием в статических условиях. [c.309]

Агарозные гранулированные гели применяют для выделения и фракционирования очень крупных молекул, в том числе вирусов, бактериофагов, субклеточных частиц (например рибосом), белков, нуклеопротеидов, нуклеиновых кислот, полисахаридов, Ог других мягких гелей агарозы отличает болёе широкие интервалы фракционирования. Агарозы используют также в качестве носителей иоспецифических сррбентов для аффинной хроматографии (см. разд. 120), [c.62]

Обычно вначале проводят фракционирование по какой-либо схеме, а затем избирают определенные ферменты, активности или какие-либо ееш ества в качестве так называемых маркеров, или индикаторов, которые, судя по опыту, могут быть полезны для идентификации некоторых внутриклеточных частиц или компонентов. На основании полученных результатов вычерчивают кривую распределения и таким образом определяют частицы с точки зрения характерных биохимических активностей или, наоборот, приписывают характерные биохимические свойства различным типам частиц. Распространение этого метода на весь спектр ферментов и других индикаторов позволяет закрепить определенные функции клетки за известными внутриклеточными компонентами и, наоборот, описать и впоследствии идентифицировать новые, или но крайней мере ранее не известные, морфологические компоненты на основании биохимических данных. Примером успешного применения такого подхода является отождествление частиц кислой фосфатазы с лизосомами, а частиц уратоксидазы с микротельцами (называемыми также пероксидосомами) в печени млекопитающих. В основе этого подхода лежат два главных допущения, отмеченных де Дювом 1) каждый из ферментов локализуется только в одном каком-либо месте внутри клетки и 2) популяция субклеточных частиц в ферментативном отношении гомогенна. [c.251]

Свойства полученного при фракционировании препарата субклеточных частиц можно отнести к свойствам самих частиц только в том случае, если препарат не содержит примесей. Следовательно, всегда необходимо оценивать чистоту получаемых препаратов. Эффективность гомогенизации и наличие в препарате примесей можно определить с помощью микроскопического исследования. Однако отсутствие видимых примесей еще не является достоверным доказательством чистоты препарата. Для количественнбй оценки чистоты полученный препарат подвергают химическому анализу, который позволяет установить содержание в нем белков или ДНК, определить его ферментативную активность, если возможно, и иммунологические свойства. [c.56]

Фракционирование клеток в солевом растворе осложняется тенденцией гранул образовывать скопления и осаждаться в виде комков, а не в виде отдельных частиц. Это нежелательное явление можно предотвратить, измельчая клетки в 0,88 М растворе сахарозы, в котором митохондрии сохраняют палочковидное строение и способность к суправитальному окрашиванию янусом зеленым В. Однако при указанной концентрации сахарозы среда становится настолько вязкой и плотной, что для осаяедения субклеточных фракций приходится использовать чрезвычайно высокие скорости центрифугирования. Поэтому в современных исследованиях в качестве среды для измельчения клеток используют 0,25 М раствор сахарозы, в котором не происходит агрегации гранул и легко выделяется фракция митохондрий. Последние при этом обладают теми я е биохимическими свойствами, что и митохондрии, получаемые в 0,88 М растворе сахарозы, хотя они уяге не окрашиваются янусом зеленым В и имеют скорее шаровидную, а не удлиненную форму. При разделении путем дифференциального центрифугирования субклеточных фракций из гомогената в 0,25 М растворе сахарозы, полученного в гомогенизаторе Поттера — Эльвейема, удаление ядер и клеточных обломков, включая [c.130]

Хотя реакции свободного окисления идут и в цитозоле, и на мембранах различных субклеточных структур, средоточием их являются мембраны эндоплазматической сети клетки. Так как последние при гомогенизации клеток и фракционировании субклеточных частиц гомогената дают фракцию микросом, которая может быть получена в виде препарата, то сейчас активно изучаются организация и функции микросомальной дыхательной цепи. Ее первая особенность сводится к тому, что, несмотря на наличие ферментов цепи переноса электронов, ни в одном пункте этой цепи не происходит сопряжения с фосфорилированием АДФ. Вторая особенность заключается в своеобразии структуры и функциональной активности цитохромов 6 5 и Р-450), входящих в ее состав. В частности, цитохром Р-450 (Л/а 50000, гемопротеин, первичная структура более десятка его форм распшфрована) обладает множеством (сотни, а может быть, и тысячи) форм, возникающих в ответ на введение (или попадание) в организм того или иного класса ксенобиотиков, подобно тому, как антитела синтезируются в ответ на присутствие антигенов поэтому цитохром Р-450 считают своего рода мембранным иммуноглобулином . [c.417]

Еще в 1961 г. Полсон [648] применил гранулированный агаровый гель для фракционирования белков. Но этот метод не получил широкого распространения вследствие технических трудностей получения гранулированного геля и присутствия в агаре агаропектина. Через год Хьертен [407] применил гель агарозы для фракционирования макромолекул и субклеточных частиц. Но настоящим усовершенствованием этого метода явилось применение агарозы в виде сферических гранул [195, 406]. [c.142]

Из таблицы 13 видно, что размер молекул, способных проникнуть в матрицу, соответствует размеру пор, вычисленному теоретически Для 2%-ной агарозы верхним пределом исключения являются молекулы с молекулярным весом до 181 млн при условии, что они сферичны. Но одтл-мальная способность при фракционировании смеси макромолекул для этого типа агарозы лежит от 500 ООО до 150 млн. дальтон. Поэтому гранулированную 2—4%-ную агарозу можно применять для фракционирования нуклеи новых кислот, субклеточных частиц и вирусов. [c.143]

Применение хроматографии на агарозе- Хроматографию на агарозе применяют для фракционирования вирусов, субклеточных частиц и макромолекул в зависимости от их молекулярного веса. Как было описано выше, на сефадексах возможно фракционирование веществ с молекулярным весом до 8 10 дальтон. Использование агара и агарозы значительно расширило этот ряд до 150-10 дальтон 405, 648, 763], Агароза обладает превосходным разрешением для широкого ряда субстанций. Острые элюцион-ные профили, получаемые при гельфильтрации на колонке с агарозой, позволяют довольно точно определить молекулярный вес элюируемых веществ [c.146]

Ознакомившись достаточно подробно с используемой техникой, перейдем к рассмотрению основных методов ультрацентрифугирования, применяемых для очистки и фракционирования белков, нуклеиновых кислот и субклеточных органелл дифференциального, зонально-скоростного и равновесного (изопикни-ческого). Они будут рассмотрены в этом же порядке. Под частицами будем, как и прежде, понимать не только молекулярные агрегаты, но и макромолекулы. [c.199]

Для выделения субклеточных органелл можно применять неводные среды. Суспендирующая среда в этом случае представляет собой смесь легкого и тяжелогоЪрганических растворителей, например смесь эфира с хлороформом или бензола с четыреххлористым углеродом. Плотность среды можно изменять таким образом, чтобы при последующем центрифугировании исследуемые частицы либо всплывали на поверхность, либо осаждались. Неводное фракционирование применяют для выделения хлоропластов и лейкоцитов, а также гранул гемосидерина из селезенки. Недостатками этого [c.37]

Анализ распределения ферментов во фракционируемых тканях основан на двух общих принципах. Первый из них заключается в том, что все частицы данной субклеточной популяции содержат одинаковый набор ферментов. Второй предполагает, что каждый фермент локализован в каком-то определенном месте внутри клетки. Если бы это положение было верно, то ферменты могли бы выступать в роли маркеров для соответствующих органелл например, цито-хромоксидаза и моноаминооксидаза служили бы ферментами-маркерами митохондрий, кислые гидролазы — маркерами лизосом, каталаза — маркером пероксисом, а глюкозо-6-фосфатаза — маркером мембран микросом. Оказалось, однако, что некоторые ферменты, например малатдегидрогеназа, Р-глюкуронидаза, НАДФ Н-цитохром-с-редуктаза, локализованы более чем в одной фракции. Поэтому к выбору ферментов-маркеров субклеточных фракций в каждом конкретном случае следует подходить с большой осторожностью. Более того, отсутствие фермента-маркера еще не означает отсутствия соответствующих органелл. Вполне вероятно, что при фракционировании происходит потеря фермента органел-лами или он ингибируется или инактивируется поэтому для каждой фракции обычно определяют не менее двух ферментов-маркеров. [c.56]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология